一种神经节糖苷脂的鉴定方法及其应用

1.本发明涉及生物分子质谱分析技术领域，特别涉及一种神经节糖苷脂的鉴定方法及其应用。


背景技术：

2.神经节糖苷脂是含唾液酸的鞘糖脂，主要分布在质膜脂筏上。它们是两亲性分子，主要由疏水性神经酰胺和亲水性葡萄糖、半乳糖、n-乙酰半乳糖胺、n-乙酰神经氨酸或n-羟乙酰神经氨酸组成。神经酰胺上的疏水的脂肪酸尾部插入细胞壁，亲水性聚糖头部突出到外源环境中。通过调节自身细胞膜的流动性及与相邻细胞相互作用，神经节糖苷脂可作为细胞内和细胞外信号转导的介质。
3.神经节糖苷脂在神经系统中特别丰富，对神经系统疾病的致病机理起着至关重要的作用。阿尔茨海默症是一种典型的神经退行性疾病，伴有认知、思维和记忆功能障碍。据报道，阿尔茨海默症患者大脑功能区的神经节糖苷脂表现出代谢水平异常和稳态分布紊乱。神经节糖苷脂聚集在质膜上被认为是诱导细胞外淀粉样β-肽聚集的关键因素，这对神经元具有神经毒性，被认为是阿尔茨海默病的病理生理学标志。相反，神经节糖苷脂表达不足改变神经元之间的相互作用，导致神经系统功能退化。在某些报告中，神经节糖苷脂显示出与记忆保持有关的神经保护作用。通过调节催化神经节糖苷脂合成的上游内源性糖基转移酶，可以明显改善模型小鼠的学习和空间认知能力。因此，研究阿尔茨海默病的发病机制，筛选阿尔茨海默症的早期诊断生物标志物或治疗试剂越来越受到关注。然而，由于缺乏超灵敏的分析方法，关于神经节糖苷脂在阿尔茨海默症发病机制中的结论仍不清楚，甚至存在争议
4.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种神经节糖苷脂的鉴定方法及其应用，旨在对待测样品中神经节糖苷脂进行高效地鉴定和精确地定量的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种神经节糖苷脂的鉴定方法，其中，包括步骤：
8.采用甲醇、水以及甲基叔丁基醚对待测样本中的神经节糖苷脂进行粗提取，得到粗提产物；
9.使用负离子模式下数据依赖的质谱采集方法对粗提产物中的神经节糖苷脂进行质谱数据采集；
10.对所述质谱数据先进行母离子与子离子的峰匹配，再进行特征碎片离子分析，随后进行与神经节糖苷脂结构鉴定相关的特征离子、中性丢失离子对及母核神经酰胺的输出，得到筛选后的神经节糖苷脂；
11.对筛选后的神经节糖苷脂进行去重、加合峰剔除以及同位素峰剔除处理，得到保
留的候选神经节糖苷脂；
12.对所述候选神经节糖苷脂进行自动搜库或手动鉴定，完成对样本中神经节糖苷脂的鉴定。
13.所述神经节糖苷脂的鉴定方法，其中，采用甲醇、水以及甲基叔丁基醚对样本中的神经节糖苷脂进行粗提取的步骤包括：
14.将待测样本加入到由甲醇和水组成的第一混合溶液中，进行球磨处理后，得到匀浆液；
15.将所述匀浆液加入到由水和甲基叔丁基醚组成的第二混合溶液中进行震荡处理，随后静置分层后取下层溶液并冻干，得到粗提产物。
16.所述神经节糖苷脂的鉴定方法，其中，使用负离子模式下数据依赖的质谱采集方法对粗提产物中的神经节糖苷脂进行质谱数据采集的步骤包括：
17.将所述粗提产物复溶后使用反相c
18
柱进行色谱分离，并用含5mm乙酸铵的2％甲醇和水作为a相，用含5mm乙酸铵的50％甲醇和异丙醇作为b相，所述a相和b相作为流动相，分离梯度为b相在20分钟内由5％线性增加到95％；
18.在负离子采集模式下于600-1800m/z范围内自动获取强度最高的22个离子进行ms/ms谱图采集。
19.所述神经节糖苷脂的鉴定方法，其中，所述在负离子采集模式下于600-1800m/z范围内自动获取强度最高的22个离子进行ms/ms谱图采集的步骤中，设置质谱采集参数为：一级质谱采集分辨率70000，二级质谱采集分辨率17500；一级质谱采集agc靶标设定在3e6，二级质谱采集agc靶标设定在1e5；一级质谱采集和二级质谱采集的最大it分别设定在200ms及50ms；二级质谱采集碰撞能分别设定为10，15，20，25，30，35ev。
