一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法及其试剂盒和应用与流程

1.本发明涉及生物监测技术领域，具体而言，涉及一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法及其试剂盒和应用。


背景技术：

2.近些年来，前列腺癌(pca)的发病率及死亡率逐渐升高。目前，前列腺癌的临床诊断方式有血清前列腺特异性抗原检测(psa)、直肠指检、及直肠超声影像学检查等，出现病变指标后再进行前列腺穿刺确诊。其中，psa检测在临床上广泛应用于前列腺癌的早期筛查与监测。
3.目前对于前列腺癌检测来说，psa的筛查被认为是预测前列腺癌最理想的指标，因其增加了前列腺癌的检出率，在临床上也广为应用。但是psa特异性有限，在有些前列腺增生和前列腺炎患者体内psa也会升高。尤其是在“灰色区”(psa 4～10ng/ml)，很容易出现假阳性和假阴性的情况。
4.pca前列腺癌检测主要基于肌氨酸途径进行早期前列腺癌筛查，其中肌氨酸和前列腺癌的发展显著相关，甘氨酸为肌氨酸的前体及代谢物，丙氨酸可消除肌氨酸的瞬时影响。
5.目前，测定肌酐主要有化学测定法(jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法等。肌氨酸的测定方法有电化学方法、电泳法、荧光光谱法、色谱法。这些方法样品制备过程复杂，需要专业人员熟练操作仪器，不适合日常操作分析。谷氨酸的测定方法有微量法、可见分光光度法、放射免疫法、酶联免疫吸附法等。甘氨酸的测定方法主要以滴定、衍生化为主。丙氨酸的测定方法有衍生化法。但是这些方法的检测成本较高，操作繁杂，而且检测精度不高，诸多原因导致现有设备不能普及于临床应用。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种检测肌酐校正后样本中肌氨酸及其代谢物的方法及其试剂盒和应用。
8.本发明是这样实现的：
9.第一方面，本发明实施例提供了一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法，其包括：采用液相色谱串联质谱的方法检测样本中的肌氨酸及其代谢物。所述色谱包括采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，所述流动相a为含甲酸的甲酸铵水溶液，所述流动相a中甲酸铵的作用浓度为5～15mmol/l，甲酸的体积分数为0.01％～0.5％，所述流动相b为含甲酸的乙腈溶液，所述流动相b中甲酸的体积分数为0.01％～0.5％。洗脱条件如下：0～1.2min，流动相a的体积百分比由1％～10％增至10％～20％，流动相b的体积百分比由90％～99％降至80％～90％；1.2～2.8min，流动相a体积百分比由10％～20％增至15％～25％，流动相b体积百分比由80％～90％降至75％～85％；2.8～3.8min，流动相a体积百分比维持在15％
～25％，流动相b体积百分比维持在75％～85％；3.8～3.9min，流动相a体积百分比由15％～25％降至1％～10％，流动相b体积百分比由75％～85％增至90％～99％；3.9～4.5min，流动相a体积百分比维持在1％～10％，流动相b体积百分比维持在90％～99％；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
10.第二方面，本发明实施例提供了试剂组合在制备用于液相色谱串联质谱检测样本中肌氨酸及其代谢物的试剂盒中的应用，所述试剂组合包括：流动相a和流动相b，所述流动相a为含甲酸的甲酸铵水溶液，所述流动相a中甲酸铵的作用浓度为5～15mmol/l，甲酸的体积分数为0.01％～0.5％，所述流动相b为含甲酸的乙腈溶液，所述流动相b中甲酸的体积分数为0.01％～0.5％；所述色谱包括采用所述流动相a和所述流动相b进行梯度洗脱，洗脱条件如下：0～1.2min，流动相a的体积百分比由1％～10％增至10％～20％，流动相b的体积百分比由90％～99％降至80％～90％；1.2～2.8min，流动相a体积百分比由10％～20％增至15％～25％，流动相b体积百分比由80％～90％降至75％～85％；2.8～3.8min，流动相a体积百分比维持在15％～25％，流动相b体积百分比维持在75％～85％；3.8～3.9min，流动相a体积百分比由15％～25％降至1％～10％，流动相b体积百分比由75％～85％增至90％～99％；3.9～4.5min，流动相a体积百分比维持在1％～10％，流动相b体积百分比维持在90％～99％。
