蜂王浆及其干粉中羟甲基糠醛含量的检测方法与流程

1.本发明属于食品质量控制领域，涉及蜂王浆及其干粉中新鲜度指标
‑‑
羟甲基糠醛的检测方法。


背景技术：

2.蜂王浆(royal jelly)，是蜜蜂巢中培育幼虫的青年工蜂咽头腺的分泌物，是供给将要变成蜂王的幼虫的食物，也是蜂王终生的食物。经国内外多年科研和医学临床实践证明，蜂王浆对人类医疗、保健等具有奇特的功效。
3.蜂王浆含有62-67％的水分，14-16％的蛋白质，10-15％的糖类，2-9％的脂类，矿物质0.6-2％，还有微量的维生素。在生产实践中，蜂王浆如果贮存不当，会产生褐变、因蛋白质聚集凝固而变粘稠、受微生物污染而变酸、变臭和产生气泡，严重影响蜂王浆的品质。
4.2008年申请的专利公告号cn101363828b，提出了蜂王浆中5-羟甲基-2-糠醛的含量小于或等于90μg/kg时属于新鲜等级。该新鲜度指标的提出，一定程度上激发了企业生产高品质蜂王浆的积极性。但是我们按该专利方法进行了操作，因为样品进行了20倍的稀释，导致方法检测限降低，经过测定，该方法检测限为0.3mg/kg，不能满足蜂王浆新鲜度质量控制的要求。
5.羟甲基糠醛是美拉德反应的重要中间产物，在酸性条件下，己糖脱水，或是氨基酸与羰基化合物之间反应形成。期刊《光谱学与光谱分析,2009,29(12):3236-3240》中指出蜂王浆中羟甲基糠醛含量在150μg/kg以下，可以认为蜂王浆是新鲜的。
6.现行文献检测方法中，蜂王浆中羟甲基糠醛的检测限为300μg/kg，定量限为1mg/kg，然而，在我们的研究中发现，2019年4℃下贮存至今的蜂王浆，其羟甲基糠醛含量仅为91μg/kg，所以有必要进一步研究蜂王浆中的羟甲基糠醛含量的测定方法。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种蜂王浆及其干粉中羟甲基糠醛含量的检测方法。该方法具有操作简单、快速、准确、灵敏的特点，仪器普通易得，便于方法的推广，方法检测限达到6μg/kg，定量限为20μg/kg，实用性强，为蜂王浆新鲜度指标的确定提供依据。
8.为实现发明目的，本发明采取如下的技术方案：
9.蜂王浆及其干粉中羟甲基糠醛含量的检测方法，采用高效液相色谱法，用外标法定量，包括如下步骤：
10.1)确定色谱条件：
11.色谱柱填充剂：十八烷基键合硅胶；
12.流动相：流动相a，甲醇-0.4％磷酸溶液，体积比为0-10:90～100；；流动相b，甲醇；检测波长：285nm；柱温：35℃；
13.2)供试品溶液的制备：
14.称取蜂王浆样品或蜂王浆干粉样品，溶于氨水溶液，用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层蒸发至干，加入甲醇溶液，过滤膜，得到每1ml含1.00g样品的供试品溶液；
15.3)空白样品标准溶液的制备：
16.称取空白样品5份，加入羟甲基糠醛标准工作溶液，得到空白样品标准溶液的浓度为20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l；
17.4)测定：
18.分别精密吸取空白样品标准溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，以空白样品标准溶液浓度为横坐标，以羟甲基糠醛峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用外标法定量。
19.进一步地，所述流动相a，甲醇-0.4％磷酸溶液，体积比为6:94。
20.进一步地，所述碱性溶液选自氨水，碳酸盐水溶液、氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液，使得样品溶液的ph＝7-8。
21.进一步地，所述蜂王浆及其干粉中羟甲基糠醛含量的检测方法的检测限为3-6μg/kg，定量限为10-20μg/kg。
22.具体地说，蜂王浆及其干粉中羟甲基糠醛含量的检测方法，采用高效液相色谱法，用外标法定量，包括如下步骤：