20.所述神经节糖苷脂的鉴定方法，其特征在于，对所述质谱数据进行母离子与子离子的峰匹配后，输出含有母离子、子离子、保留时间、电荷信息的所有化合物列表。
21.所述神经节糖苷脂的鉴定方法，其中，所述特征碎片离子分析是指对含有n-乙酰神经氨酸和n-甘氨酰神经氨酸的特征碎片离子进行神经节糖苷脂筛选。
22.所述神经节糖苷脂的鉴定方法，其中，对所述候选神经节糖苷脂进行自动搜库或手动鉴定的步骤中，设定母离子质量偏差小于5ppm，设定特征碎片离子小于20ppm。
23.一种神经节糖苷脂的鉴定方法在筛查阿尔茨海默症诊断标志物方法中的应用，其中，包括步骤：
24.将鼠脑组织中鉴定到的神经节糖苷脂进行峰面积提取，经过总峰面积归一化后使用非参数检验及最小二乘判别分析(pls-da)中神经节苷脂的投影和s-plot图中的变量重要性，筛查与阿尔兹海默症患病时间相关的神经节糖苷脂标志物。
25.有益效果：本发明提供了一种神经节糖苷脂的鉴定方法，首先用甲醇/水/甲基叔丁基醚对待测样本中的神经节糖苷脂进行粗提取；然后使用负离子模式下数据依赖的质谱采集方法对神经节糖苷脂进行数据采集；最后通过对神经节糖苷脂相关特征碎片、中性丢失离子对，可能存在的母核神经酰胺进行分析，实现对神经节糖苷脂进行高效鉴定。本发明方法可用于快速筛选、定性和准确定量分析复杂生物基质中的低丰度神经节糖苷脂。该方法具有良好的衡量神经节糖苷脂覆盖度及定量准确性，在肿瘤发展，神经退行性疾病机理研究、生物标志物筛选等领域有良好的应用前景。
附图说明
26.图1为本发明一种神经节糖苷脂的鉴定方法的流程图。
27.图2为实施例1中用于神经节苷类鉴定的特征碎片离子和中性丢失离子对图表。
28.图3为实施例1中从7种混标中鉴定出的神经节糖苷脂结果图表。
29.图4为实施例2中神经节糖苷脂分析方法的(a)重复性(b)日内精密度(c)日间精密度(d)线性，其中，柱状图显示神经节苷脂物种数量的百分比，折线图显示峰面积的累积百分比。
30.图5为实施例2中神经节糖苷脂分析方法筛选与阿尔茨海默病相关的候选生物标志物的直方图。
具体实施方式
31.本发明提供一种神经节糖苷脂的鉴定方法及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
32.请参阅图1，图1为本发明提供的一种神经节糖苷脂的鉴定方法流程图，如图所示，其包括步骤：
33.s10、采用甲醇、水以及甲基叔丁基醚对待测样本中的神经节糖苷脂进行粗提取，得到粗提产物；
34.s20、使用负离子模式下数据依赖的质谱采集方法对粗提产物中的神经节糖苷脂进行质谱数据采集；
35.s30、对所述质谱数据先进行母离子与子离子的峰匹配，再进行特征碎片离子分析，随后进行与神经节糖苷脂结构鉴定相关的特征离子、中性丢失离子对及母核神经酰胺的输出，得到筛选后的神经节糖苷脂；
36.s40、对筛选后的神经节糖苷脂进行去重、加合峰剔除以及同位素峰剔除处理，得到保留的候选神经节糖苷脂；
37.s50、对所述候选神经节糖苷脂进行自动搜库或手动鉴定，完成对样本中神经节糖苷脂的鉴定。
38.本发明提供的方法可用于快速筛选、定性和准确定量分析复杂生物基质中的低丰度神经节糖苷脂，该方法具有良好的衡量神经节糖苷脂覆盖度及定量准确性，在肿瘤发展，神经退行性疾病机理研究、生物标志物筛选等领域有良好的应用前景。
39.在一些实施方式中，采用甲醇、水以及甲基叔丁基醚对样本中的神经节糖苷脂进行粗提取的步骤包括：将待测样本加入到由甲醇和水组成的第一混合溶液中，进行球磨处理后，得到匀浆液；将所述匀浆液加入到由水和甲基叔丁基醚组成的第二混合溶液中进行震荡处理，随后静置分层后取下层溶液并冻干，得到粗提产物。
40.在一些实施方式中，使用负离子模式下数据依赖的质谱采集方法对粗提产物中的神经节糖苷脂进行质谱数据采集的步骤包括：将所述粗提产物复溶后使用反相c
18
