一种辐射波段位于蓝绿光区的高度单色的电化学发光体系及构建方法

1.本发明涉及一种辐射波段位于蓝绿光区的高度单色的电化学发光体系及构建方法，属于电化学发光技术领域。


背景技术：

2.在罗氏的分子发光型电化学发光产品独家垄断电化学发光体外诊断应用的时代背景下，以纳米粒子为发光试剂的新型电化学发光体系构建始于2002年(science,2002,296,1293)，一直是电化学发光的热点研究领域。截止于目前，常规纳米粒子电化学发光辐射的最大发射波长通常大于500nm，且单色性较差，因此，在短波区(最大发射波长小于500nm)开发高度单色(半峰宽小于40nm)的电化学发光体系具有重要的学术与应用价值。
3.近期文献报道显示，钙钛矿类纳米材料能够在有机相介质中产生特征辐射波长为535nm、半峰宽为25nm的电化学发光(j.am.chem.soc.2017,139,8772)，6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶包被的au纳米团簇能够在水相介质中产生特征辐射波长为532nm、半峰宽为36nm的电化学发光，且其辐射能够基于形成氢键型刚性主客体材料的方式实现增强(angew.chem.int.edit.2019,58,6901)。但是，钙钛矿类纳米材料为离子型晶体，水相不稳定，而6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶包被的au纳米团簇亦无法进一步枝接生物分子，此两类试剂难以有效构建适用于生化分析的高度单色电化学发光体系。
4.经检索，目前尚无最大发射波长低于500nm、适于生化分析的高度单色的电化学发光体系的报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，尤其是目前尚无最大发射波长低于500nm、适于生化分析的高度单色的电化学发光体系的难题，本发明提供一种辐射波段位于蓝绿光区的高度单色的电化学发光体系及构建方法。
6.本发明的电化学发光体系以zn
2+
聚集诱导的水相稳定的纳米金簇为发光物质，水合肼为共反应剂，hepes溶液为缓冲液，能在蓝绿光区域实现高度单色的电化学发光辐射，半峰宽为36nm，最大发射波长为485nm。
7.本发明构建的辐射波段位于蓝绿光区域的高度单色电化学发光体系不但拓宽了纳米材料的电化学发光特征发射范围，而且水相稳定，易于标记生物分子，在生化分析与检测领域具有广阔的应用前景。
8.术语说明：
9.室温：本发明所述的室温具有常规含义，温度范围在25
±
5℃。
10.为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
11.一种辐射波段位于蓝绿光区域高度单色的电化学发光体系，采用zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，水合肼作为共反应剂，hepes作为缓冲溶液，组成高度单色的电化
学发光体系。
12.根据本发明优选的，hepes缓冲液的ph＝7.0-7.4，进一步优选的，hepes缓冲液的ph＝7.2-7.4，最为优选的，hepes缓冲液的ph＝7.4。
13.根据本发明优选的，电化学发光体系中，hepes缓冲液的摩尔浓度为5-50mm，进一步优选的，hepes缓冲液的摩尔浓度为5-20mm，最为优选的，hepes缓冲液的摩尔浓度为10mm。
14.根据本发明优选的，电化学发光体系中，水合肼的摩尔浓度为1-30mm，进一步优选的，水合肼的摩尔浓度为5-20mm，最优选的，水合肼的摩尔浓度为10mm。
15.根据本发明优选的，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的特征发射波长在485nm，半峰宽为25nm，紫外吸收特征峰在355nm和450nm，荧光寿命为31ns。
16.根据本发明优选的，电化学发光体系中，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的质量浓度为0.05-0.5mg/ml，进一步优选的，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的质量浓度为0.10-0.25mg/ml，最优选的，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的质量浓度为0.15mg/ml。
17.根据本发明优选的，所述的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇是按如下方法制备得到：
18.以氯金酸为金源，巯基丙酸为稳定剂，乙酸锌为聚集诱导体，进行反应，制备得到zn
2+
聚集诱导的纳米金簇；
19.优选的，氯金酸与巯基丙酸的摩尔比为1:32，氯金酸与乙酸锌的摩尔比为1:41；反应温度为室温，反应时间为6h；反应完成后，采用异丙醇洗涤纯化后，将产物溶于去离子水，得到zn
2+
聚集诱导的纳米金簇。
20.本发明优选的一个实施方案：
21.高度单色的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的制备方法，包括步骤如下：
22.(1)取35.5μl 100mg/ml haucl4·
3h2o，加入2.5ml去离子水；
23.(2)向步骤(1)中加入50μl巯基丙酸，搅拌15min；
24.(3)向步骤(2)中加入430μl1m氢氧化钠，调节ph至8.5；
25.(4)向步骤(3)中加入0.5ml 0.1m乙酸锌，室温搅拌反应6h，反应完成后，采用异丙醇洗涤纯化后，将产物溶于去离子水，得到zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的单分散溶液。
26.一种辐射波段位于蓝绿光区域高度单色的电化学发光体系的构建方法，步骤如下：
27.以hepes作为缓冲溶液，水合肼作为共反应剂，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，组成电化学发光体系，采用三电极体系与循环伏安扫描方法驱动该体系电化学发光辐射。
28.根据本发明优选的，所采用的电化学条件为：以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，对包含缓冲溶液、共反应剂和发光试剂的单分散溶液进行循环伏安扫描。
29.根据本发明优选的，执行循环伏安扫描时，扫描电压范围为0-1.6v，扫描圈数1-3圈，扫描速度为40-60mv/s。
30.本发明中采用zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，该发光试剂能够在含水合肼的hepes缓冲液中、经电位扫描驱动产生最大发射波长位于485nm的高度单色电化学发光辐射，半峰宽36nm。经过无数次实验验证，该ecl辐射仅能基于特定的共反应剂及缓冲液选
择性产生，所用缓冲溶液为hepes缓冲溶液，其它缓冲溶液无法产生高度单色的特征辐射；所用共反应剂为水合肼，其它共反应剂均无法产生高度单色的特征辐射。
31.本发明的技术特点及优点：
32.1、本发明的电化学发光体系采用zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，在蓝绿光区域实现了高度单色电化学发光。zn
2+
聚集诱导的纳米金簇水相稳定，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇/水合肼体系能够基于循环伏安扫描驱动方式在hepes缓冲液中产生最大发射波长为485nm的电化学发光，半峰宽为36纳米，有效拓宽了纳米材料的电化学发光特征发射范围，丰富了高度单色电化学发光体系的种类。
33.2、本发明的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇/水合肼体系具有高度单色的电化学发光辐射，最大辐射波长低于500nm，且水相稳定，不但有效规避了钙钛矿类高度单色电化学发光体系无法适用于水相体系的限制性，而且突破了现有金纳米簇需依赖于杂氮配体实施高度单色ecl的局限性。
34.3、本发明的辐射波段位于蓝绿光区域高度单色的电化学发光体系采用的发光试剂为zn
2+
聚集诱导的纳米金簇，具有足够的羧酸基团实施生物标记，适用于进一步研发高度单色的电化学发光生化分析技术。
附图说明
35.图1为实施例1制得的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的紫外吸收和光致发光图；横坐标为波长，纵坐标为吸光度/荧光强度。
36.图2为实施例1制得的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的荧光寿命图；横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。
37.图3为实施例1制得的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的透射电镜图。
38.图4为实施例1制得的的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的元素分布图；横坐标为能量，纵坐标为光子数。
