液相色谱串联质谱法检测血液中9种生物碱的方法和应用与流程

1.本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种液相色谱串联质谱法检测血液中9种生物碱的方法和应用。


背景技术：

2.生物碱为生物体内的碱性含氮有机化合物，大多数存在于植物体中，个别存在于动物体内。具环状结构，难溶于水，与酸可生成盐，有一定的旋光性与吸收光谱，大多有苦味，呈无色结晶状，少数为液体。很多中药材和很多常见的有毒食物中含有多种生物碱。如山豆根、龙葵、射干、黄芪、甘草等中药作为常用的中药，在开方时经常配伍使用。此外，发芽的马铃薯、未成熟的蕃茄及茄子、未成熟的龙葵果实等中也含有有毒生物碱。如，苦参碱、氧化苦参碱、金雀花碱、n-甲基金雀花碱、龙葵碱等。由于生物碱的中毒症状相似，因此难以从临床表征分辨生物碱的中毒情况。
3.根据文献报道，几种生物碱的毒性剂量如表1所示：表1参照fda2005年发布的对于i期临床研究提出的人体等效剂量hed计算方法的指导原则，及2009年国家药品监督管理局药品审评中心对该指导原则的翻译稿中提出关于根据体表面积将动物剂量换算为人体等效剂量，人体重按60 kg计算，换算获得的结果如表2所示：表2注：龙葵碱和α-卡茄碱为文献报道的人体志愿者口服毒性剂量，故不需进行hed换算。
4.由以上分析可知，上述多种生物碱不仅中毒剂量低，且在人体内可能会发生毒性叠加的情况，因此有必要对人体内上述生物碱的血药浓度进行检测。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种液相色谱串联质谱法检测血液中9种生物碱的方法和应用。
6.本发明提出一种液相色谱串联质谱法检测血液中9种生物碱的方法，9种生物碱包括苦参碱、氧化苦参碱、金雀花碱、n-甲基金雀花碱、α-茄碱、α-卡茄碱、澳洲茄碱、澳洲茄边碱和β-澳洲茄边碱；方法至少包括以下步骤：s1、制备标准曲线方程，包括：配制含有9种生物碱对照品的标准工作液和内标工作液；内标工作液中采用金雀花碱-d4对照品为内标物；采用标准工作液、内标工作液和空白血浆配制得到含有不同9种生物碱浓度的标准溶液；标准溶液前处理后采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程；s2、处理得到待测样品，包括：取待测血液加入内标工作液；经前处理后得到待测样本；s3、检测待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中生物碱的浓度；其中，在步骤s1和步骤s2中，前处理包括：加入内标工作液后混匀、离心后取上清液干燥，加入复溶液混匀；内标工作液采用标准品稀释液配制，标准品稀释液选自体积百分比浓度为50%~100%的甲醇水溶液或者体积百分比浓度为50%~100%的乙腈水溶液；复溶液选自体积百分比浓度为10%~50%的乙腈水溶液或者体积百分比浓度为10%~50%的甲醇水溶液。
7.本发明提出上述方法在监测9种生物碱血药浓度中的应用，9种生物碱包括苦参碱、氧化苦参碱、金雀花碱、n-甲基金雀花碱、α-茄碱、α-卡茄碱、澳洲茄碱、澳洲茄边碱和β-澳洲茄边碱。
8.本发明提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：本发明同时检测血液中9种生物碱，同时检测药性成分和毒性成分，适用于本发明中一种或多种生物碱的同时检测。本发明同时检测血液中9种生物碱，能够大大降低分析成本、节省人力和分析时间，减少血液用量，增加受试者依从性。
9.简单计算如下，常规单一的生物碱的液质联用分析法可以做到5min，若分析9种生物碱，则需要45min。本技术同时检测9种生物碱仅需12.5min。大大节省了分析时间。一名实验人员能够通过一次前处理完成9种生物碱含量的测定，节省了人和耗材，降低了分析成本。血液用量也是如此，本发明同时检测血液中9种生物碱需要的样本量较少，若是单一生物碱的检测方法完成血液中9种生物碱检测需要的样本量是本发明的9倍。本发明的检测方法能够降低采血量，增加受试者依从性。
