1.本发明涉及农产品中农药残留的检测方法，尤其涉及一种超高效合相色谱法结合多糖衍生物手性固定相快速测定梨及其制品中甲氰菊酯对映体残留的方法。
背景技术：
：：2.甲氰菊酯（fenpropathrin），化学名称为α-氰基-3-苯氧基苄基-2,2,3,3-四甲基环丙烷酸酯，是一种重要的拟除虫菊酯类广谱性杀虫杀螨剂，毒性中等，常被广泛用于荔枝、苹果、梨、西瓜等水果的病害防治，其大量的使用对食品和环境污染问题也引起人们的广泛重视。甲氰菊酯的化学结构中存在两个对映体，分别为(-)-甲氰菊酯和(+)-甲氰菊酯[1-3]，两种对映体的结构式如图1所示。甲氰菊酯两个对映体之间杀虫活性和降解速度差异较大，（+）-甲氰菊酯的杀虫活性高于（-）-甲氰菊酯，且降解速度更快[1]。在农业生产过程中，若只使用杀虫活性高且降解速度快的（+）-甲氰菊酯，将会减少农药使用量，更有利于保护生态环境，而目前生产和使用的甲氰菊酯农药仍然是外消旋体农药。gb2763-2021[4]只规定了该类农药在常见水果梨中的甲氰菊酯外消旋体的残留限量5mg/kg，并未规定其单一对映体的残留限量。介于不同对映体的巨大活性差异特性，有必要开发一种能精准测定梨及其制品中甲氰菊酯对映体残留量的分析方法。[0003]目前，气相色谱法(gc)[5,6]、毛细管电泳色谱法（cec）[7,8]、气相色谱-质谱法（gc-ms）[9,10]、液相色谱-串联质谱法（lc-ms/ms）[11-13]、高效液相色谱法(hplc)[14-16]等方法被广泛应用于分离手性化合物。其中gc和gc-ms分离效果好，灵敏度高，但主要分析热稳定性好，低沸点化合物；cec分离的色谱峰形好，但耗时且效率低；lc-ms/ms具有高准确性，但仪器价格昂贵；hplc分离度好，但有机试剂消耗量大。因此，开发一种快速高效的检测方法具有广泛的应用前景。超高效合相色谱（upc2）以超临界状态二氧化碳为主要流动相，具备比传统有机流动相更快的传质速率和更高的分离效率等优点[17]，已成功的应用于三唑类农药[18,19]、左旋肉碱减肥药[20,21]、兴奋剂兽药[22,23]等手性化合物的分析，但还未见其在甲氰菊酯对映体的分离及残留测定分析中的报道。技术实现要素：[0004]为了解决上述的技术问题，本发明的目的是建立了超高效合相色谱法结合多糖衍生物手性固定相快速分离和测定梨及其制品中甲氰菊酯对映体残留的分析方法。该方法操作便捷、分离效率高、绿色环保，为检测梨及其制品中其他手性农药对映体的残留提供了新的思路。[0005]为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：一种快速测定梨及其制品中甲氰菊酯对映体残留的方法，甲氰菊酯的两个对映体分别为(-)-甲氰菊酯和(+)-甲氰菊酯；其特征在于，该方法包括以下的步骤：1）样品提取称取5g，试样精确至0.01g，至50ml具塞塑料离心管中，加入20ml乙酸乙酯，再加入3.0g氯化钠，涡旋混合2min后均质提取，4000r/min离心5min后，转移上清液至浓缩瓶中；向下层残渣中加入20ml乙酸乙酯，重复提取1次，合并两次乙酸乙酯提取液，用旋转蒸发仪浓缩至近干，加入5ml甲醇溶解，待净化；2）净化将上述待净化液转移至活化好的c18柱中，上样后，随即收集全部流出液，于40℃水浴中氮吹干至近干，加入1ml正庚烷，涡旋1min溶解残渣，定容液经0.22μm滤膜过滤，待测；3）分析条件acquitytrefoilamy1色谱柱，150mm×3.0mm，2.5µm，填料为直链淀粉-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）；检测波长230nm；系统背压17.2mpa；柱温31℃；梯度洗脱流动相a为co2，b为0.5%体积分数氨水的甲醇溶液；流速1.5ml/min；进样量5.0µl；梯度洗脱条件：0-0.2min时，b的体积分为3%b；0.2-0.3min时，b的体积分为3%-10%b；0.3-2min时，b的体积分为10%b；2-2.5min时，b的体积分为10%-3%b；2.5-3min时，b的体积分为3%b。