23.1)确定色谱条件：
24.色谱柱填充剂：十八烷基键合硅胶；
25.流动相：流动相a，甲醇-0.4％磷酸溶液，体积比为6:94；流动相b，甲醇；检测波长：285nm；柱温：35℃；
26.2)供试品溶液的制备：
27.称取蜂王浆样品1.00g或蜂王浆干粉样品0.50g，精确至
±
0.001g，于15ml塑料离心管中，加入1.5ml水，蜂王浆样品中加入1.5ml体积浓度为3％氨水溶液，蜂王浆干粉样品中加入2.0ml体积浓度为3％氨水溶液，充分溶解至无肉眼可见蜂王浆颗粒，加入8ml乙酸乙酯，手动振荡提取1min，4500转/分的转速离心分离5min；吸取全部乙酸乙酯层于50ml鸡心瓶中，40℃水浴旋转蒸发至干，向鸡心瓶中加入1ml提浓度为6％甲醇溶液，超声溶解残渣，样液过0.22μm滤膜，得到每1ml含1.00g样品的供试品溶液；
28.3)空白样品标准溶液的制备：
29.称取5份空白样品各1.00g，精确至
±
0.001g，于15ml塑料离心管中，分别加入0.20ml，0.50ml的0.1mg/l羟甲基糠醛标准工作溶液，0.10ml，0.20ml，0.50ml的1mg/l羟甲基糠醛标准工作溶液，再分别加入1.5ml水，加入1.5ml体积浓度为3％氨水溶液，充分溶解至无肉眼可见蜂王浆颗粒，加入8ml乙酸乙酯，手动振荡提取1min，4500转/分的转速离心分离5min，吸取全部乙酸乙酯层于50ml鸡心瓶中，40℃水浴旋转蒸发至干，向鸡心瓶中加入1ml6％甲醇溶液，超声溶解残渣，样液过0.22μm滤膜，得到浓度为20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l的系列空白样品标准溶液；
30.4)测定：
31.分别精密吸取5份系列空白样品标准溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，以空白样品标准浓度为横坐标，以羟甲基糠醛峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用外标法进行定量。
32.为了验证测定羟甲基糠醛含量方法的稳定性、准确性、专属性及系统适用性，对方法进行了方法学验证试验。
33.一、蜂王浆中羟甲基糠醛的提取
34.现行羟甲基糠醛测定方法中，关于羟甲基糠醛的提取方法主要见表1.
35.表1.不同样品中羟甲基糠醛的提取方法
[0036][0037][0038]
从上表1可知，对于蛋白质含量低、颜色浅、可溶解物含量小的样品，文献多采取直接过滤进样的方法，对于颜色深、可溶解物含量大的样品，采用了乙酸乙酯提取和c18固相萃取小柱进行净化，对于蛋白质含量高的，采用亚铁氰化钾/乙酸锌沉淀蛋白的方法对样品进行净化。
[0039]
蜂王浆和蜂王浆干粉中，蛋白质的含量高达15％和39％，还有3％和10％的脂肪酸，以及微量的花粉色素，需要将其去除。因此，我们采用亚铁氰化钾/乙酸锌沉淀蛋白的方法对样品进行净化，发现羟甲基糠醛可以被完全提取，但是，因为样品进行了20倍的稀释，
导致方法检测限降低，经过测定，该方法检测限为0.3mg/kg，不能满足蜂王浆新鲜度质量控制的要求。
[0040]
二、样品ph对羟甲基糠醛提取的影响
[0041]
将样品用水溶解，再用有机溶剂提取，以期对样品中的羟甲基糠醛提取后进行浓缩，从而提高方法的检测限。在实践中，我们发现，该方法对羟甲基糠醛的绝对提取率仅为20％。可能是由于蜂王浆中的蛋白质影响了提取效率。
[0042]
蜂王浆可溶于碱性溶液中，考虑将蛋白质溶于碱性溶液，再用乙酸乙酯提取蜂王浆中的羟甲基糠醛。我们考察了不同浓度的碱性溶液条件下，乙酸乙酯对蜂王浆中羟甲基糠醛的提取效率，结果见表2。
[0043]
表2.不同碱性溶液浓度下羟甲基糠醛的提取效率
[0044][0045]