10.本发明同时检测9种生物碱仅使用1种同位素内标，极大的节省检测成本。使用同位素内标是液质联用技术最常用的手段，能够保证分析的准确度，也是贵重消耗品。一般操作是每种目标分析物都会使用其对应的同位素内标。通过本技术建立的检测方法，无需使用多个同位素内标，9种生物碱均以金雀花碱-d4作为内标，得到了优秀的准确度和精密度，本发明具有很好的经济效益。
11.本发明检测方法的前处理方法简单，使用乙腈或甲醇配制内标工作液，同时可沉淀蛋白。简单的操作给整个样品检测过程带来了方便。同时由于操作简单，前处理方法极易转化成批量化生产，人员间差异很小。
12.由于前处理被设计成只是简单的加样，混匀，离心，移取等操作，因此极易实现自动化或半自动化生产，并能够保证精密度和准确度。
13.本发明检测方法的检测范围宽，通过稀释可靠性考察，检测浓度范围覆盖1~20000 ng/ml。
附图说明
14.图1为标准溶液和内标的色谱图；图2为血浆样品的色谱图；图3为苦参碱的标准曲线图；图4为氧化苦参碱的标准曲线图；图5为金雀花碱的标准曲线图；图6为n-甲基金雀花碱的标准曲线图；图7为α-茄碱（龙葵碱）的标准曲线图图8为α-卡茄碱的标准曲线图；图9为澳洲茄碱的标准曲线图；图10为澳洲茄边碱的标准曲线图；图11为β-澳洲茄边碱的标准曲线图；图12为柱温50℃的色谱图；图13为柱温30℃的色谱图；图14为流动相采用水（0.1 %甲酸 + 10 mmol/l乙酸铵）甲醇体系的色谱图；图15为流动相采用纯水纯乙腈体系的色谱图；图16为流动相采用水（0.1%甲酸+10mmol/l甲酸铵）乙腈体系的色谱图；图17为分析流速采用0.2ml/min的色谱图；图18为分析流速采用0.4 ml/min的色谱图；图19为分析色谱柱采用kinitex f5，2.6μm，50
×
30mm的色谱图。
具体实施方式
15.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
16.本发明实施例使用的英文中文对照如表3所示：表3
本发明实施例提出一种液相色谱串联质谱法检测血浆中9种生物碱的方法，9种生物碱包括苦参碱、氧化苦参碱、金雀花碱、n-甲基金雀花碱、α-茄碱、α-卡茄碱、澳洲茄碱、澳洲茄边碱和β-澳洲茄边碱；9种生物碱化合物详细信息如表4所示：表4
本发明实施例的检测血浆中9种生物碱的方法至少包括以下步骤：s1、制备标准曲线方程，包括：s11、配制含有9种生物碱对照品的标准工作液和内标工作液；内标工作液中采用金雀花碱-d4对照品为内标物；s12、采用标准工作液、内标工作液和空白血液配制得到含有不同9种生物碱浓度的标准溶液；s13、对标准溶液进行前处理；s14、采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程；s2、处理得到待测样品，包括：取待测血液加入内标工作液，前处理，得到待测样本；s3、检测待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中生物碱的浓度。
17.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在步骤s13和步骤s2中，均包括对样本的前处理步骤，本发明实施例对前处理步骤进行了深入的研究，并发现前处理的具体条件可以提高提取效率，从而达到样本需求量小的技术效果，采用本发明实施例的前处理步骤，最小血样为100μl血液即可完成检测。待测血液可以为全血、血浆或者血清。并且，前处理的步骤简单，处理时间短，1.5小时内即可完成处理。前处理包括：加入内标工作液后混匀、离心后取上清液干燥，加入复溶液混匀。本发明实施例中创新的将内标工作液与沉淀剂合并在一起，内标工作液采用标准品稀释液配制，标准品稀释液选自体积百分比浓度为50%~100%的甲醇水或者体积百分比浓度为50%~100%的乙腈水溶液，通过添加一次试剂，即可实