柱进行色谱分离，并用含5mm乙酸铵的2％甲醇和水作为a相，用含5mm乙酸铵的50％甲醇和异丙醇作为b相，所述a相和b相作为流动相，分离梯度为b相在20分钟内由5％线性增加到95％；在负离子采集模式下于600-1800m/z范围内自动获取强度最高的22个离子进行ms/ms谱图采集，
其中，设置质谱采集参数为：一级质谱采集分辨率70000，二级质谱采集分辨率17500；一级质谱采集agc靶标设定在3e6，二级质谱采集agc靶标设定在1e5；一级质谱采集和二级质谱采集的最大it分别设定在200ms及50ms；二级质谱采集碰撞能分别设定为10，15，20，25，30，35ev。
41.在一些实施方式中，对所述质谱数据进行母离子与子离子的峰匹配后，输出含有母离子、子离子、保留时间、电荷信息的所有化合物列表。
42.在一些实施方式中，所述特征碎片离子分析是指对含有n-乙酰神经氨酸和n-甘氨酰神经氨酸的特征碎片离子进行神经节糖苷脂筛选。
43.在一些实施方式中，对所述候选神经节糖苷脂进行自动搜库或手动鉴定的步骤中，设定母离子质量偏差小于5ppm，设定特征碎片离子小于20ppm。
44.在一些实施方式中，还提供一种神经节糖苷脂的鉴定方法在筛查阿尔茨海默症诊断标志物方法中的应用，其包括步骤：将鉴定到的神经节糖苷脂进行峰面积提取，经过总峰面积归一化后使用非参数检验及最小二乘判别中神经节苷脂的投影和s-plot图中的变量重要性，筛查与阿尔兹海默症患病时间相关的神经节糖苷脂标志物。
45.下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
46.实施例1
47.使用本发明方法对混标中的神经节糖苷脂进行鉴定，其包括步骤：
48.第一步：1μg/ml gm3-d5(d36:1),gm3(d42:1)(neugc)，gm1-d3(d36:1)，gd1b(d36:1)，gd1a(d36:1)，gt1b(d36:1)及gq1b(d36:1)组成的7种神经节糖苷脂混标溶液使用反相c
18
柱(2.1
×
100mm,1.7μm,waters,ireland)进行色谱分离，并用分别含5mm乙酸铵的2％甲醇/水(a相)及50％甲醇/异丙醇(b相)作为流动相，分离梯度为b相在20分钟内由5％线性增加到95％。质谱采集参数为：在负离子模式下600-1800m/z范围内自动获取强度最高的22个离子进行ms/ms谱图采集。一级质谱采集分辨率70000，二级质谱采集分辨率17500。一级质谱采集agc target设定在3e6，二级质谱采集agc target设定在1e5。一、二级质谱采集maximum it分别设定在200ms及50ms。二级质谱采集碰撞能采用归一化能量，能量值分别设定10，15,20,30，35ev，每个能量采集一针原始数据。
49.第二步：利用开源性软件one-map_pto对原始raw data进行一级、二级谱数据进行提取后对母离子/所有子离子的进行峰匹配。导出含有母离子、子离子、保留时间、电荷信息的所有化合物列表。再利用自主研发的r语言对含有特征n-乙酰神经氨酸(290.088
±
10ppm)/n-甘氨酰神经氨酸(306.083
±
10ppm)特征碎片离子的候选神经节糖苷脂进行筛选。随后进行与神经节糖苷脂结构鉴定相关的特征碎片离子、中性丢失离子对及可能的母核神经酰胺的输出，步骤如图2所示。根据特征碎片离子、中性丢失离子对及可能的母核神经酰胺可高效的进行神经节糖苷脂鉴定，排除假阳性。
50.经过去重、加合峰/同位素峰剔除，对保留的候选神经节糖，对保留的候选神经节糖苷脂进行自动搜库(http://www.lipidmaps.org/)或者手动鉴定。鉴定过程中母离子质量偏差设定小于5ppm，碎片离子设定小于20ppm。最终鉴定得到混标中神经节糖苷脂的鉴定结果如图3所示。该结果中除了鉴定到了混标中的7个已知的神经节糖苷脂外，还鉴定到了其他含量很低的神经节糖苷脂杂质，一方面说明所建立方法的准确性，另一方面说明所建立方法对低丰度神经节糖苷脂具有高覆盖度。
51.实施例2