从表2可知，当ph呈中性时，乙酸乙酯对蜂王浆中羟甲基糠醛的提取效率最高。这可以认为蜂王浆中的蛋白质被氨水溶解后，保证了乙酸乙酯与羟甲基糠醛充分混合，样液呈细腻的奶状，提高了乙酸乙酯与样液的接触面积，从而提高了提取效率。未加氨水的样液可见明显的絮状蛋白质，乙酸乙酸与羟甲基糠醛不能充分混合，从而影响了提取。当ph呈较高的碱性时，提取效率不如中性样液，这可能此时，羟甲基糠醛与样液中的水、糖类、蛋白质结合更加牢固，在乙酸乙酯中的分配系数变小，影响了提取效率。因此，选择用1.5ml水和1.5ml3％氨水溶解蜂王浆样品，用1.5ml水和2.0ml3％氨水溶解蜂王浆干粉样品。不同ph条件下，1、ph＝3.8，2、ph＝7.7，3、ph＝9.6,4、ph＝7.7蜂王浆添加100μg/kg羟甲基糠醛，乙酸乙酯提取蜂王浆中羟甲基糠醛色谱图，见图1。
[0046]
三、溶剂对蜂王浆中羟甲基糠醛提取的影响
[0047]
羟甲基糠醛易溶于水、乙腈、丙酮、醇类、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、苯、乙醚和氯仿等溶剂。由于醇、乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺可以溶解于水，在提取时同时提取了蜂王浆中的糖类，蒸干后残渣的量较多，需要进一步净化，故不宜选用。乙醚是易制毒化学品，采购及化学品管理不便，苯与氯仿具有一定的毒性，故选择乙酸乙酯作为提取溶剂。
[0048]
蜂王浆样品加水及氨水后，总体积约4.5ml，经过试验，当乙酸乙酯的量为4ml时，样液容易发生乳化现象，当乙酸乙酯的量为8ml时，样液不会发生乳化现象，样品中羟甲基糠醛绝对提取率在60％以上，当乙酸乙酯的量为12ml时，样液不会发生乳化现象，样品中羟甲基糠醛绝对提取率在75％以上。考虑到试剂用量、检测灵敏度，8ml乙酸乙酯的用量即可满足要求。故选择乙酸乙酯的用量为8ml。
[0049]
四、流动相的选择
[0050]
我们采用甲醇：0.4％磷酸为10：90，8：92和6：94为流动相，进行色谱分离试验。当甲醇：0.4％磷酸为10：90时，羟甲基糠醛色谱峰前有一个干扰峰，当甲醇：0.4％磷酸＝8：92时，羟甲基糠醛色谱峰后有一个干扰峰，虽然2种比例均可实现与干扰峰的完全分离，但是杂质峰与羟甲基糠醛色谱峰靠得相对较近，当样品中羟甲基糠醛含量较高时，不能保证所有样品都能完全分离，当甲醇：0.4％磷酸为6：94时，羟甲基糠醛色谱峰附近无杂质峰干扰，但是羟甲基糠醛色谱峰的保留时间较长，为保证检测效率，羟甲基糠醛色谱峰保留时间后采用100％甲醇洗柱3min，再以甲醇：0.4％磷酸为6：94稳定色谱柱8min，总时长为23min，流动相洗脱条件见表3，经过流动相优化后的色谱图，见图2。其中1、空白样品中添加100μg/kg羟甲基糠醛，2、空白样品，
[0051]
表3.流动相梯度洗脱条件
[0052][0053]
四、方法的线性范围、回收率、精密度和检测限
[0054]
分析方法
[0055]
4.1供试品溶液的制备
[0056]
称取蜂王浆样品1.00g或蜂王浆干粉样品0.50g(精确到
±
0.001g)于15ml塑料离心管中，加入1.5ml水，蜂王浆样品中加入1.5ml3％氨水溶液，蜂王浆干粉样品中加入2.0ml3％氨水溶液，充分溶解至无肉眼可见蜂王浆颗粒，加入8ml乙酸乙酯，手动振荡提取1min，4500转/分的转速离心分离5min。吸取全部乙酸乙酯层于50ml鸡心瓶中，40℃水浴旋转蒸发至干，向鸡心瓶中加入1ml6％甲醇溶液，超声溶解残渣，样液过0.22μm滤膜，得到供试品溶液。
[0057]
4.2空白样品标准溶液的制备
[0058]
称取5份空白样品各1.00g，精确至
±
0.001g，于15ml塑料离心管中，分别加入0.20ml，0.50ml的0.1mg/l羟甲基糠醛标准工作溶液，0.10ml，0.20ml，0.50ml的1mg/l羟甲基糠醛标准工作溶液，从4.1“加入1.5ml水”起依法操作，得到空白样品标准作溶液。相当于标准溶液系列浓度为20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l。
[0059]
4.3液相色谱参考条件
[0060]
色谱柱：c18填料色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；或等效色谱柱。