现添加内标以及目标物的萃取和净化两个目的，进一步简化检测步骤，减少误差，提高了检测的准确性和检测效率。进一步优选乙腈溶液，基于甲醇和乙腈的提取回收率和基质效应情况，两者效果差异不大。但是乙腈的挥发性好于甲醇，能够大大减少氮吹的时间。采用乙腈30min内即可保证完全吹干，甲醇需要1h以上，因此更优选乙腈溶液作为内标工作液的稀释剂。
18.前处理步骤具体包括：加入内标工作液后混匀、离心后取上清液干燥，加入复溶液混匀。复溶液选自体积百分比浓度为10%~50%的乙腈水溶液或体积百分比浓度10%~50%的甲醇水溶液，可以有效减少溶剂效应。溶剂效应一般表现为色谱峰形不对称，色谱积分重复性差。
19.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在步骤s12中，空白血浆、标准工作液和内标工作液和的体积比为90 ~ 98：2 ~ 10：200~1000，将标准工作液、内标工作液和空白血浆混匀后进行前处理；混匀的条件为转速1000 ~ 2500rpm涡旋0.5 ~ 5分钟，并优选2000 rpm涡旋1分钟。
20.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，空白血浆、标准工作液和内标工作液和的体积比优选为90 ~ 98：2 ~ 10：400，进一步可采用90：10：400、95：5：400或98：2：400。
21.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在步骤s2中，待测血液与内标工作液的体积比为100：200~1000，优选100：400；待测血液与内标工作液混匀后进行前处理；混匀的条件为转速1000 ~ 2500rpm涡旋0.5 ~ 5分钟，并优选2000 rpm涡旋1分钟。
22.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，前处理中混匀的条件：转速1000 ~ 2500rpm涡旋5 ~ 15分钟；离心为转速12000 ~ 14000rpm离心10 ~ 20分钟，离心的温度为0 ~ 10℃，进一步优选4℃。本发明实施例经实验发现，低温离心能够明显增加检测方法的精密度。
23.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，前处理步骤中，可以减少上清液的取样量，所取上清液与内标工作溶液的体积比为0.1 ~ 1：1，例如可以为0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1中的任何一种。复溶液与待测血液的体积比为0.1 ~ 10：1，即可以进行不同程度的浓缩和稀释。例如可以为0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1中的任何一种。
24.进一步优选的，所取上清液与内标工作溶液的体积比为1：1，复溶液与待测血液的体积比为1：1，从而可在前处理中减少了移液器的调节，保证操作的精密度和稳定性。
25.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在步骤s1中，标准工作液的配制包括：1、采用标准品稀释液分别配制9种生物碱对照品的标准储备液；9种生物碱对照品包括：苦参碱对照品、氧化苦参碱对照品、金雀花碱对照品、n-甲基金雀花碱对照品、α-茄碱对照品、α-卡茄碱对照品、澳洲茄碱对照品、澳洲茄边碱对照品和β-澳洲茄边碱对照品；2、同比例取9种标准储备液至同一容器内，采用标准品稀释液进行稀释，得到混合储备液。
26.标准品稀释液选自体积百分比浓度为50%~100%的甲醇水溶液或者体积百分比浓度为50%~100%的乙腈水溶液；其中，甲醇水溶液并进一步优选70%~100%的甲醇水溶液，可满足在-80℃冰箱保存不会冻成固体。如果标准溶液冻成固体后溶解度下降，会有固体析出，后续室温解冻会影响准确度。若在-20℃冰箱保存，则体积百分比浓度为50%~100%甲醇水溶