39.图5为实施例1制得的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的红外光谱图；横坐标为波数，纵坐标为透过率。
40.图6为实施例1制得的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇放置2个月后的光致发光图；横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
41.图7为实施例1制得的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇放置4个月后的光致发光图；横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
42.图8为实施例1制得的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇放置6个月后的光致发光图；横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
43.图9为实施例2中的发光体系的循环伏安驱动的电化学发光强度-电位(时间)曲线图；发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
44.图10为实施例2中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
45.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
46.图11为实施例3中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
47.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、5mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
48.图12为实施例3中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
49.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、15mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
50.图13为实施例3中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
51.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、20mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
52.图14为实施例4中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
53.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、5mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
54.图15为实施例4中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
55.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、15mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
56.图16为实施例4中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
57.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、20mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
58.图17为实施例5中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
59.发光体系为0.10mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
60.图18为实施例5中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
61.发光体系为0.20mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
62.图19为实施例5中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
63.发光体系为0.25mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
64.图20为实施例6中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
65.发光体系为放置2个月后的0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐
标为电化学发光强度。
66.图21为实施例6中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
67.发光体系为放置4个月后的0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
68.图22为实施例6中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
69.发光体系为放置6个月后的0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
70.图23为对比例1中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
71.发光体系为10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
72.图24为对比例2中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
73.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝9.4的碳酸盐缓冲液；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
74.图25为对比例2中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
75.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的柠檬酸盐缓冲液；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
76.图26为对比例2中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
77.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的磷酸盐缓冲液；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
78.图27为对比例2中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
79.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的tris-hcl缓冲液；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
80.图28为对比例3中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
81.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm三丙胺、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
82.图29为对比例3中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
83.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm三乙胺、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
84.图30为对比例3中发光体系的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；
85.发光体系为0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm三乙醇胺、10mm ph＝7.4的hepes；电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光
+