11.第三方面，本发明实施例提供了一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的试剂盒，其包括流动相a和流动相b；所述流动相a为含甲酸的甲酸铵水溶液，所述流动相a中甲酸铵的作用浓度为5～15mmol/l，甲酸的体积分数为0.01％～0.5％，所述流动相b为含甲酸的乙腈溶液，所述流动相b中甲酸的体积分数为0.01％～0.5％；所述试剂盒还包括：肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸中至少一种的内标品。
12.本发明具有以下有益效果：
13.本发明通过优化色谱的条件，使得样本中肌氨酸及其代谢物的分离采集能够在4.5min内完成，为肌氨酸及其代谢物的同时检测提供了便利，显著缩短了待测物的采集时间，提高了检测效率。本发明提供的液相色谱串联质谱能够定量测定肌酐校正后样本中肌氨酸及其代谢物的含量，具有检测限低、分析时间快、特异性强和稳定性高等优点。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
15.图1为样本检测的色谱图。
具体实施方式
16.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
17.本发明提供了一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法，其包括：采用液相色谱串联质谱的方法检测样本中的肌氨酸及其代谢物；所述色谱包括采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，所述流动相a为含甲酸的甲酸铵水溶液，所述流动相a中甲酸铵的作用浓度为5～15mmol/l，甲酸的体积分数为0.01％～0.5％，记为10mmol/l甲酸铵水(0.1％甲酸)，所述流动相b为含甲酸的乙腈溶液，所述流动相b中甲酸的体积分数为0.01％～0.5％，记为乙腈(0.1％甲酸)；洗脱条件如下：0～1.2min，流动相a的体积百分比由1％～10％增至10％～20％，流动相b的体积百分比由90％～99％降至80％～90％；1.2～2.8min，流动相a体积百分比由10％～20％增至15％～25％，流动相b体积百分比由80％～90％降至75％～85％；2.8～3.8min，流动相a体积百分比维持在15％～25％，流动相b体积百分比维持在75％～85％；3.8～3.9min，流动相a体积百分比由15％～25％降至1％～10％，流动相b体积百分比由75％～85％增至90％～99％；3.9～4.5min，流动相a体积百分比维持在1％～10％，流动相b体积百分比维持在90％～99％。
18.现有用于检测肌氨酸的色谱洗脱通常需要14～16min的洗脱时间，本技术的发明人经一系列创造性劳动后，通过优化色谱的条件流动相和洗脱条件，使得样本中肌氨酸及其代谢物的分离采集能够在4.5min内完成，为肌氨酸及其代谢物的同时检测提供了便利，显著缩短了待测物的采集时间，提高了检测效率。
19.具体地，所述流动相a中，甲酸的体积分数可以为0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％和0.5％中的任意一种或任意两种之间的范围。所述流动相b中，甲酸的体积分数可以为0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％和0.5％中的任意一种或任意两种之间的范围。
20.优选地，所述梯度洗脱的流速为0.1～1ml/min，具体可以为0.1ml/min、0.2ml/min、0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min、1ml/min中的任意一种或任意两种之间的范围。
21.优选地，所述色谱的条件如下：色谱柱为：acquitybeh amide 1.7μm 2.1
×
50mm，色谱柱的柱温为35～45℃，进样器温度为5～15℃，进样量为2～5μl；更优选地，所述柱温为40℃，所述进样器温度为10℃，所述进样量为3μl。
22.优选地，质谱采用esi离子源，检测方式为正离子检测，扫描方式为多重反应监测，去溶剂温度为450～550℃，去溶剂气流速为700～900l/hr，毛细管电压为2.5～4.5kv。更优选地，所述去溶剂温度为500℃，所述去溶剂气流速为800l/hr，所述毛细管电压为3.5kv。
23.优选地，所述肌氨酸的代谢物包括谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸中的至少一种，优选为谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸。