液、体积百分比浓度为50% ~100%乙腈水溶液均可。
27.作为一个具体的实施方式，在步骤s1中，标准工作液的配制包括：1、用标准品稀释液分别配制9种生物碱对照品的标准储备液；9种生物碱对照品包括：苦参碱对照品、氧化苦参碱对照品、金雀花碱对照品、n-甲基金雀花碱对照品、α-茄碱对照品、α-卡茄碱对照品、澳洲茄碱对照品、澳洲茄边碱对照品和β-澳洲茄边碱对照品，每种对照品的浓度为1mg/ml；2、同比例取9种标准储备液至同一容器内，采用标准品稀释液进行稀释，得到混合储备液，每种对照品的浓度为100 μg/ml；具体的，可取9种生物碱储备液（1mg/ml）各100μl，再加入标准品稀释液100μl。
28.3、将混合储备液继续用标准品稀释液逐级稀释，制备得到每种对照品的浓度分别为20 ng/ml、40 ng/ml、100 ng/ml、200 g/ml、1000 ng/ml、2000 ng/ml、3200 ng/ml、4000 ng/ml的标准工作液。
29.优选的，将每个步骤配制得到的溶液于-20℃冰箱中保存。
30.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，内标工作液的配制方法包括：采用标准品稀释液将金雀花碱-d4对照品配制得到浓度为0.1 ~ 10mg/ml内标储备液，取适量内标储备液，用乙腈稀释，得到金雀花碱-d4对照品浓度为1~200ng/ml、优选1 ~ 50ng/ml，更优选5ng/ml的内标工作液。内标工作液中主要的溶剂为乙腈，甲醇水溶液所占比例极小，在沉淀过程中，所占比例可以忽略不计。每个步骤配制得到的溶液于-20℃冰箱中保存。
31.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在s1中，将前处理好的标准曲线样品在预设的检测条件下进行分析，得到检验结果以及各级混合标准溶液的色谱图和检测结果，拟合检测结果，总共9个标准曲线，均进行1/x2加权，得到标准曲线。
32.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在步骤s1和步骤s3中，采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测时，高效液相色谱的分析条件为：色谱分析所使用的色谱柱为选自孔径为70 ~ 120
ꢀå
的c18柱，并优选120
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。c18柱的粒径进一步优选2 ~ 5μm，并优选2.7μm，c18柱的内径优选为2.1 ~ 4.6 mm，c18柱的长度优选为30 ~ 150 mm；并优选poroshell 120 ec-c18；4.6
ꢀ×
50mm，2.7μm；流动相：a相：含1 ~ 100 mmol/l甲酸铵或乙酸铵、0.01~ 1 %(v/v)甲酸的水；b相：乙腈；优选的，流动相：a相：含10 mmol/l甲酸铵或乙酸铵、0.1 %(v/v)甲酸的水；b相：乙腈；流速：0.2~ 0.6ml/min；柱温：30 ~ 50℃；进样量：0.1 ~ 20
µ
l；分析时间：12.5 min。
33.本发明实施例在ec c18色谱柱下比较了甲醇水和乙腈水体积，发现乙腈水体系有更好的色谱峰形和灵敏度。通过在水相中进一步的添加1 ~ 100 mmol/l甲酸铵或乙酸铵和0.01~ 1 %(v/v)甲酸，进一步优选添加10 mmol/l甲酸铵或乙酸铵和0.1 %(v/v)甲酸得到了满意的保留和响应。
34.洗脱条件为：0 ~ 2.00分钟： a相：80 ~ 100%；b相：0 ~ 20%；流速：0.2 ~ 0.4ml/min；2.01 ~ 8.00分钟：a相：50 ~ 70 %；b相：30 ~ 50%；流速：0.2 ~ 0.4ml/min；8.01 ~ 8.50分钟：a相：0~10%；b相：90 ~ 100%；流速：0.2 ~ 0.4 ml/min；8.51 ~ 10.00分钟：a相：0~10%；b相：90 ~ 100%；流速：0.4 ~ 1.0ml/min；10.01 ~ 11.50分钟：a相：80 ~ 100%；b相：0 ~ 20%；流速：0.4 ~ 1.0ml/min；