[0006]作为优选，标准溶液液的配制方法如下：分别准确称取（-）-甲氰菊酯、（+）-甲氰菊酯标准品10mg置于10ml容量瓶中，用异丙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成1.0g/l的对映体标准储备液。[0007]作为优选，甲氰菊酯对映体的混合标准工作溶液由上述两个标准储备溶液用正庚烷逐级稀释制得，浓度分别为1.0、2.0、4.0、10.0、20.0mg/l。[0008]作为优选，甲氰菊酯对映体在1.0-20.0mg/l的线性范围内呈良好的线性关系，测定下限均为0.2mg/kg，在阴性样品上进行3个浓度水平的加标回收试验，2个目标化合物的回收率为81.4%-106%，测定值的相对标准偏差为4.1%-7.2%。[0009]作为优选，(-)-甲氰菊酯的线性方程为y=6.64×103x+4.06×102，相关系数0.9999，测定下限0.2mg/kg；(+)-甲氰菊酯的线性方程为y=5.62×103x+2.24×102，相关系数0.9998，测定下限0.2mg/kg。[0010]本发明由于采用了上述的技术方案，使用乙酸乙酯对样品进行提取，通过c18柱对样品进行净化后，采用acquitytrefoilamy1手性色谱柱分离，以不同体积比的含0.5%（体积分数）氨水的甲醇溶液-超临界二氧化碳为流动相梯度洗脱，外标法定量，测定下限均为0.2mg/kg，加标回收率范围为81.4%-106%，rsd为4.1%-7.2%。采用建立的方法对实际样品进行了检测，检出量为0.22-0.25mg/kg。该方法操作便捷、分离效率高、绿色环保，为检测梨及其制品中其他手性农药对映体的残留提供了新的思路和技术保障。附图说明[0011]图1为甲氰菊酯对映体的结构式。[0012]图2为不同助溶剂对甲氰菊酯对映体分离效果的影响图。[0013]图3为不同梯度条件对甲氰菊酯对映体分离效果的影响图。[0014]图4为不同色谱柱温度对甲氰菊酯对映体分离效果的影响图。[0015]图5为不同定容试剂对甲氰菊酯对映体分离效果的影响图。[0016]图6为（-）甲氰菊酯和（+）-甲氰菊酯标准溶液60天内的稳定性考察（正庚烷溶液）图。[0017]图7为不同固相萃取柱对甲氰菊酯对映体净化效果的影响图。[0018]图8为阳性梨泥样品的色谱图。具体实施方式[0019]实验部分1.1仪器、材料与试剂超高效合相色谱仪（美国waters公司，配有pda检测器）；multifugex1r台式冷冻离心机（美国thermo公司）；n-1210bv旋转蒸发仪（日本东京理化公司）；jj500电子天平（美国双杰天平公司）；ae260电子天平（瑞士mettler公司）；wh-861涡旋混匀器（太仓市华利达实验设备有限公司）；synergy185超纯水仪（美国millipore公司）；n-evap-24氮吹仪（美国organomation公司）；supelco24位固相萃取仪（美国merck公司）；微孔过滤膜（0.22ꢀµm，有机相）；acquitytrefoilamy1色谱柱（美国waters公司）。[0020]正庚烷、异丙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙腈（色谱纯，德国merck公司）；氯化钠（分析纯，上海试四赫维化工有限公司）；c18柱（cnw，500mg，3ml）；弗罗里硅土（florisil）柱（cnw，1g，6ml）；其余试剂为分析纯；试验用水为超纯水。[0021]标准品：甲氰菊酯对映体：(-)-甲氰菊酯、(+)-甲氰菊酯（纯度≥97%，上海勤路生物技术有限公司）。[0022]标准溶液液的配制分别准确称取（-）-甲氰菊酯、（+）-甲氰菊酯标准品10mg置于10ml容量瓶中，用异丙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成1.0g/l的对映体标准储备液。[0023]甲氰菊酯对映体的混合标准工作溶液由上述两个标准储备溶液用正庚烷逐级稀释制得，浓度分别为1.0、2.0、4.0、10.0、20.0mg/l。[0024]样品前处理1.3.1样品提取称取5g（精确至0.01g）试样至50ml具塞塑料离心管中，加入20ml乙酸乙酯，再加入3.0g氯化钠，涡旋混合2min后均质提取，4000r/min离心5min后，转移上清液至浓缩瓶中。