24.优选地，所述检测样本中肌氨酸及其代谢物是指检测肌酐校正后样本中肌氨酸及其代谢物。
25.优选地，所述样本为尿液样本或环境样本。环境样本可以是土壤样本、空气样本和水样本中的任意一种或任意两种或三种组成的。
26.需要说明的是，所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。方法的直接目的可以是通过测定肌氨酸鉴定受试者的身份，可以是分析肌氨酸及其代谢物的含量等。
27.优选地，质谱检测的离子对如下：甘氨酸：76.1
→
30.1；甘氨酸-is：79.1
→
32.1；丙氨酸：90.1
→
44.1；丙氨酸-is：93.1
→
47.1；谷氨酸：148.1
→
84.1；谷氨酸-is：151.1
→
87.1；肌酐：114.1
→
86.1；肌酐-is：117.1
→
89.1；肌氨酸：90.1
→
44.11；肌氨酸-is：93.1
→
47.11。
28.优选地，质谱的离子源参数包括：甘氨酸：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为10～20v；甘氨酸-is：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为10～20v；丙氨酸：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为10～20v；丙氨酸-is：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为15～25v；谷氨酸：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为13～23v；谷氨酸-is：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为15～25v；肌酐：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为20～40v；肌酐-is：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为10～20v；肌氨酸：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为10～20v；肌氨酸-is：锥孔电压为15～25v，碰撞能量为15～25v。需要说明的是，is代表内标(internal standard)。
29.更优选地，甘氨酸：锥孔电压为20v，碰撞能量为15v；甘氨酸-is：锥孔电压为20v，碰撞能量为15v；丙氨酸：锥孔电压为20v，碰撞能量为15v；丙氨酸-is：锥孔电压为20v，碰撞能量为20v；谷氨酸：锥孔电压为20v，碰撞能量为18v；谷氨酸-is：锥孔电压为20v，碰撞能量为20v；肌酐：锥孔电压为20v，碰撞能量为30v；肌酐-is：锥孔电压为20v，碰撞能量为15v；肌氨酸：锥孔电压为20v，碰撞能量为15v；肌氨酸-is：锥孔电压为20v，碰撞能量为20v。
30.优选地，所述液相色谱串联质谱检测包括样本前处理步骤，所述样本前处理包括采用沉淀剂对加标样本进行蛋白沉淀；本发明提供前处理步骤仅需一步蛋白沉淀即可，无需进行衍生化的操作，在节约了检测时间的基础上，降低操作难度，使得肌氨酸及其代谢物的检测在无需衍生化步骤的情况下，也能达到较好的效果。
31.优选地，所述沉淀剂包括乙腈，进行蛋白沉淀时，乙腈的体积分数为70％～90％，具体可以为70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％中的任意一种或任意两种之间的范围。
32.本发明实施例还提供了试剂组合在制备用于液相色谱串联质谱检测样本中肌氨酸及其代谢物的试剂盒中的应用，所述试剂组合包括：流动相a和流动相b，所述流动相a为含甲酸的甲酸铵水溶液，所述流动相a中甲酸铵的作用浓度为5～15mmol/l，甲酸的体积分数为0.01％～0.5％，所述流动相b为含甲酸的乙腈溶液，所述流动相b中甲酸的体积分数为0.01％～0.5％；
33.所述色谱包括采用所述流动相a和所述流动相b进行梯度洗脱，洗脱条件如下：0～1.2min，流动相a的体积百分比由1％～10％增至10％～20％，流动相b的体积百分比由90％～99％降至80％～90％；1.2～2.8min，流动相a体积百分比由10％～20％增至15％～25％，流动相b体积百分比由80％～90％降至75％～85％；2.8～3.8min，流动相a体积百分比维持在15％～25％，流动相b体积百分比维持在75％～85％；3.8～3.9min，流动相a体积百分比由15％～25％降至1％～10％，流动相b体积百分比由75％～85％增至90％～99％；3.9～4.5min，流动相a体积百分比维持在1％～10％，流动相b体积百分比维持在90％～99％。