11.51 ~ 12.50分钟：a相：80 ~ 100%；b相：0 ~ 20%；流速：0.2 ~ 0.4ml/min。
35.洗脱条件优选为：0 ~ 2.00分钟： a相：85 ~ 95%；b相：5 ~ 15%；流速：0.25 ~ 0.35ml/min；2.01 ~ 8.00分钟：a相：55 ~ 65 %；b相：35 ~ 45%；流速：0.25 ~ 0.35 ml/min；8.01 ~ 8.50分钟：a相：0 ~ 5%；b相：95 ~ 100%；流速：0.25 ~ 0.35 ml/min；8.51 ~ 10.00分钟：a相：0~ 5%；b相：95 ~ 100%；流速：0.45 ~ 0.55 ml/min；10.01 ~ 11.50分钟：a相：85 ~ 95%；b相：5 ~ 15%；流速：0.45 ~ 0.55 ml/min；11.51 ~ 12.50分钟：a相：85 ~ 95%；b相：5 ~ 15%；流速：0.25 ~ 0.35 ml/min。
36.洗脱条件进一步优选为：0 ~ 2.00分钟：a相：90%；b相：10%；流速：0.3 ml/min；2.01 ~ 8.00分钟：a相：60%；b相：40%；流速：0.3 ml/min；8.01 ~ 8.50分钟：a相：0%；b相：100%；流速：0.3 ml/min；8.51 ~ 10.00分钟：a相：0%；b相：100%；流速：0.5 ml/min；10.01 ~ 11.50分钟：a相：90%；b相：10%；流速：0.5 ml/min；11.51 ~ 12.50分钟：a相：90%；b相：10%；流速：0.3 ml/min。
37.由于所检测的九种生物碱极性跨度大，在色谱行为上相差较大，通过梯度洗脱完成9种物质的合并检测。同时可以看到梯度中从8min开始有机相比例升到100%，是为了清洗色谱柱，通过大有机相清洗残留在色谱柱内的强保留杂质，避免对连续进样产生干扰。同时在8.5 ~ 11.5min增加了流速，以缩短整个清洗和再平衡的时间。否则分析时间将会延长至15min以上。
38.作为本发明实施例的一种改进的技术方案，高效液相色谱的分析条件具体如表5所示：表5作为本发明实施例的一种改进的技术方案，在步骤s1和步骤s3中，采用高效液相
色谱质谱联用仪进行检测的质谱条件，具体为：气帘气：0~50psi；碰撞气：6~12psi；电喷雾电压：1500~5500v；雾化温度：200~700℃；雾化气：10~80psi；辅助气：10~80psi。
39.本发明实施例对9种生物碱与内标金雀花碱-d4进行了母离子和子离子扫描，选择了各化合物的[m+h]
+
峰作为母离子，同时选择了响应最好的子离子进行优化质谱参数，获得质谱检测的条件为如表6所示：表6本发明实施例还涉及上述方法在监测9种生物碱血药浓度中的应用，9种生物碱包括苦参碱、氧化苦参碱、金雀花碱、n-甲基金雀花碱、α-茄碱、α-卡茄碱、澳洲茄碱、澳洲茄边碱和β-澳洲茄边碱。本发明实施例的方法线性范围宽，灵敏度高，进而准确监测9种生物碱在血液中的浓度，并可绘制血药浓度曲线，用于研究相关药物的代谢情况。
[0040]
下面通过具体实施对本发明实施例的技术方案做进一步的解释和说明，本发明的原料均为市售。所采用的主要原料和仪器如下：1、仪器设备：（1）液质联用仪：exionlcac/triplequad5500，absciex，usa；（2）离心机：eppendorf5804r高速离心机，eppendorfag，usa；sartoriusα-14c高速离心机，satorius，德国；（3）氮吹仪：md200-2，杭州奥盛，china；（4）旋涡混匀器：mix-25p，miulab，china；（5）超纯水仪：cascadaiii-10，pall，usa。
