一种基于橙色碳点荧光法选择性检测食品中的有机磷农药

1.本发明属于生物传感器技术和食品质量检测领域，具体涉及一种橙色荧光碳点自组装于羟基氧化钴纳米片荧光复合材料(cds@coooh nfs)的制备方法，基于该复合物 (cds@coooh)对乙酰胆碱酯酶(ache)的控制反应，建立了一种可靠的、高灵敏度的有机磷农药(ops)荧光检测策略，并巧妙的构建了荧光检测体系与水凝胶试剂盒相结合的便携式平台，为使用智能手机进行有机磷农药现场监测提供了一个新视角。


背景技术：

2.有机磷农药(ops)对作物的生长和贮藏起着至关重要的作用。但有机磷农药即使在低浓度的条件下也会对人体健康构成巨大威胁，于是许多国家及地区颁布了限制有机磷农药最大残留量的法律法规，以确保食品安全，但仍有人违规滥用农药。因此，实现有机磷农药的有效检测对食品安全监测和农药中毒评估具有重要意义。包括色谱法、质谱法和联用法在内的多种方法已经被设计用于检测产品中有机磷农药残留，这些方法虽然能够准确地获取ops 浓度，但耗时长、仪器复杂、领域内可用性差，限制了它们在简单、快速和灵敏地检测有机磷农药方面的应用，特别是在紧急情况下的应用。
3.为解决这些缺陷，基于荧光的检测方法由于其操作简单、灵敏度高和选择性好而备受关注。碳点(cds)具有独特的光致发光特性、优良的生物相容性和优异的化学稳定性，是一种新型的荧光指示剂。与经典荧光纳米材料的特定前体不同，cds具有从天然产物到聚合物的多种碳源，有望作为理想的传感材料，并将目标物浓度转化为可识别的光电信号。此外，各种合成方法(水热法、微波辅助法、电化学策略等)均可用于cds的制备，为其提供了方便的合成条件。这些突出的特性使cds在传感、成像和催化等方面具有广阔的应用前景。
4.基于以上背景，我们设计了一个基于cds@coooh体系对ops进行高灵敏和高选择性的检测体系，并将该传感体系嵌入到琼脂糖水凝胶中，搭建便携式试剂盒，借助智能手机采集试剂盒的荧光响应，采用商业图像软件进行信号分析，此方法不需要复杂的仪器直接定量目标物，从而达到便携化检测的目的。


技术实现要素：

5.本发明采用溶剂热反应制备cds，通过静电作用将其锚定在coqoh nfs表面制备cds@coooh复合材料，以此开发了一种先进的能量转移效率较高的荧光传感平台，用于对氧磷的灵敏检测。cds作为荧光信号指示剂，在570nm处表现出橙色荧光发射，可以克服食物基质自身荧光影响，有效地阻断背景干扰。coooh nfs作为对cds荧光猝灭剂，具有较高的猝灭效率，显著提高了传感灵敏度。此外，结合ache对ops具有高效的识别能力，提高有机磷农药检测性能。将荧光测定系统与水凝胶试剂盒相结合，搭建便携式测试平台，用于对氧磷农药的现场监测，借助智能手机拍照功能，利用imagej软件将水凝胶试剂盒的图片信息转化为数字信息，实现了对氧磷农药的现场快速可视化灵敏检测，为食品安全现场精准监测提供依据。
6.本发明的目的可通过如下技术方案实现：
7.一种基于橙色发射碳点荧光法选择性检测食品样品中的有机磷农药，其步骤如下：
8.a、cds的合成：
9.将2.0g尿素和1.0g柠檬酸加入到10.0ml n，n二甲基甲酰胺溶液中，混合均匀。在 160℃条件下反应6h，用naoh水溶液(1.25mol l-1
)和hc1(5.0w t％)处理4次。沉淀用去离子水洗涤，4℃条件下保存备用。
10.b、coooh nfs的合成：
11.将cocl2(10mmol l-1
)、naoh(1.0mol l-1
)和naclo(0.9mol l-1
)按体积比100:30:5 混合，超声15min。沉淀物在6000r min-1
条件下离心5min，冷冻干燥得到coooh nfs。
12.c、对氧磷农药检测程序：
13.不同浓度的对氧磷和ache(4.0u l-1
)按体积比1:1混合均匀，在37℃下反应25min；然后将atch(10mm)相比于上述混合溶液以1：2的比例加入到上述溶液中，混合均匀，在37℃下孵育20min；然后将cds(10.0μgml-1
)和coooh(1.0μgml-1
)相比于上述混合溶液以1：1：比例加入到上述溶液中，然后用去离子水稀释至2.0ml；在510nm激发条件下采集荧光光谱进行检测。
14.d、实际样品中对氧磷农药的检测：
15.选取梨汁、苹果汁、橙汁等实物样本，对试剂盒的实际应用能力进行评价。以梨、苹果、橙子为原料，用榨汁机处理。加入对氧磷后的样品与10.0ml乙腈超声混合5min，在10000 rpm下离心2次，每次10min，收集上清液。将上清液浓缩至1.0ml，稀释10倍后，测定农药浓度。