34.所述代谢物包括谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸中的至少一种。
35.优选地，所述检测样本中肌氨酸及其代谢物是指检测肌酐校正后样本中肌氨酸及其代谢物。
36.优选地，所述样本为尿液样本或环境样本。
37.优选地，所述试剂组合还包括沉淀剂，所述沉淀剂包括乙腈，所述液相色谱串联质谱检测包括样本前处理：采用所述沉淀剂对加标样本进行蛋白沉淀；
38.优选地，进行蛋白沉淀时，乙腈的体积分数为70％～90％。
39.需要说明的是，应用中的液相色谱串联质谱的条件和样本可以同前述任意实施例所述，应用中的试剂组合可以同前述任意实施例所述的检测方法所采用的试剂，在此不再赘述。
40.此外，本发明实施例还提供了一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的试剂盒，其包括流动相a和流动相b；所述流动相a为含甲酸的甲酸铵水溶液，所述流动相a中甲酸铵的作用浓度为5～15mmol/l，甲酸的体积分数为0.01％～0.5％，记为10mmol/l甲酸铵水(0.1％甲酸)，所述流动相b为含甲酸的乙腈溶液，所述流动相b中甲酸的体积分数为0.01％～0.5％，记为乙腈(0.1％甲酸)。所述试剂盒还包括：肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸中至少一种的内标品。
41.本发明提供的用于上述检测方法的试剂盒，用于体外定量测定肌酐(creatinine，cre)校正后人尿液样本中肌氨酸(sarcosine，sar)及其代谢相关产物谷氨酸(glutamic acid，glu)、甘氨酸(glycine，gly)、丙氨酸(alanine，ala)的含量，用于肌氨酸代谢异常相关疾病前列腺癌的辅助诊断。
42.肌氨酸是甘氨酸的n-甲基衍生物，属于人体内的非必需氨基酸(微量)，在能量代谢过程中发挥着无可替代的作用。前列腺癌组织可促进甘氨酸-n-甲基转移酶的转录表达，引起肌氨酸水平升高。检测尿液中肌氨酸及其相关代谢物的含量，有助于为临床前列腺癌疾病诊断提供更多依据。
43.本发明提供的检测方法或试剂盒适用于液相色谱-串联质谱仪，具体型号为ab sciex triple quad
tm 3200、4500和waters xevo tqd或其他性能相当的仪器。
44.可以理解的是，流动相a和b可以同前述任意实施例所述，不再赘述。
45.所述试剂盒还包括：肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸中至少一种的内标品。
46.优选地，所述试剂盒还包括肌酐的内标品。
47.优选地，所述试剂盒还包括：肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和肌酐中至少一种的校准品。
48.优选地，所述试剂盒还包括：肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和肌酐中至少一种的质控品。
49.优选地，所述沉淀剂包括乙腈。
50.本发明的检验原理：采用蛋白沉淀处理样本后，进行液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)分析，待测物经色谱分离后，导入质谱仪，在离子源中离子化形成带电离子。在电场的作用下，聚焦进入三重四级杆质量分析器，筛选出目标离子，进入检测器，产生信号。将校准品中待测物与相应内标的峰面积比值与标示浓度进行线性拟合，绘制标准曲线。将实际样本中的待测物与内标的峰面积比值代入拟合的标准曲线方程，即可计算出待测物浓度。计算待测物与肌酐浓度的比值，得到肌酐校正后的待测含量。
51.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
52.实施例1
53.本发明提供了一种定量测定肌酐校正后样本中肌氨酸及其代谢物的试剂盒，适用于上述检测方法，其包括表1所示的组分。
54.表1试剂盒组成
[0055][0056]
注：1、本试剂盒中校准品的值可溯源至nist srm1950和srm3667；2、不同批号试剂盒中的校准品、质控品不建议互换使用。
[0057]
表2系列校准品和质控品的目标浓度水平
[0058][0059]
所述方法还包括使用表3所示的组分，在其他实施例中，试剂盒还可以进一步包括表3所示的组分。
[0060]
表3组分
[0061] 名称要求1纯化水去离子水2甲酸色谱纯以上3乙腈色谱纯以上4甲酸铵质谱纯以上596孔v型板450μl 96孔v型板和96孔板膜6涡旋混合器96孔板涡旋混合器