[0041]
2、对照品如表7所示：表7
3、试剂超纯水：自制；乙腈：4l，lc-ms grade，fisher，usa；甲酸：50ml，lc-ms grade，fisher，usa；甲醇：4l，hplc grade，merck，usa；乙酸铵：250g，lc-ms grade，sigma，usa；在本发明实施例中，甲醇、甲酸、乙腈等有机溶剂的浓度均为体积百分比浓度。
[0042]
实施例1（一）标准溶液的配制及标准曲线的标定。
[0043]
1、标准储备液制备精密称取9种生物碱对照品（不小于1.00 mg），经过校正系数校正后，用移液器加入标准品稀释液，配制成1mg/ml的储备液，保存于-20℃冰箱中。
[0044]
2、对照品混合储备液制备用移液器移取9种生物碱储备液（1mg/ml）各100μl，移液器移取标准品稀释液100μl，配制成100 μg/ml的对照品混合储备液保存于-20℃冰箱中。
[0045]
3、标准工作液制备用移液器移取对照品混合储备液（100 μg/ml）适量，用标准品稀释液逐级稀释，制备各浓度的标准曲线工作液，于-20℃冰箱中保存。标准品稀释液为体积百分比浓度为70%甲醇水溶液。具体稀释步骤见下表8所示：表8（二）内标工作液制备的制备1、内标储备液制备：取金雀花碱-d4对照品，用标准品稀释液，配制成1mg/ml的内标储备液，于-20℃冰箱中保存。标准品稀释液为体积百分比浓度为70%甲醇水溶液。
[0046]
2、内标工作液制备：用移液器移取内标储备液（1mg/ml），用乙腈稀释，具体稀释步骤见表9：表9
溶液a于-20℃冰箱中保存。用移液器移取溶液a（400ng/ml），用乙腈稀释，具体稀释步骤见表10：表10内标工作溶液（沉淀剂）4℃冰箱中保存。内标工作溶液的制备可以根据实际情况按照比例扩大或者减小总体积。
[0047]
（三）标准曲线样品的配制取8支ep管，分别用移液器精密移取空白血浆95μl，并分别加入5μl相应的标准工作溶液，涡旋振荡1min，得到浓度分别为200ng/ml、160ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml的标准曲线样品。随行标曲曲线样品均为新鲜制备。
[0048]
（四）标准曲线样品的处理1、向8支装有100μl标准曲线样品的ep管中加入内标工作溶液（金雀花碱-d4 5 ng/ml）400μl，空白样品中加入400μl乙腈。
[0049]
2、涡旋振荡10min。
[0050]
3、于14000rpm，4℃离心15分钟。
[0051]
4、取上清400μl于1.5ml离心管中，氮气吹干，使用100μl复溶液复溶，复溶液为体积百分比浓度为10%乙腈水溶液；5、涡旋振荡5min混匀，于14000rpm，4℃离心15分钟，转移90μl上清液至96孔板中，进样分析。
[0052]
（五）标准曲线样品的标定将前处理好的标准曲线样品在预设的检测条件下进行分析，得到检验结果以及各级混合标准溶液的色谱图和检测结果，拟合检测结果，进行1/x2加权，得到标准曲线。
[0053]
标准溶液和内标的色谱图如图1所示，血浆样品的色谱图如图2所示，标准曲线图如图3~图11所示。图3~图11所示的标准曲线方程如下：图3为苦参碱matrine的标准曲线方程：y = 0.0905 x
ꢀ‑
0.00131 (r = 0.9996)；图4为氧化苦参碱oxymatrine的标准曲线方程：y = 0.105 x
ꢀ‑
0.00383 (r = 0.9993)；图5为金雀花碱cytisine的标准曲线方程：y = 0.0858 x
ꢀ‑
0.000234 (r = 0.9997)；图6为n-甲基金雀花碱n-methylcytisine的标准曲线方程：y = 0.00673 x
ꢀ‑
0.000599 (r = 0.9985)；图7为α-茄碱（龙葵碱）solanine的标准曲线方程：y = 0.00891 x-0.00227 (r = 0.9979)；图8为α-卡茄碱α-chaconine的标准曲线方程：y = 0.0242 x