16.e、水凝胶试剂盒的制备：
17.在100℃沸水中加入20mg琼脂糖，将琼脂糖溶液(50μl)冷却至40℃，随后加入cds 20μl，coooh nfs 30μl，混合均匀，将混合溶液滴到96孔微孔板上。测试体系储存在4℃以备进一步使用。农药检测用含农药(25μl)、ache(25μl)、atch(50μl)和tris-hci 缓冲液(ph 7.4、20μl)的反应液120μl添加到测试体系中。在365nm紫外光照射下，用带有cmos摄像头的智能手机采集水凝胶试剂盒的荧光颜色变化信息，用商用imagej软件进行分析，本传感方法成功应用于果汁中对氧磷农药的检测，并且具有较高的检测灵敏度。
18.本发明机理如下：
19.cds@coooh复合材料中cds在570nm处表现出橙色荧光发射可以克服食物基质自身荧光的影响，能够有效地阻断背景干扰，同时cds能够通过静电作用固定在coooh nfs表面，通过共振能量转移(fret)机制产生高效的荧光猝灭现象，显著提高了传感性能。通过引入乙酰胆碱酯酶(ache)催化硫代乙酰胆碱(atch)分解生成硫代胆碱(tch)，具有氧化能力的coooh可被硫代胆碱特异分解为co
2+
，抑制coooh nfs诱导的cds荧光猝灭。利用对氧磷抑制乙酰胆碱酯酶活性，减少硫代胆碱(tch)的生成，抑制coooh的分解，从而调控体系的荧光响应。因此，荧光输出与对氧磷的浓度呈现对应关系。将cds@coooh复合材料嵌入到琼脂糖水凝胶中，搭建便携式凝胶试剂盒，用智能手机记录试剂盒的荧光响应，用商业图像软件进行荧光信号分析。
20.本发明所开发的酶介导的荧光检测方法，不仅有效提升了有机磷农药检测的稳定
性，简化了传感过程，而且通过将传感体系嵌入到琼脂糖水凝胶中，借助智能手机采集和image j 软件分析颜色信息实现了对氧磷精确定量检测，为有机磷农药现场快速检测提供新的思路，同时也为食品安全现场精准监测提供依据。
附图说明
21.图1：实施例1所述，cds@coooh荧光复合材料的制备和表征。其中，(a)为橙色荧光碳点的tem图像；(b)为橙色荧光碳点的xrd图像；(c)为橙色荧光碳点的cds的荧光发射和吸收光谱图；(d)为coooh的透射电镜(tem)图；(e)为coooh的吸收光谱；(f)为coooh nfs的ftir图。
22.图2:实施例2所述，cds@coooh nfs基荧光体系机理的确定。其中，(a)为cds、coooh和cds@coooh的zeta电位图；(b)为coooh的吸收光谱图和cds的荧光光谱图；(c)为cds在猝灭剂coooh(0～1.5μg ml-1
)存在下的荧光光谱图；(d)为coooh的淬火效率图。
23.图3：实施例2所述，cds@coooh nfs基荧光体系机理的确定。其中，(a)为对氧磷检测原理示意图；(b)为基于cds@coooh荧光复合材料的系统可行性分析图；(c)为coooh和cds@coooh的吸收光谱图；(d)为不同浓度ache作用下cds@coooh体系的荧光光谱图；(e)为ache的校准曲线(0.025～50mu l-1
)。
24.图4：实施例3所述，对氧磷的灵敏专一性检测。其中，(a)为ph；(b)为温度；(c) 为时间对ache/atch/cds/coooh系统性能的影响(其中f和f0分别表示对氧磷存在和不存在时ache/atch/cds/coooh体系的荧光强度值)。
25.图5：实施例3所述，对氧磷的灵敏专一性检测。其中，(a)为ache/atch/cds/coooh体系在对氧磷作用下的荧光光谱(0～1000ng ml-1
)；(b)为ache/atch/cds/coooh体系与对氧磷的f/f0线性图；(c-d)为ache/atch/cds/coooh体系对对氧磷(5.0μg ml-1
)和干扰农药(25μg ml-1
)的选择性和抗干扰能力。
26.图6：实施例5所述，水凝胶试剂盒对氧磷的可视化检测。其中，(a)为对氧磷水凝胶试剂盒示意图；(b)彩色图像分成rgb通道；(c)利用imagej软件对归一化强度进行数字化处理；(d)对氧磷水凝胶试剂盒r通道线性图；(e)对氧磷水凝胶试剂盒hue值线性图。
具体实施方式
27.下面结合附图对本发明做进一步地说明。
28.实施例1：cds@coooh nfs荧光复合材料的合成与表征