聚集诱导的纳米金簇在放置4个月后的光致发光强度几乎不变。
107.放置6个月后的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的光致发光图如图8所示，由图8可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在放置6个月后的光致发光强度几乎不变。
108.实施例2
109.在蓝绿光区域产生高强度的高度单色的电化学发光体系的构建方法，步骤如下：
110.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，10mm ph＝7.4的hepes作为缓冲溶液，10mm水合肼作为共反应剂，0.15mg/ml实施例1制得的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，对包含hepes缓冲溶液、共反应剂和发光试剂的单分散溶液进行循环伏安扫描驱动。
111.采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正)得到的电化学发光强度-(电位)时间曲线如图9所示，如图9可以看出，本发明的电化学发光体系在10mm ph＝7.4的hepes中可在0.74v产生氧化-还原型电化学发光。
112.采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正)得到的电化学发光光谱图如图10所示，如图10可以看出，本发明的电化学发光体系在10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm。
113.实施例3
114.同实施例2所述的构建方法，不同之处在于：
115.将ph＝7.4的hepes缓冲溶液的浓度分别替换为：5mm，15mm，20mm。
116.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，不同浓度ph＝7.4的hepes作为缓冲溶液，10mm水合肼作为共反应剂，0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，对包含hepes缓冲溶液、共反应剂和发光试剂的单分散溶液进行电化学循环伏安驱动。
117.循环伏安法驱动，电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正；
118.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、5mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图11所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇/水合肼在5mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，电化学发光强度低于在10mm ph＝7.4的hepes缓冲溶液中对应的强度。
119.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、15mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图12所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇/水合肼在15mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度略低于在10mm ph＝7.4的hepes缓冲溶液中对应的强度。
120.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、20mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图13所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇/水合肼在20mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，但电化学发光强度低于在10mm ph＝7.4的hepes缓冲溶液中对应的强度。
121.通过实施例3可以看出，对比不同发光体系，10mm ph＝7.4的hepes缓冲溶液中对应的电化学发光强度最强。
122.实施例4
123.同实施例2所述的构建方法，不同之处在于：
124.将水合肼的浓度分别替换为：5mm，15mm，20mm。
125.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，10mm ph＝7.4的hepes作为缓冲溶液，不同浓度水合肼作为共反应剂，0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，对包含hepes缓冲溶液、共反应剂和发光试剂的单分散溶液进行电化学循环伏安驱动。
126.循环伏安法驱动，电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正；
127.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、5mm水合肼、15mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图14所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有5mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度低于在水合肼浓度为10mm时对应的强度。
128.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、15mm水合肼、15mm ph＝7.4的hepes发光体系的电化学发光光谱图如图15所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有15mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度低于在水合肼浓度为10mm时对应的强度。
129.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、20mm水合肼、15mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图16所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有20mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度低于在水合肼浓度为10mm时对应的强度。
130.通过实施例4可以看出，对比不同发光体系，水合肼浓度为10mm对应的电化学发光强度最强。
131.实施例5
132.同实施例2所述的构建方法，不同之处在于：
133.将zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的浓度分别替换为：0.10mg/ml，0.20mg/ml，0.25mg/ml。
134.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，10mm ph＝7.4的hepes作为缓冲溶液，10mm水合肼作为共反应剂，不同zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，对包含hepes缓冲溶液、共反应剂和发光试剂的单分散溶液进行电化学循环伏安驱动。
135.循环伏安法驱动，电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正；
136.0.10mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图17所示，如图可知，0.10mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度低于zn
2+
聚集诱导的纳米金簇为0.15mg/ml时对应的强度。
137.0.20mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes发光体
系得到的电化学发光光谱图如图18所示，如图可知，0.20mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度低于zn
2+
聚集诱导的纳米金簇为0.15mg/ml时对应的强度。
138.0.25mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图19所示，如图可知，0.25mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度低于zn
2+
聚集诱导的纳米金簇为0.15mg/ml时对应的强度。
139.通过实施例5可以看出，对比不同发光体系，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇浓度为0.15mg/ml对应的电化学发光强度最强。