ꢀ‑
0.00145 (r = 0.9972)；图9为澳洲茄碱solasonine的标准曲线方程：y = 0.0135 x
ꢀ‑
0.00171 (r = 0.9986)；图10为澳洲茄边碱solamargine的标准曲线方程：y = 0.0211 x
ꢀ‑
0.00349 (r = 0.9987)；图11为β-澳洲茄边碱khasianine的标准曲线
方程: y = 0.0362 x
ꢀ‑
0.0052 (r = 0.9981)。
[0054]
（六）血浆样品的前处理静脉采血，立即离心，分离出血浆。可4℃保存和运输。
[0055]
向ep管中加入100μl血浆样品的，加入内标工作溶液（金雀花碱-d4 5 ng/ml）400μl，空白样品中加入400μl乙腈。涡旋振荡10min。于14000rpm，4℃离心15分钟。取上清400μl于1.5ml离心管中，氮气吹干，使用100μl复溶液复溶，复溶液为体积百分比浓度为10%乙腈水溶液。涡旋振荡5min混匀，于14000rpm，4℃离心15分钟，转移90μl上清液至96孔板中，进样分析。
[0056]
（七）血浆样品的检测在如表5和表6所示的检测条件下得到检验结果以及色谱图，根据步骤2中得到标准曲线，可得到血浆样品中9种生物碱的定量检测结果。
[0057]
实验例1本实验例用于说明本发明实施例检测方法的人员差异性：采用实施例1的方法，2名实验员，每名实验员分别前处理低、中、高三个浓度的样品各6个，考察人员间差异，得到实验结果如表11所示。
[0058]
表11：人员间差异（p=2，n=6）根据表11可知，cv在2.79% ~ 7.13%之间。准确度均值在98.08% ~ 112.07%之间，说明人员间差异很小。
[0059]
实验例2（一）线性范围和定量下限：分别制备9种浓度的混合标准溶液按照上述方法执行得到色谱图。以色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明9种生物碱的线性范围如表12所示，血浆样品中9种生物碱的定量下限（lloq）如表12所示。
[0060]
表12：量下限批内准确度与精密度（n=6）
根据表12可知，血浆样品中9种生物碱分别在1ng/ml~200ng/ml，线性良好，相关系数r﹥0.9900。血浆样品中9种生物碱的定量下限（lloq）为1 ng/ml。定量下限（lloq）的批内精密度检测结果cv《20%，满足检测要求。
[0061]
（二）准确度与精密度：1、采用本发明实施例的方法进行检测，统计批内准确度与精密度，实验结果如表13所示：表13：批内准确度与精密度（n=6）血浆样品中9种生物碱不同浓度的准确度在97.48% ~ 109.58%之间。说明准确度良好，满足检测要求。血浆样品中9种生物碱不同浓度的精密度在2.42 % ~ 6.28%之间。说明精密度良好，满足检测要求。
[0062]
2、采用本发明实施例的方法进行检测，统计日间准确度与精密度，实验结果如表14所示：表14：日间准确度与精密度（n=6，day=3）
血浆样品中9种生物碱不同浓度的日间准确度在99.83% ~ 107.76%之间。说明精准确度良好，满足检测要求。血浆样品中9种生物碱不同浓度的日间精密度在3.23% ~ 10.68%之间。说明精精密度良好，满足检测要求。
[0063]
3、采用本发明实施例的方法进行检测，统计稀释可靠性，实验结果如表15所示：表15：稀释可靠性（n=6）血浆样品（1000ng/ml）经10倍稀释后9种生物碱回算准确度在90.35%~102.93%之间，变异系数（cv）在2.32%~8.53%之间。血浆样品（1000ng/ml）经100倍稀释后9种生物碱回算准确度在92.23%~103.07%之间，变异系数（cv）在3.59%~7.75%之间。可见方法稀释可靠性良好。同时本实施例方法的实际可检测范围，最低至定量下限1ng/ml，最高至定量上限200ng/ml的100倍，即20000ng/ml。
