呼出气中挥发性有机化合物的采集与检测系统和方法

1.本发明属于气体化学分析技术领域，具体涉及一种呼出气中挥发性有机物的采集与检测系统和方法。


背景技术：

2.人体代谢活动能产生多种挥发性有机物(vocs)，直接反映细胞、组织和体内微生物当前的生理状态，进而提供关于个人健康的信息。经血液循环和肺泡内气体交换后，部分代谢产生的vocs经呼吸道、鼻和口腔排放进入周围环境，收集和筛查人体呼气中的vocs可应用于疾病的诊断、环境暴露评估、药物代谢动力学模拟等方面的研究。相比于血液检测，呼吸活检具有非侵入性、安全、快速、方便等优势，因此在疾病早期筛查和精准医疗中具有广阔前景。
3.呼吸采样缺乏标准化采样流程是导致结果重复性差的主要因素，也进一步限制呼吸活检在临床中的应用。由于人体呼出气中有成百上千种痕量vocs，对所有vocs进行定性和定量分析的难度大、成本高。不同个体在不同时间段的代谢水平和生理状况存在差异，vocs的含量和组成存在波动和变化。因此，需要构建规范化的呼吸采样流程，确保结果的可靠性和准确性。目前国内外关于呼气vocs的采样方法五花八门，没有统一的标准。目前，最常见的呼气采集方法是使用惰性材料制成的聚合物采样袋，其优势是易于操作，成本较低，而且可以重复使用。但是所有商用聚合物都会发生vocs的扩散和吸附，袋本身也会释放许多背景污染物干扰测定，且温度和储存时间对气体样品的完整性有很大影响。另有一些自制的呼气捕获器，虽然收集过程非常方便，但通常无法准确采集固定体积的呼吸样本，预浓缩能力也较差。因此，为了对呼气vocs进行更准确的定性和定量分析，需要对采样的装置进行合理地结构设计和条件优化。
4.目前，呼气vocs的传统范式研究中常用的分析技术主要分为离线和在线两种方式。气相色谱-质谱串联技术是最常见的离线技术，也是目前呼气vocs分析的金标准。其根据分子和色谱柱之间的相互作用的强度来分离化合物。尽管具有高度的敏感性和重复性，但复杂的样品前处理、较长的分析时间和较高的知识要求阻碍了它在临床研究中的广泛应用。气相-离子迁移质谱(gc-ims)和质子转移反应质谱(ptr-ms)是最常见的在线分析技术。在线技术允许将呼气样本直接引入分析仪器进行分析，从而避免了样本存储的阶段。此外，在线技术的分析时间相对较短，因此可以立即获得结果。但在线技术的主要缺点是无法实现准确的定性定量分析，且设备成本较高，因而无法普及。近年来，电子鼻传感器技术也逐步发展起来，但是电子鼻无法识别化合物性质，而是通过学习呼吸模式，甄别不同呼吸特征的电信号，在基础研究中的说服力不足。因此，需要开发一套规范化的分析技术，优先确保定性定量分析的准确性，未来才能实现呼气vocs的高效针对性分析。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明提供一种呼出气中挥发性有机物(vocs)的规范
化采集与检测系统和方法，以提供更加快速和准确的分析结果。
6.本发明提供的呼出气中挥发性有机物(vocs)的采集与检测系统，具体包括：呼吸采样器(1)、热脱附仪(td)(2)、全二维气相色谱仪(gc
×
gc)(3)、飞行时间质谱(tof ms)(4)、氢火焰离子检测器(fid)(12)和控制软件模块；其中：
7.所述呼吸采样器(1)，与配套的控制软件模块相连，用于采集呼出气中的vocs；并实时监测采样过程中温度、压力和co2浓度等呼吸参数，确保采样流程的稳定和准确。
8.所述呼吸采样器(1)，采用改制后的reciva采样器(owlstone)，包括：
9.供气泵，用于过滤环境气体中的背景污染vocs，为采样流程提供纯净空气；
10.采样面罩，紧贴于脸部，并与呼吸采样器连接；
11.吸附管，用于浓缩和收集呼出气中的vocs。吸附管具体可采用tenax ta+carbograph-5td；其中，两根样品吸附管插入面罩下缘左侧两孔，另外两根实心吸附管插入面罩下缘右侧两孔，组合后面罩与采样器对应接口紧扣。
12.所述热脱附仪(2)，用于加热样品吸附管，使吸附的vocs再次挥发成气态，并在冷阱中再次冷凝和挥发，除去样品中的水汽；
13.所述热脱附仪(2)包括加热阀(5)、冷阱(6)；
14.所述热脱附仪(2)具体采用markes公司的unity 2热脱附仪。