140.实施例6
141.同实施例2所述的构建方法，不同之处在于：
142.将实施例1制得的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在4℃下分别放置2个月、4个月、6个月，以放置不同时间的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂。
143.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，10mm ph＝7.4的hepes为缓冲溶液，10mm水合肼为共反应剂，放置不同时间的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇浓度为0.15mg/ml，对包含hepes缓冲溶液、共反应剂和发光试剂的单分散溶液进行电化学循环伏安驱动。
144.循环伏安法驱动，电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正；
145.放置2个月后的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇/水合肼/hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图20所示，如图可知，放置2个月后的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度与实施例2基本保持一致。
146.放置4个月后的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇/水合肼/hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图21所示，如图可知，放置6个月后的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度与实施例2基本保持一致。
147.放置6个月后的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇/水合肼/hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图22所示，如图可知，放置6个月后的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中可产生最大发射波长位于485nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36nm，其电化学发光强度与实施例2基本保持一致。
148.通过实施例6可以看出，放置不同时长的zn
2+
聚集诱导的纳米金簇的电化学发光强度基本维持稳定，并且构建的辐射波段位于蓝绿光区域的高度单色电化学发光体系水相稳定。
149.对比例1
150.同实施例3所述的构建方法，不同之处在于：
151.将发光试剂zn
2+
聚集诱导的纳米金簇去除。
152.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，10mm ph＝7.4的hepes作为缓冲溶液，10mm水合肼作为共反应剂。采用循环伏安法驱动(电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正)得到的电化学发光光谱图如图23所示，如图可知，在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的hepes中不能产生电化学发光信号。
153.对比例2
154.同实施例3所述的构建方法，不同之处在于：
155.将hepes缓冲溶液分别替换为ph＝9.4的碳酸盐、ph＝7.4的醋酸盐、ph＝7.4的柠檬酸盐、ph＝7.4的磷酸盐、ph＝7.4的tris-hcl。
156.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，10mm不同缓冲溶液，10mm水合肼作为共反应剂，0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，对包含不同缓冲溶液、共反应剂和发光试剂的单分散溶液进行电化学循环伏安驱动。
157.循环伏安法驱动，电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正；
158.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝9.4的碳酸盐为缓冲溶液发光体系得到的电化学发光光谱图如图24所示，由图可以看出，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝9.4的碳酸盐中仅能产生微弱的电化学发光信号。
159.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的柠檬酸盐为缓冲溶液发光体系得到的电化学发光光谱图如图25所示，由图可以看出，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的柠檬酸盐中不能产生电化学发光信号。
160.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的磷酸盐为缓冲溶液发光体系得到的电化学发光光谱图如图26所示，由图可以看出，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的磷酸盐中不能产生电化学发光信号。
161.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm水合肼、10mm ph＝7.4的tris-hcl为缓冲溶液发光体系得到的电化学发光光谱图如图27所示，由图可以看出，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm水合肼的10mm ph＝7.4的tris-hcl中不能产生电化学发光信号。
162.对比例3
163.同实施例3所述的构建方法，不同之处在于：
164.将共反应剂分别替换为三丙胺、三乙胺、三乙醇胺、过氧化氢。
165.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，10mm ph＝7.4的hepes，10mm三丙胺、三乙胺、三乙醇胺或过氧化氢作为共反应剂，0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇作为发光试剂，对包含不同缓冲溶液、共反应剂和发光试剂的单分散溶液进行电化学循环伏安驱动。
166.循环伏安法驱动，电势窗口为0～1.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0v，初扫向正；
167.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm三丙胺、10mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图28所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm三丙胺的10mm ph＝7.4的hepes中不能产生电化学发光信号。
168.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm三乙胺、10mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图29所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm三
乙胺的10mm ph＝7.4的hepes中仅能产微弱的电化学发光信号。
169.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm三乙醇胺、10mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图30所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm三乙醇胺的10mm ph＝7.4的hepes中不能产生电化学发光信号。
170.0.15mg/ml zn
2+
聚集诱导的纳米金簇、10mm过氧化氢、10mm ph＝7.4的hepes发光体系得到的电化学发光光谱图如图31所示，如图可知，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇在含有10mm过氧化氢的10mm ph＝7.4的hepes中不能产生电化学发光信号。
171.综上：只有在包含特定共反应剂(水合肼)的hepes缓冲液中，zn
2+
聚集诱导的纳米金簇才可产生高度单色的电化学发光；三丙胺、三乙胺、三乙醇胺、过氧化氢均无法在蓝绿光区域产生高度单色的电化学发光。碳酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris-hcl也均无法在蓝绿光区域产生高度单色的电化学发光。