向下层残渣中加入20ml乙酸乙酯，重复提取1次，合并两次乙酸乙酯提取液，用旋转蒸发仪浓缩至近干，加入5ml甲醇溶解，待净化。[0025]净化将上述待净化液转移至活化好的c18柱中，上样后，随即收集全部流出液，于40℃水浴中氮吹干至近干，加入1ml正庚烷，涡旋1min溶解残渣，定容液经0.22μm滤膜过滤，待测。[0026]分析条件acquitytrefoilamy1色谱柱(150mm×3.0mm，2.5ꢀµm），填料为直链淀粉-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）；检测波长230nm；系统背压17.2mpa；柱温31℃；流动相a为co2，b为0.5%（体积分数，下同）氨水的甲醇溶液；梯度洗脱程序：0-0.2min时，b为3%；0.2-0.3min时，b由3%升至10%，保持1.7min；2-2.5min时，b由10%跳转至3%，保持0.5min；流速1.5ml/min；进样量5.0ꢀµl。[0027]色谱分离条件梯度分离条件1：0-8.0min（10%b）；梯度分离条件2：0-0.2min（3%b），0.2-0.3min（3%-10%b），0.3-2min（10%b），2-2.5min（10%-3%b)，2.5-3min（3%b）；梯度分离条件3：0-8.0min（5%b）。[0028]结果与讨论2.1流动相中助溶剂的选择使用upc2时，在主体流动相超临界状态co2中加入少量乙腈、甲醇、异丙醇等助溶剂，可有效调节流动相的洗脱和溶解能力，从而精确调控目标物的分离效果和分析速度。另外，通过调节流动相的ph值，可有效改善色谱峰形。异丙醇的粘性较大，试验过程中仪器容易出现超压报警。因此，本实验考察了甲醇、含0.5%氨水的甲醇溶液、含0.5%甲酸的甲醇溶液、乙腈等不同助溶剂对分离效果的影响。结果表明，使用甲醇和乙腈溶液作为助溶剂时，甲氰菊酯对映体未能实现基线分离；在甲醇中分别添加了体积分数为0.5%氨水和0.5%甲酸时，甲氰菊酯对映体的色谱峰分离度得到提高，且添加0.5%氨水能更有效改善色谱峰（见图2）。因此，试验选择含0.5%氨水的甲醇溶液作为助溶剂。[0029]梯度的选择本试验考察了“1.5”节中不同梯度分离条件对分离效果的影响。在梯度1的分离条件下，（-）-甲氰菊酯和（+）-甲氰菊酯的分离度较差；在梯度2的分离条件下，甲氰菊酯对映体的色谱峰形尖锐且对称；在梯度3的分离条件下，甲氰菊酯对映体的色谱峰分离度良好，但峰形较差，且存在拖尾现象（见图3）。因此，试验选择梯度分离条件2。[0030]色谱柱温度的选择upc2系统中的超临界状态co2主体流动相的密度随色谱柱温的改变而变化。当试验升高色谱柱温，流动相的密度会变小，洗脱能力逐渐降低，目标化合物的保留时间延长。考虑色谱柱的最高推荐温度（40℃）和维持系统处于超临界状态所需的温度（＞31℃），试验考察了不同色谱柱温（31、35、40℃）对目标化合物分离效果的影响。结果表明，甲氰菊酯对映体在31、35、40℃温度条件下的分离度分别为1.5、1.3和1.2（见图4）。相比35和40℃，在31℃的柱温条件下，色谱峰形更尖锐且分离度更佳。因此，试验选择31℃作为色谱柱温度。[0031]定容试剂的选择在upc2系统中，定容试剂是影响色谱峰形和分离效果的重要因素之一。试验比较了5种常用于upc2系统中的定容试剂（甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、正庚烷）对甲氰菊酯对映体的分离效果。结果表明，选择乙醇、乙腈和异丙醇作为定容试剂时，目标化合物的分离度和色谱峰形较差；选择甲醇和正庚烷作为定容试剂时，目标化合物的色谱峰分离度良好，且正庚烷作为定容试剂时，目标化合物的色谱峰形更尖锐、更对称（见图5）。因此，试验选择正庚烷为定容试剂。[0032]稳定性考察目标化合物的稳定性是保障整个实验检测结果准确的前提，因此试验用新配制标准溶液来计算储存不同天数的标准溶液的含量，从而考察标准溶液的稳定性。将新配制的甲氰菊酯对映体混合标准溶液（10.00mg/l），与分别储存1、3、5、7、14、30、60天后的甲氰菊酯对映体的含量作图比较。