[0062]
样本要求：适用于尿液样本或含尿液样本的环境样本，样本量要求≥1ml。
[0063]
尿液样本采集和制备：采集清晨中段尿液，装于无菌尿杯中，在4h内于4℃，2000～
4000g离心并将尿沉渣、细胞碎片去除，转移一定量上清液，上清液和样本稳定剂按照9:1体积比进行混合，混匀后可运输或储存。
[0064]
样本储存及运输：已采集并添加样本稳定剂的尿液样本，室温(10～30℃)储存不超过20h；2℃-8℃条件下储存，可稳定放置4天；运输样本时，必须按照有关临床样本及感染物质运输规定进行包装并添加标签。样本可以在冰袋中运输，运输时间不要超过上述相应温度下储存时间的限制。样本使用前应恢复至室温，并彻底混匀。
[0065]
检测仪器型号：质谱仪为waters xevo tqd；液相色谱仪为acquity uplc i-class；低温高速离心机为d3024r；涡旋振荡器为vortex-6。
[0066]
本发明还提供了一种定量测定肌酐校正后样本中肌氨酸及其代谢物的方法，其包括以下步骤。
[0067]
(1)样本前处理
[0068]
精密吸取20μl校准品、质控品或待测样本，置于合适的容器中(1.5mlep管或450μl 96孔板)中，分别精密加入80μl内标工作液，涡旋混匀3min后，于4℃，200～4000g离心10min，转移60μl上清液至另一个96孔板中，进行lc-ms/ms检测。
[0069]
其中，内标工作液为含同位素内标的90％(v/v)乙腈水溶液(沉淀剂)。
[0070]
(2)lc-ms/ms检测
[0071]
流动相a为10mmol/l甲酸铵水(0.1％fa)：1000ml蒸馏水+0.630g甲酸铵+1ml甲酸，超声5min；
[0072]
流动相b％-乙腈(0.1％fa)：1000ml乙腈+1ml甲酸，超声5min；洗针液-20％乙腈水溶液：200ml乙腈+800ml蒸馏水，超声5min；
[0073]
液相色谱条件如表4所示。
[0074]
表4色谱条件
[0075][0076]
[0077]
质谱条件如表5所示。
[0078]
表5质谱条件
[0079][0080]
五种化合物离子源参数如表6所示。
[0081]
表6离子源参数
[0082]
扫描模式(scan type)：mrm离子化模式(ionization model)：positive离子源(ion source)：esi去溶剂温度(desolution temperature)：500℃去溶剂气流速(desolution gas flow)：800l/hr毛细管电压(capillary voltage)：3.5kv
[0083]
数据分析和结果：
[0084]
1、校准曲线绘制：以校准品的浓度为自变量xi，以对应浓度校准品和内标的峰面积比值为因变量yi，计算线性回归方程y＝ax+b和相关系数r；
[0085]
2、质控品数据分析：当校准曲线的r≥0.990时，将低值和高值质控品的信号强度带入回归方程，获得质控品浓度；
[0086]
3、样本数据分析：当高值质控品的相对偏差≤
±
15％、低值质控品的相对偏差≤
±
20％时，将尿液样本的信号强度带入回归方程，获得尿液样本中的目标物浓度，结果见图1。
[0087]
图1中肌氨酸出峰时间为2.95min，丙氨酸出峰时间为3.20min，肌氨酸和丙氨酸互为同分异构体，质谱离子对信息相同，单靠质荷比无法准确定量，需确保二者可完全基线分离，对检测方法要求高，从图中可以看出二者可实现基线分离，彼此检测无干扰。
[0088]
试验例1
[0089]
实施例1提供的检测方法评价。
[0090]
(1)标准曲线评价
[0091]
实验流程：校准标样和质控样品中的分析物浓度将以分析物与内标的色谱峰面积比为纵坐标，用加权(w＝1/x2)最小二乘法以分析物的浓度(x)与峰面积比(y)进行线性回归，所得的回归方程(y＝bx+a)即为标准曲线。评价3条标准曲线，每天1条标准曲线，计算线性回归的相关系数r，并计算校准品的浓度与标示浓度的相对偏差。
[0092]
实验结果
[0093]
表7肌酐连续3个分析批的标准曲线回归方程参数评价结果
[0094][0095]
表8肌氨酸连续3个分析批的标准曲线回归方程参数评价结果
[0096][0097][0098]
表9丙氨酸连续3个分析批的标准曲线回归方程参数评价结果
[0099][0100]
表10甘氨酸连续3个分析批的标准曲线回归方程参数评价结果
[0101][0102]
表11谷氨酸连续3个分析批的标准曲线回归方程参数评价结果
[0103][0104]
根据方法调试设定的前列腺癌线性范围，连续3个批次标准曲线，每批标准曲线的相关系数r≥0.990，标准曲线评价满足方法学要求。
[0105]
试验例2
[0106]