29.首先在n，n-二甲基甲酰胺作用下，尿素和柠檬酸通过一步溶剂热反应合成了富氮cds。用透射电镜(tem)观察cds的形态特征，结果如图1a所示，cds具有平均直径为4.0nm 的球形结构。高分辨率透射电镜(hrtem)显示cds具有高晶体结构，其晶格条纹为0.21nm，与石墨的(100)面一致。x射线衍射(xrd)图显示27.5
°
处有一个尖锐的峰，与石墨的特征衍射峰(002)有关，证实cds的核心部分存在高度共轭的sp2结构域(图1b)。在510nm 的激发条件下，cds在570nm处显示出最大的荧光发射强度(图1c)，表明成功制备了橙色荧光cds。以次氯酸钠氧化co
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制备纳米猝灭剂coooh nfs，从tem图(图1d)可以看出，coooh nfs呈二维六边形，平均尺寸为80nm。进一步的hrtem观察表明，coooh nfs 的晶格间距为0.27nm，与(012)面的d间距匹配良好。coooh nfs的紫外-可见光谱在300-700 nm范围内具有较宽的吸
收光谱，其特征吸收峰在410nm左右(图1e)。傅里叶变换红外光谱(ftir)显示coooh nfs对羟基(-oh)、co-o键和co-0
2-配合物的特征吸收波数分别为3386、1628和578cm-1
(图1f)。上述表征表明了coooh nfs的成功制备。
30.实施例2：cds@coooh nfs荧光体系机理的确定
31.为了确定cds@coooh nfs荧光体系机理，我们进行了系统地电子和光谱测试。通过zeta 电位测量分析cds和coooh nfs的表面电荷(图2a)，其中带负电荷的cds(ζ＝-15.3mv) 可以通过静电作用固定于coooh nfs(ζ＝+8.7mv)表面，形成cds@coooh复合材料 (ζ＝-10.5mv)。通过测量cds存在条件下coooh nfs的紫外-可见吸收光谱，进一步验证成功的合成了复合材料，结果表明与游离coooh nfs相比，复合材料的特征吸收峰蓝移了 10nm(图1e)，同时coooh nfs的吸收光谱与cds的荧光发射光谱出现重叠(图2b)，coooh nfs可以作为能量受体吸收cds的能量，使荧光迅速猝灭。如图2c所示，随着cooohnfs(0-1.5ug ml-1
)的增加，cds的荧光逐渐降低。由于coooh nfs具有较大的表面积和强的能量吸收，在1.0ug ml-1
coooh nfs的条件下，对cds表现出87％的优秀猝灭效率 (图2d)。这些结果表明，coooh nfs可以通过fret效应轻松调控cds的荧光，为构建 cds检测系统提供了平台。
32.结合coooh对cds优秀的猝灭效果和ache控制的coooh分解，构建检测ops的荧光系统如图3a所示。在此过程中，ache可以催化水解atch生成tch特异触发coooh nfs 的分解，导致cds的荧光恢复(曲线e，图3b)。其中cds作为信号指示剂，coooh nfs 作为荧光猝灭剂和无机识别剂，coooh nfs被还原为co
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(公式1和公式2)。
[0033][0034]
如图3c所示，随着ache的引入，coooh nfs在410nm处的特征吸收峰下降，表明coooh nfs被破坏，证实了tch触发了coooh nfs分解。而对氧磷能够诱导乙酰胆碱酯酶丝氨酸残基发生磷酸化，进而阻断乙酰胆碱酯酶的催化活性，减少coooh nfs的分解，产生相应的荧光响应(曲线g，图3b)。此外，cds与atch(曲线c)、ache(曲线d)或 ops(曲线f)的混合也不能诱导传感系统的荧光变化，证实了对氧磷检测原理的可行性。
[0035]
在该传感平台中，ache对农药具有特异性识别能力，对底物(atch)具有较高的催化选择性。通过“关-开”模型，感知平台的荧光响应与ache的性能密切相关。因此，我们研究了cds@coooh体系对不同ache浓度的荧光响应。如图3d所示，在0.025-50mu l-1
浓度范围内随着ache浓度的增加，体系荧光强度逐渐增加。如图3e所示，荧光强度与ache浓度的对数值呈良好的线性关系，其线性方程为fl＝250.40+124.38log[ache]mu l-1 (r2＝0.9862)。因此，ache可以灵敏的控制coooh nfs的分解，特异性地调控荧光变化。
[0036]