结果表明，标准溶液分别储存1、3、5天内的含量与新配制标准溶液的含量基本相同，储存7天后的含量开始呈现逐渐下降趋势，储存14天后的含量下降趋势明显（＞10%）（见图6）。因此，试验规定标准溶液储存时间为14天。[0033]净化条件的优化试验考察了文献报道的c18[24]、florisil[25]等固相萃取柱对梨及其制品提取液的净化效果。在阴性样品中分别加入甲氰菊酯对映体标准溶液，参照“1.3.1”ꢀ节的样品提取步骤，再分别采用c18柱和florisil柱进行净化。结果表明，采用c18柱净化时，甲氰菊酯对映体的平均回收率为91.4%。采用florisil柱净化时，（-）-甲氰菊酯的回收率较低，平均回收率为65.4%（见图7）。因此，试验最终采用c18柱净化。[0034]线性范围和测定下限按照试验方法分析混合标准溶液系列，以目标物的峰面积为纵坐标，对应质量浓度为横坐标绘制标准曲线。结果表明，两种目标物标准曲线的线性范围均为1.0-20.0mg/l，线性回归方程和相关系数不小于0.9998（见表1）。以各目标物10倍信噪比（s/n=10）确定测定下限，所得（-）-甲氰菊酯和（+）-甲氰菊酯的测定下限均为0.2mg/kg。在表1所列的线性范围内，线性良好，相关系数（r2）均大于0.9998。[0035]表1线性参数和测定下限目标物线性方程相关系数测定下限mg/kg(-)-甲氰菊酯y=6.64×103x+4.06×1020.99990.2(+)-甲氰菊酯y=5.62×103x+2.24×1020.99980.22.8回收率和精密度以阴性样品进行加标回收实验，添加水平分别为0.2，0.4，2.0mg/kg，平行测定6次，计算加标回收率及相对标准偏差（rsd），结果见表2。两种目标化合物的回收率范围为81.4%-106%，rsd(n=6)范围为4.1%-7.2%。实验结果的回收率和精密度均符合gb/t27404-2008[26]的要求，能够满足梨及其制品中甲氰菊酯检测的要求。[0036]表2精密度和回收试验结果（n=6）2.9实际样品测定按照建立的方法对随机抽取的20份市售梨泥、梨汁、梨罐头（其中梨泥8份、梨汁5份、梨罐头7份）中两种甲氰菊酯对映体进行检测。结果显示，其中1份梨泥样品中检出（-）-甲氰菊酯和（+）-甲氰菊酯，含量分别为0.25、0.22mg/kg（见图8），其他样品均未检出甲氰菊酯对映体。该检测结果与文献[2]报道甲氰菊酯外消旋体中（-）-甲氰菊酯和（+）-甲氰菊酯的比例基本相符。[0037]结论polarimetry,andgaschromatography-massspectrometry[j].chemicalresearchintoxicology，2021，34:1718-1720.[10]casillia,decorzante,jaquiera,etal.multidimensionalgaschromatographyhyphenatedtomassspectrometryandolfactometryforthevolatileanalysisofcitrushybridpeelextract[j].journalofchromatographya，2014，1373:169-178.[11]karakkakalak,karatttk,philipm,etal.separationanddeterminationoftheenantiomericlevamisoleanddexamisoleinequineplasmasamplesusingchiralpolysaccharidecolumn/lc-ms/ms[j].currentanalyticalchemistry，2020，16:761-767.[12]yoshiyukio,masahitot,togos,etal.lc-ms/msandchiropticalspectroscopicanalysesofmultidimensionalmetabolicsystemsofchiralthalidomideanditsderivatives[j].chirality，2017，29:282-293.