实施例1所述检测方法的精密度评价。
[0107]
实验流程：根据试剂盒提供的低、中、高值质控品，每个浓度平行制备6份，分别计算测定值的平均值和标准差sd；每天制备和检测1次，以当天新制备标准曲线换算质控品浓度，连续5天，分别计算批内和批间精密度。
[0108]
表12精密度考察质控浓度水平
[0109][0110][0111]
实验结果：
[0112]
表13前列腺癌批内和批间精密度评价结果
[0113][0114]
数据显示连续3天的精密度实验数据，检测指标的日内精密度在0.39％-6.25％之间，日间精密度在2.04％-5.94％之间，精密度评价满足方法学要求。
[0115]
试验例3
[0116]
实施例1所述检测方法的准确度(加标回收)评价。
[0117]
实验流程：准确度采用加样回收实验评价，通过在尿液样品中加入不同浓度标准溶液，每个浓度平行制备6份。根据收集临床正常尿液样品中前列腺癌的本底浓度水平，分别添加3个浓度水平的标准溶液，通过加标浓度与加标实测浓度计算回收率，评价准确度。
[0118]
表14准确度考察加标浓度
[0119][0120]
实验结果：
[0121]
表15准确度评价结果
[0122][0123]
实验结果表明，尿液样品中除了部分低质控浓度点，其它不同加标浓度前列腺癌回收率在85％-106％之间，符合准确度评价要求。
[0124]
试验例4
[0125]
实施例1所述检测方法的准确度(外部质控)评价。
[0126]
实验流程：crms是具有溯源性的参考物质，来源于权威机构或是经参考方法赋值的室间质评物质；通过制备crms样本，分3个批次进行检测，每次重复检测两次，评价准确度。
[0127]
实验结果：
[0128]
表16准确度评价结果
[0129][0130]
表17准确度评价结果
[0131][0132]
实验结果表明，前列腺癌crms准确度率在91.61％-99.24％之间，符合准确度评价要求。
[0133]
试验例5
[0134]
实施例1所述检测方法的基质效应评价。
[0135]
实验流程：通过评价目标化合物在尿液基质和无尿液基质中的信号值来评价基质效应。根据临床尿液样品中前列腺癌本底浓度，通过比较尿液存在下目标化合物(内标)的信号强度与不含尿液目标化合物(内标)的信号强度评价基质效应，最终通过内标归一化的基质因子来评价基质效应，计算公式如下：
[0136]
内标归一化的基质因子＝(基质存在下分析物峰面积/内标峰面积)/(基质不存在下分析物峰面积/内标峰面积)。
[0137]
表18基质效应考察浓度
[0138][0139][0140]
实验结果：
[0141]
表19基质效应考察评价结果
[0142][0143]
实验结果表明，有/无尿液基质中不同加标浓度前列腺癌的内标归一化基质因子在0.949-1.139之间，说明内标与分析物的基质效应接近，可以补偿样品中分析物可能出现的基质效应，则基质效应不影响最终的准确定量分析，基质效应考察满足方法学评价要求。
[0144]
试验例6
[0145]
实施例1所述检测方法的残留评价。
[0146]
实验流程：检测最高浓度的校正标样后面放置一个空白基质样品，连续高浓度校准标样和空白基质样品循环检测3次，通过测定空白基质样品中的分析物和内标的峰面积，以确认残留对分析物准确定量的影响。
[0147]
实验结果：
[0148]
表20残留实验评价结果
[0149][0150][0151]
实验结果表明，不同检测指标分析物残留在0.0-14.22％之间，内标无残留现象，满足中国药典规定在分析物保留时间处的干扰峰的响应均不超过定量下限中分析物响应的20％，内标保留时间处的干扰峰的响应均不超过低浓度样品中内标响应的5％，残留实验评价满足方法学评价要求。
[0152]
试验例7
[0153]
实施例1所述检测方法的定量检出限评价(loq)。
[0154]
实验流程：通过检测标准曲线线性最低点来考察方法定量检出限，连续进样检测6次，通过cv和准确度偏差(re)来考察。
[0155]
实验结果：
[0156]
表21定量检出限评价结果
[0157]
考察指标肌酐肌氨酸丙氨酸甘氨酸谷氨酸理论值30μg/ml30ng/ml1.5μg/ml4μg/ml0.2μg/ml
130.8924.441.483.800.19230.4727.501.463.860.20330.8229.761.443.550.21430.7425.321.493.540.20530.3827.771.483.590.19631.0025.351.463.800.20平均值30.7226.691.473.690.20sd0.242.000.020.150.01rsd0.79％7.49％1.25％3.93％3.80％re2.39％-11.03％-2.11％-7.75％-0.83％
[0158]