15.所述全二维气相色谱仪(3)，用于分离复杂的呼气vocs基质，使不同性质的vocs在不同保留时间进入质谱；
16.所述全二维气相色谱仪(3)包括依次连接的进样口(7)、一维色谱柱(8)、调制器(9)、二维色谱柱(10)、分流器(11)；进样口(7)与热脱附仪(2)中冷阱(6)连接；
17.所述飞行时间质谱(4)，包括ei离子源(13)、无场漂移管(14)，mcp检测器(15)，其可以通过离子源击碎vocs，从而根据碎片离子峰，确定化合物结构，实现定性定量分析。
18.所述氢火焰离子检测器(12)，用于气相色谱分离后化合物的定量分析，氢火焰离子检测器中化合物峰强度高于飞行时间质谱，定量效果更好。但对于不是完全由碳、氢组成的化合物或受溶剂峰干扰的化合物，氢火焰离子检测器的定量效果不佳。氢火焰离子检测器(12)、ei离子源(13)分别与气相色谱仪(3)中分流器(11)连接。
19.所述控制软件模块，部署于采样主机电脑内，主要通过传输线将采样器内传感器信号可视化于电脑软件内，可实时监测采样进程和各采样参数(温度、压力、co2、呼吸速率)的变化。
20.工作时，经呼吸采样器(1)获得的样品热脱附后进入冷阱(6)进行预浓缩，释放的vocs由进样口(7)进入一维色谱柱(8)，分离中极性vocs；然后经调制器(9)低温调制后进入二维色谱柱(10)，分离高级性vocs；分离后的vocs经分流器(11)分流，部分进入氢火焰离子(fid)检测器(12)，另一部分进入ei离子源(13)，经高能电子束冲击后变成碎片离子，碎片离子进入飞行时间质谱(14)，检测得到碎片离子的质荷比。
21.本发明提供的呼出气中挥发性有机物(vocs)的规范化采集与检测方法，是基于上述规范化采集与分析仪器的，具体步骤如下：
22.(1)吸附管前处理：将吸附管放置于老化仪(superlabsc-10)上，于330-350℃下老化30-50min；
23.(2)气体样品采集：采集过程中，受试者保持均匀的鼻呼吸，使用呼吸采样器(1)收
集呼吸气体；
24.(3)气体样品前处理：采集完的吸附管在氮吹仪(c-clsr)上吹脱除水6-13min，然后加入1μl三组分混合内标，包括溴氯甲烷、氯苯-d5和1,4-二氯苯-d4，浓度都为20μg/ml。
25.(4)样品检测：利用热脱附仪(2)、全二维气相色谱仪(3)、飞行时间质谱仪(4)、氢火焰离子检测器(12)，设定检测条件，来检测呼吸样品；
26.(5)结果分析：分析检测得到碎片离子的荷质比与保留时间，利用nist谱库(v.2.3)对目标化合物进行定性分析，部分化合物经内标归一化后利用标准品外部曲线法定量。
27.进一步地：
28.步骤1中，控制老化仪氮吹流速为每根管100-120ml/min。
29.步骤2中，样品采集前受试者需在采样地点静坐3-5min，保持肺泡气与环境空气的动态平衡。采样时，受试者需保持均匀鼻呼吸，略微抬头使呼吸道顺畅，呼吸速率保持在每分钟10-16次。
30.步骤2中，使用呼吸采样器(1)收集呼吸气体时，采集速率为150-200ml/min，总共采集3l呼吸气体。
31.使用呼吸采样器(1)采集呼出气vocs，实现呼出气均匀、准确的采集，使富集后vocs的状态基本与呼出时一致，确保了检测的准确性。
32.步骤3中，控制氮吹除水的速率为每根管100-120ml/min。
33.步骤4中，热脱附过程中，以氮气作为载气。
34.步骤4中，所述热脱附条件包括预吹扫时间、热脱附程序和传输线温度；其中：
35.预吹扫时间为1-3min，氮气流速为50-60ml/min。
36.热脱附操作条件，样品吸附管解析温度为280-300℃，冷阱捕集温度为10-30℃，热脱附温度为300℃，脱附时间为3-5min，传输线温度为180-200℃，释放的vocs以不分流的方式进入气相色谱仪(3)，载气为氦气。
37.步骤4中，所述的全二维气相色谱仪(3)、飞行时间质谱(4)、氢火焰离子检测器(12)的分析条件包括色谱柱参数、柱温箱升温程序、调制解调器条件、飞行时间质谱仪条件和氢火焰离子检测器条件；其中：
38.全二维气相色谱仪(3)采用(7890a)，其中，一维色谱柱为安捷伦中极性db-624柱(30m
×
0.25mm i.d.