52.使用本发明方法筛选与阿尔兹海默症小鼠病症发展相关的神经节糖苷脂标志物，其包括步骤：
53.第一步：称取3个月、8个月app/ps1小鼠及同龄同窝对照小鼠脑海马区组织10mg中加入300μl甲醇和100μl水。在25hz频率下用组球磨仪研磨2分钟，重复循环一次。获得的匀浆液加入200μl水和1ml甲基叔丁基醚(mtbe)震荡提取1h，随后静置分层后取下层溶液400μl冻干。
54.第二步：小鼠脑神经节糖苷脂粗提取使用反相c
18
柱(2.1
×
100mm,1.7μm,waters,ireland)进行色谱分离，并用分别含5mm乙酸铵的2％甲醇/水(a相)及50％甲醇/异丙醇(b相)作为流动相，分离梯度为b相在20分钟内由5％线性增加到95％。质谱采集参数为：在负离子模式数据依赖采集模式下600-1800m/z范围内自动获取强度最高的22个离子进行ms/ms谱图采集。一级质谱采集分辨率70000，二级质谱采集分辨率17500。一级质谱采集agc target设定在3e6，二级质谱采集agc target设定在1e5。一、二级质谱采集maximum it分别设定在200ms及50ms。二级质谱采集碰撞能采用归一化能量，能量值分别设定10，15,20,30，35ev，每个能量采集一针原始数据。
55.第三步：利用开源性软件one-map_pto对原始raw data进行一级、二级谱数据进行提取后对母离子/所有子离子的进行峰匹配。导出含有母离子、子离子、保留时间、电荷信息的所有化合物列表。再利用自主研发的r语言对含有特征n-乙酰神经氨酸(290.088
±
10ppm)/n-甘氨酰神经氨酸(306.083
±
10ppm)碎片离子的候选神经节糖苷脂进行筛选。随后进行与神经节糖苷脂结构鉴定相关的特征离子、中性丢失离子对及可能的母核神经酰胺的输出。经过去重、加合峰/同位素峰剔除，对保留的候选神经节糖，对保留的候选神经节糖苷脂进行自动搜库(http://www.lipidmaps.org/)或者手动鉴定。鉴定过程中母离子质量偏差设定小于5ppm，碎片离子设定小于20ppm。
56.第四步：对各组小鼠中鉴定到的144个神经节糖苷脂使用xcailibur软件对峰面积进行提取。结果如图4中a所示对于匀浆的脑组织样本在6个平行实验中，84.38％代谢物峰面积的rsd小于30％，占总峰面积的99.94％。如图4中b所示日内精密度的6个平行实验中，88.78％代谢物的峰面积rsd小于30％，占总峰面积的99.98％。如图4中c所示日间精密度实验中85.13％代谢物峰面积的rsd小于30％，占总峰面积的99.97％。由于很难获得所有神经节苷脂种类的标准品来研究线性，我们称取5至80mg的匀浆脑组织的不同重量，以产生线性响应。通过计算峰面积与组织重量的皮尔逊相关系数，78.13％的gms物种的相关系数大于0.9，累计占总峰面积的97.96％，如图4中d所示。上述方法学验证结果表明，该方法可以获得准确的统计分析结果。对于3个月和8个月阿尔兹海默症小鼠脑组织样本，经过总峰面积归一化后使用非参数检验及最小二乘判别(pls-da)中神经节苷脂的投影(vip)和s-plot图中的变量重要性筛查获取与阿尔兹海默症患病时间相关的神经节糖苷脂标志物。如图5所示，随着疾病的发展，di-o-ac-gt1a(d36:1),o-ac-gd1b(d36:1)和o-ac-gd1b(d36:0)这三种代谢物在疾病样本中表现出显著的上调，而在对照组中观察到从3个月到8个月的逐渐降低趋势。o-ac-gt1a(d36:2)被确定为一种非进展性生物标记物，与时间匹配疾病组相比，对照组3个月正常组的含量更高。然而，在8个月中，疾病组和对照组没有发现显著差异。
57.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可
以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。