实施例3：对氧磷的灵敏专一性检测
[0037]
本发明所设计的ache/atch/cds/coooh平台具有良好的性能，可作为监测ops(酶抑制剂)的候选平台，其中对氧磷是阻断乙酰胆碱酯酶催化活性的典型抑制剂，能够使体系荧光变化发生改变。本实施例系统地考虑了ph、反应温度和孵育时间等因素对检测灵敏度的影响，探讨所建立的平台达到最佳性能的条件，如图4a所示，ph对荧光比(f/f0)有显著影响，当ph从6.0上升到7.4时，体系的f/f0逐渐增加，当ph进一步增加到8.5时，体系的f/f0明
显降低，因此，选择ph 7.4tris-hci缓冲液进行对氧磷检测；同时反应温度对乙酰胆碱酯酶活性的影响在传感平台的制造中也起着至关重要的作用，其反应温度对f/f0的影响如图4b 所示，可知f/f0在37℃时达到最大值；由图4c可知在对氧磷存在条件下，乙酰胆碱酯酶的抑制作用立即发生，并在25min内结束，确定了对氧磷酯酶和乙酰胆碱酯酶的最佳孵育时间为25min。
[0038]
由于ache/atch/cds/coooh系统具有良好的性能，设计的平台用于检测ops。如图5a 所示，随着对氧磷浓度从0ng ml-1
上升到1000ng ml-1
，体系的荧光强度逐渐降低，通过建立标准曲线，得到农药的线性方程为f/f0＝0.9434-0.04364log[paraoxon](r
2＝
0.9951)(图5b)，其检出限为(lod)0.03ng ml-1
，此外，对氧磷在食品样品中的最大残留限为10ng ml-1
，显著高于高于该方法的检出限，表明该平台适用于对氧磷的检测，满足应用要求。
[0039]
专一性是平台实际应用的重要评价指标，严重影响结果的准确性。在此我们通过引入噻虫嗪、甲氰菊酯、氟虫腈、氯虫腈、噻唑啉、溴氰菊酯、乙腈和啶虫脒等常用农药，对该平台的选择性进行考察，发现即使使用比对氧磷浓度高五倍的浓度(5.0μg ml-1
)，对系统荧光强度产生影响仍然可以忽略，证明了该方法对对氧磷具有良好的选择性(图5c)。此外，通过加入对氧磷和共存物质的混合物，考察了ache/atch/cds/coooh平台的抗干扰能力，如图5d所示，即使在干扰物质存在的情况下，也能得到几乎相同的荧光响应，这充分地说明系统具有良好的抗干扰能力。该平台良好的性能可能归功于ache特有的识别能力和cooohnfs的无机识别能力。此外，作为信号指示剂的橙色发射cds可以克服食物基质自身荧光的影响。这些结果表明，ache/atch/cds/coooh平台具有较高的选择性和良好的抗干扰能力。
[0040]
实施例4：cds/coooh在食品样品中的应用
[0041]
为了验证该平台的实用性和可靠性，通过标准添加方法对实际样品中的对氧磷进行检测。将0.5、5.0和10ng ml-1
的对氧磷农药标准溶液加入到果汁样品(苹果，梨和橙)中，采用不能溶解水溶性还原剂的乙腈提取，成功阻断基质对反应结果的影响，如表1所示，在该体系中加样回收率在93.09％-116.57％之间和相对偏差(rsd)低于6.77，表明已建立的平台可用于实际样品中对对氧磷的检测。
[0042]
表1：应用本发明开发的方法检测实际样品中的对氧磷(n＝3)
[0043][0044][0045]
实施例5：水凝胶试剂盒对氧磷的可视化检测
[0046]
有充分的证据表明，粮食资源的保护迫切需要灵敏、便携的农药现场检测技术。其
中三维结构的琼脂糖水凝胶，具有成本低、易于储存等优点，被用作便携式平台的固定相，根据上述对氧磷的荧光反应结果，将cds和coooh nfs嵌入琼脂糖水凝胶中，构建对氧磷水凝胶试剂盒(图6a)，其中农药检测用25μl不同浓度的对氧磷抑制ache活性，滴入水凝胶检测试剂盒，为了识别水凝胶试剂盒的荧光色响应，通过智能手机内置摄像头采集光学图像。当对氧磷浓度从0.01增加到10μg ml-1
时，观察到荧光颜色梯度变化，为了避免独立观测者由于裸眼分辨率不同的问题导致检测结果的不准确，可以将彩色图像照片图像分解为rgb通道(图6b)，利用imagej软件对归一化强度进行数字化处理(图6c)，其中的hue和rgb 值表示对应于对氧磷浓度的荧光颜色识别，与hue值、b通道和g通道相比，所得到的r通道变化具有最优的对偶氧子检测性能，通过图像处理技术，水凝胶试剂盒的转换强度与对氧磷浓度在0.01～10μg ml-1
范围内呈良好的线性关系(r2＝0.973)(图6d)。以上结果表明，所制备的水凝胶试剂盒可在智能手机和商用软件的辅助下进行对氧磷的精确监测。