[0064]
4、在前处理步骤中采用常温离心，实验结果如表16所示：表16：常温离心的批内准确度、精密度数据（n=6）
与表13所示的批内精密度、准确度对比，可以看出，4℃离心的操作能够明显增加方法的精密度。
[0065]
实验例3：本实验例考察柱温对色谱条件的影响：柱温采用50℃，其余条件同实施例，对标准溶液进行检测，得到色谱图如图12所示。由图12可知，色谱峰前移，保留时间提前，影响很小。
[0066]
柱温采用30℃，其余条件同实施例，对标准溶液进行检测，得到色谱图如图13所示。由图13可知，色谱峰后移，保留时间延后，影响很小。
[0067]
实验例4本实验例考察流速和流动相对色谱条件的影响：对比例1：流动相采用水（0.1%甲酸+10mmol/l乙酸铵）甲醇体系，其余条件同实施例1，对标准溶液进行检测，得到色谱图如图14所示。由图14所示，保留增强，部分色谱峰形不好。
[0068]
对比例2：流动相采用纯水纯乙腈体系，其余条件同实施例1，对标准溶液进行检测，得到色谱图如图15所示。由图15所示，保留弱，色谱峰拖尾。
[0069]
对比例3：流动相采用水（0.1%甲酸+10mm甲酸铵）乙腈体系，其余条件同实施例1，对标准溶液进行检测，得到色谱图如图16所示。由图16所示，变化不大，不同类型缓冲盐耐用性好。
[0070]
对比例4：分析流速采用0.2 ml/min，具体为：0 ~ 2.00分钟： a相：90%；b相：10%；流速：0.2 ml/min；2.01 ~ 8.00分钟：a相：60%；b相：40%；流速：0.2 ml/min；8.01 ~ 8.50分钟：a相：0%；b相：100%；流速：0.2ml/min；8.51 ~ 10.00分钟：a相：0%；b相：100%；流速：0.5 ml/min；10.01 ~ 11.50分钟：a相：90%；b相：10%；流速：0.5 ml/min；11.51 ~ 12.50分钟：a相：90%；b相：10%；流速：0.2 ml/min。
[0071]
其余条件同实施例1，对标准溶液进行检测，得到色谱图如图17所示。由图17所示，色谱峰后移，保留时间延后。后面几个极性小的生物碱是因为后续梯度变换成100%有机相
而被一起冲了出来，不是理想的色谱行为。
[0072]
对比例5：分析流速采用0.4 ml/min，0 ~ 2.00分钟： a相：90%；b相：10%；流速：0.4ml/min；2.01 ~ 8.00分钟：a相：60%；b相：40%；流速：0.4ml/min；8.01 ~ 8.50分钟：a相：0%；b相：100%；流速：0.4ml/min；8.51 ~ 10.00分钟：a相：0%；b相：100%；流速：0.5ml/min；10.01 ~ 11.50分钟：a相：90%；b相：10%；流速：0.5ml/min；11.51 ~ 12.50分钟：a相：90%；b相：10%；流速：0.4ml/min。
[0073]
其余条件同实施例1，对标准溶液进行检测，得到色谱图如图18所示。由图18所示，色谱峰前移，保留时间提前。前面几个极性相对较大的生物碱是因为流速变大，梯度变换率增大，被提前冲了出来，保留因此减弱，不是理想的色谱行为。
[0074]
对比例6：分析色谱柱采用kinitex f5，2.6μm，50
×
3.0mm，其余条件同实施例1，对标准溶液进行检测，得到色谱图如图19所示。由图19所示，色谱峰前移，保留时间提前。可以看出五氟苯基键合相的色谱柱对生物碱的整体保留效果均不好。
[0075]
实验例5本实验例考察了甲醇和乙腈的前处理提取回收率和基质效应：内标工作液的标准品稀释液分别采用体积比分别浓度为乙腈和甲醇溶液；其余条件同实施例1，结果如表17。
[0076]
表17
由表17可知，标准品稀释液采用甲醇水溶液和乙腈水溶液的综合效果基本相同。由于乙腈的挥发性更好，可进一步缩短样本前处理时间。
[0077]
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。