实验结果显示线性最低点(loq)的cv和re均小于20％，说明定量检出限评价满足方法学评价。
[0159]
试验例8
[0160]
实施例1所述检测方法的稀释可靠性。
[0161]
实验流程：通过选取较高浓度的临床样本(或加标样本)作为稀释质控样本，采用空白基质作为稀释基质，分别将其稀释2、4、16倍；)稀释前与稀释后的样本分别平行处理6个，每个检测一次。以稀释前的浓度为参考靶值，计算各稀释后浓度样本的回收率，定量下限回收率在80％-120％之间，其它回收率在85％-115％之间则认为该稀释倍数可接受。
[0162]
实验结果：
[0163]
表22仪器检出限评价结果
[0164][0165]
实验结果显示各稀释后浓度样本的回收率，定量下限回收率在80％-120％之间，其它回收率在85％-115％之间则认为该稀释倍数可接受。
[0166]
本实验通过对前列腺癌质谱检测方法的标准曲线、线性、精密度、准确度、基质效应、残留、定量检出限和稀释倍数进行评价，评价结果显示方法满足临床样本检测。临床数据分析结果证明肌氨酸测定方法及试剂盒(非衍生法)诊断灵敏度和特异性较好。
[0167]
对比例1
[0168]
将lc-ms/ms法定量检测肌酐校正后尿肌氨酸的方法建立及评估(文章：许耘川，马妍慧，张良，沈立松，中华检验医学杂志，2015，38(5)：321-324)的方法作为对照组，文中采集36例前列腺癌患者、15例良性前列腺增生患者和76例健康体检者的随机尿各5ml，以[2h3]-肌氨酸作为同位素内标，使用丹磺酰氯对肌氨酸进行柱前衍生，应用lc-ms/ms技术同时测定肌氨酸和肌酐含量。与本发明的方法进行对比，对照组于本发明实施例1的主要区别在于如下：
[0169]
前处理方法：使用丹磺酰氯对肌氨酸进行柱前衍生，前处理方法操作较蛋白沉淀法繁琐耗时。
[0170]
色谱条件：采用梯度洗脱，采集时间16min，而本发明采集时间共4.5min，大大缩短了检测时间，提高检测效率。
[0171]
测试结果：只检测肌氨酸和肌酐，而本发明的方法同时检测肌氨酸、肌酐、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸，便于更全面地进行早期前列腺癌筛查。
[0172]
对比例2
[0173]
将“尿肌氨酸及肌酐测定试剂盒(专利申请号为cn201210145532.5)”的方法作为对照组，与本发明的方法进行对比，对照组与实施例1的区别主要在于，色谱条件：采用梯度洗脱，采集时间6min，而本发明采集时间共4.5min，大大缩短了检测时间，提高检测效率。
[0174]
测试结果：只检测肌氨酸和肌酐，而本发明同时检测肌氨酸、肌酐、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸，便于更全面地进行早期前列腺癌筛查。
[0175]
对比例3
[0176]
将“一种游离氨基酸快速非衍生的液相色谱串联质谱检测方法(专利申请号为cn202111076073.5)”作为对照组，与本发明的方法进行对比，主要区别如下：色谱条件：采用梯度洗脱，采集时间14min，而本发明采集时间共4.5min，大大缩短了检测时间，提高检测效率。
[0177]
测试结果：同时检测肌氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸，并未专门针对尿液样本进行氨基酸检测，而尿中肌酐的排泄量较少受尿液浓缩和稀释的影响，本发明针对尿液样本同时检测肌氨酸、肌酐、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸，便于更有针对性地进行早期前列腺癌筛查。
[0178]
对比例4
[0179]
将“一种用于检测样本中目标氨基酸和肌酐的方法及其检测试剂盒(专利申请号为cn202110700181.9)”作为对照组，与本发明的方法进行对比，主要区别如下：
[0180]
色谱条件：流动相b为含甲基叔丁基醚和甲酸的乙腈溶液，其中甲基叔丁基醚成本是乙腈的2倍，而本发明选用乙腈溶液，成本较低，更利于临床推广。
[0181]
对比例5
[0182]
基于实施例1的检测方法设置对照组，对照组的区别在于液相洗脱条件如下：
[0183]
表23液相色谱条件
[0184][0185]
变动洗脱程序，肌氨酸和丙氨酸分子量相同，均为89.09，检测时离子对信息相同90.1
→
44.1，无法通过质荷比进行有效区分，只能通过优化梯度洗脱条件来调整色谱保留行为，实现肌氨酸和丙氨酸谱图基线分离，确保检测准确性。而对比例5中的色谱条件不能实现肌氨酸和丙氨酸基线完全分离，对检测结果产生影响。
[0186]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。