[0061]
流动相：流动相a，甲醇+0.4％磷酸溶液＝6+94；流动相b，甲醇。梯度洗脱条件见表3。
[0062]
流速：见表3。
[0063]
柱温：35℃。
[0064]
检测波长：285nm。
[0065]
进样量：20μl。
[0066]
4.4测定
[0067]
用空白样品标准溶液(4.2)、供试品溶液(4.1)分别进样，以空白样品标准溶液浓度为横坐标，以羟甲基糠醛峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用外标法进行定量。空白样品标准溶液及供试品溶液中羟甲基糠醛的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
[0068]
按分析方法对空白基质样品和样品进行处理和测定，以羟甲基糠醛峰面积对质量浓度(x，μg/kg)绘制工作曲线。结果如表4所示，羟甲基糠醛在20μg/kg～500μg/kg范围内线性良好，相关系数r2＝0.9983，满足定量分析要求。此方法的检测限和定量限分别为6μg/kg和20μg/kg，回收率在82％-106％(n＝3)之间，精密度在4.6％-8.0％(n＝3)之间，。
[0069]
当样品量、水、氨水、乙酸乙酯用量加倍，提取液浓缩后，用1ml甲醇溶液溶解，进行分析，此时的检测限可以提高到3ug/kg，定量限提高至10ug/kg
[0070]
表4.羟甲基糠醛的线性范围、回归方程、相关系数和检测限
[0071][0072]
在空白蜂王浆样品中分别添加20μg/kg、100μg/kg、500μg/kg的羟甲基糠醛标准溶液，按照分析方法处理后做回收率实验，每个添加水平重复测定3次。结果如表5所示，添加回收率分别为94.8％、96.7％和102.9％，相对标准偏差分别为5.3％、4.2％和2.9％。
[0073]
表5.空白蜂王浆中羟甲基糠醛的加标回收率和精密度
[0074][0075]
本发明关于蜂王浆及其干粉中的羟甲基糠醛含量测定方法，用水和3％氨水溶解稀释样品，经乙酸乙酯提取羟甲基糠醛，运用高效液相色谱仪进行分析，用外标法定量。该方法检测限6μg/kg，定量限20μg/kg，回收率在82％-106％(n＝3)之间，精密度在4.6％-8.0％(n＝3)之间，可以满足对蜂王浆和蜂王浆干粉新鲜度的判定要求。
[0076]
蜂王浆干粉是蜂王浆脱水后的产品，其羟甲基糠醛含量远比蜂王浆高，可以预见，用羟甲基糠醛含量大小来判定蜂王浆干粉的新鲜度比蜂王浆更具有意义。
附图说明
[0077]
图1是不同ph条件下，乙酸乙酯提取蜂王浆中羟甲基糠醛色谱图；
[0078]
图2是流动相优化后的样品中羟甲基糠醛色谱图。
具体实施方式
[0079]
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
[0080]
实施例1
[0081]
蜂王浆及其干粉中羟甲基糠醛含量的检测方法
[0082]
仪器与试剂
[0083]
岛津lc-20a高效液相色谱仪带lc-20avp紫外检测器；sartorius bs224s电子分析天平：感量0.0001g；昆山市超声仪器有限公司kq3200e超声波清洗器；安徽中科中佳科学仪器有限公司sc-3612台式高速离心机；标准品：羟甲基糠醛标准品，cas：67-47-0，纯度大于99％。磷酸：85％，优级纯；甲醇，液相色谱纯；氨水，28-30％；乙酸乙酯均为分析纯；水，符合gb/t 6682一级水。滤膜，尼龙66，0.22μm。
[0084]
3％氨水溶液：吸取3.0ml氨水用水定容至100ml。
[0085]
6％甲醇溶液：吸取6.0ml甲醇用水定容至100ml。
[0086]
0.4％磷酸溶液：吸取4.0ml磷酸用水定容至1000ml。
[0087]
羟甲基糠醛标准贮备液：称取羟甲基糠醛标准品20mg，加甲醇定容至20ml配成1.0mg/ml的羟甲基糠醛贮备液。-18度保存24个月。
[0088]