[13]singhsp,dwivedin,rajuksr,etal.validationofarapidandsensitiveuplc-ms-msmethodcoupledwithproteinprecipitationforthesimultaneousdeterminationofsevenpyrethroidsin100ꢀµlofratplasmabyusingammoniumadductasprecursorion[j].journalofanalyticaltoxicology，2016，40:213-221.[14]gurupadayyab,reddym,prabhakarp，etal．chiralseparationofoxomemazineenantiomersbyhplctechniqueandenantiomericseparationmechanismviadockingstudies[j].currentpharmaceuticalanalysis，2021，17(2):222-230.[15]sutharsk,rauscheraꢀá,winternitzm，etal．chiralhplcseparationofenantiomericblebbistatinderivativesandracemizationanalysisinvertebratetissues[j].journalofpharmaceuticalbiomedical，2021，204:114-246.[16]jingx,huangx,wanghh，etal．poppingcandy-assisteddispersiveliquid-liquidmicroextractionforenantioselectivedeterminationofprothioconazoleanditschiralmetaboliteinwater,beer,baijiu,andvinegarsamplesbyhplc[j].foodchemistry，2021，348:129-147.[17]upc2超高效合相色谱：色谱新品类赋予科学家新的想象力.(2012-05-15)[2022-03-20].https://www.antpedia.com/index.phpaction-viewnews-itemid-212253-php-1[18]张文华，谢文，侯建波，等．超高效合相色谱法对6种三唑类农药对映体的拆分及其在黄瓜中的残留分析[j]．色谱，2019，37(12)：1356-1362．[19]zhangwh,xiew,houjb，etal．analyticalresearchontheseparationandresidueofchiralpesticidetriadimenolinfruitandvegetablepuree[j].journalofseparationscience，2021，44(18):3516-3523.[20]张文华，谢文，侯建波，等.基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法研究[j].分析测试学报，2021,40(12)：1713-1719[21]张文华，谢文，侯建波，等.超高效合相色谱法拆分和测定婴幼儿配方奶粉中肉碱对映体[j].理化检验-化学分册，2021,57(11)：970-976[22]张文华，洪灯，雷美康，等.超高效合相色谱法拆分和测定克伦特罗对映体[j].色谱，2021，39(12):1347-1354.[23]张文华，侯建波，荣杰峰，等.超高效合相色谱法对克伦特罗对映体的拆分及其在猪尿中的残留分析[j].分析测试学报，2021,40(12):1758-1764.[24]李敏青,安文佳,李菊,等.固相萃取/气相色谱法测定禽蛋中19种农药残留[j].分析测试学报，2020，39(4):520-525.[25]李盛丽.固相萃取-gc-ecd检测沃柑中的腐霉利、五氯硝基苯和甲氰菊酯残留[j].轻工科技，2020，36(7):125-126.[26]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会．实验室质量控制规范食品理化检测：gb/t27404—2008[s]．北京：中国标准出版社，2008．当前第1页12当前第1页12