羟甲基糠醛标准中间液：吸取0.1ml羟甲基糠醛贮备液，用水定容至10ml，配成10mg/l羟甲基糠醛标准中间液,-18度保存12个月。
[0089]
羟甲基糠醛标准工作溶液ⅰ：吸取1.0ml羟甲基糠醛标准中间液，用水定容至10ml，配成1mg/l羟甲基糠醛标准工作溶液ⅰ,-18度保存12个月。
[0090]
羟甲基糠醛标准工作溶液ⅱ：吸取1.0ml羟甲基糠醛标准工作溶液ⅰ，用水定容至10ml，配成0.1mg/l羟甲基糠醛标准工作溶液ⅱ,-18度保存12个月。
[0091]
蜂王浆和蜂王浆干粉样品由杭州碧于天保健品有限公司提供。
[0092]
1)确定色谱条件：
[0093]
色谱柱填充剂：十八烷基键合硅胶；
[0094]
流动相：流动相a，甲醇-0.4％磷酸溶液，体积比为6:94；流动相b，甲醇；检测波长：285nm；柱温：35℃；
[0095]
2)供试品溶液的制备：
[0096]
称取蜂王浆样品1.00g或蜂王浆干粉样品0.50g，精确至
±
0.001g，于15ml塑料离心管中，加入1.5ml水，蜂王浆样品中加入1.5ml体积浓度为3％氨水溶液，蜂王浆干粉样品中加入2.0ml体积浓度为3％氨水溶液，充分溶解至无肉眼可见蜂王浆颗粒，加入8ml乙酸乙酯，手动振荡提取1min，4500转/分的转速离心分离5min；吸取全部乙酸乙酯层于50ml鸡心瓶中，40℃水浴旋转蒸发至干，向鸡心瓶中加入1ml提浓度为6％甲醇溶液，超声溶解残渣，样液过0.22μm滤膜，得到每1ml含1.00g的供试品溶液；
[0097]
3)空白样品标准溶液的制备：
[0098]
称取5份空白样品各1.00g，精确至
±
0.001g，于15ml塑料离心管中，分别加入0.20ml，0.50ml的羟甲基糠醛标准工作溶液ⅱ，0.10ml，0.20ml，0.50ml的羟甲基糠醛标准工作溶液ⅰ，再分别加入1.5ml水，加入1.5ml体积浓度为3％氨水溶液，充分溶解至无肉眼可见蜂王浆颗粒，加入8ml乙酸乙酯，手动振荡提取1min，4500转/分的转速离心分离5min。吸取全部乙酸乙酯层于50ml鸡心瓶中，40℃水浴旋转蒸发至干，向鸡心瓶中加入1ml6％甲醇
溶液，超声溶解残渣，样液过0.22μm滤膜，得到浓度为20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l的对照品溶液；
[0099]
4)测定：
[0100]
分别精密吸取5份对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，以对照品溶液浓度为横坐标，以羟甲基糠醛峰面积为纵坐标，绘制对照品溶液曲线，用对照品溶液曲线对样品进行定量。
[0101]
按实施例方法对11个蜂王浆样品进行测定，结果见表6。
[0102]
表6.蜂王浆和蜂王浆干粉样品测定结果
[0103][0104]
从实际样品的检测情况看，2022年的新浆在-18℃保存时，羟甲基糠醛含量在12μg/kg以下，2021年的蜂王浆在-18℃保存条件下，羟甲基糠醛含量在33μg/kg以下，而在4℃保存条件下的蜂王浆，羟甲基糠醛含量在91-280μg/kg之间。说明蜂王浆中羟甲基糠醛含量确实与贮存的温度与时间有相关性。
[0105]
按实施例1的方法，氨水可用碳酸盐水溶液、氢氧化钠水溶液或氢氧化钙水溶液代替，只要使得样品溶液的ph＝7-8就可以，
[0106]
实施例2
[0107]
按实施例1的方法，只是流动相a，为0.4％磷酸溶液。
[0108]
实施例3
[0109]
按实施例1的方法，只是流动相a，甲醇-0.4％磷酸溶液，提交比为10:90。
[0110]
实施例4
[0111]
按实施例1的方法，只是流动相a，甲醇-0.4％磷酸溶液，提交比为2:98。
[0112]
此外，需要说明的是，凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，如：依照本发明的供试品溶液的制备方法，得到的供试品溶液采用其他仪器进行糠醛类含量的定性或者定量分析；改变称样量、改变氨水和乙酸乙酯的体积等等，均包括于本发明专利的保护范围内。