×
1.4μm)；二维色谱柱为高极性db-wax柱(5m
×
0.25mm i.d.
×
0.25μm)，一维色谱柱和二维色谱柱均以氦气作为载气，流速分别为0.5-0.7ml/min和23-24ml/min；
39.一维柱和二维柱共享相同的柱温箱升温程序，优选为：柱温箱初始温度为40-50℃，保持5min，然后以6-8℃的速度升到140℃，再以10℃的速度升到220℃，保持30min。低温调制器的温度为10-30℃，调制周期为3s(载荷时间为2.799s，注射时间为0.201s)。分离后的vocs以18:2(fid:ms)的分流比进入飞行时间质谱仪(tof ms)和氢火焰离子检测器(fid)。
40.上述分析物进入飞行时间质谱仪(4)的接口温度为230-250℃。飞行时间质谱仪(ggt 0620)选择电子轰击源(ei)(13)，灯丝发射电流150-160μa，电子能量70ev，离子源温度保持在230℃。采集质核比范围为34-350，采集频率为100hz。
41.上述分析物进入氢火焰离子检测器(fid)的温度为280℃，空气和氢气的流速分别为340-350ml/min和40-50ml/min，氮气作为混合气的辅助气，流速为2ml/min。fid的数据采集频率为200hz。
42.与现有技术相比，本发明具有以下优势：
43.(1)该样品气体采集方法受环境空气干扰小；
44.(2)实时监测采样过程中的温度、压力、co2浓度等呼吸参数，确保采样流程的稳定和准确；
45.(3)可以精准控制采集呼吸样品的体积；
46.(4)该方法分离效果好，灵敏度高；
47.(5)该方法定性定量效果准确；
48.(6)该方法检测限低，可以达到ng/l水平；
49.(7)该方法重复性好，稳定性强；
50.(8)该方法前处理简单，容易操作。
附图说明
51.图1为本发明的呼气vocs规范化采集和分析检测流程图示。
52.图2为采样过程呼吸参数变化。
53.图3为某一健康正常人呼吸vocs全二维图谱。
54.图4为采集和分析方法的重复性检验。
55.图中标号：1-呼吸采样器，2-热脱附仪，3-全二维气相色谱仪，4-飞行时间质谱，5-加热阀，6-冷阱，7-进样口，8-一维色谱柱，9-调制器，10-二维色谱柱，11-分流器，12-氢火焰离子(fid)检测器，13-ei离子源，14-无场漂移管，15-mcp检测器。
具体实施方式
56.为了使本技术领域人员更好地理解本技术中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例限制。
57.实施例1：健康正常人呼吸气采集和分析
58.严格遵守本发明呼气vocs采集流程收集健康正常人呼气样品(图1)。将在120℃下烘2.5h的硅胶面罩置于采样器中，取两根老化后的吸附管插入采样器抽气泵左侧两孔，两根废吸附管插入右侧两孔，将采样设备与控制软件相连接，开启供气装置后，再将面罩紧扣在受试者口鼻区。软件通过面罩内温度、压力和co2浓度的实时变化情况学习受试者呼吸模式和监测采样进度(图2)，约30s后开始以200ml/min的流速将呼出气抽入吸附管中。采样装置内的流量计准确计算累计采样体积，总体积达到3l后采样结束(图2a)。每个采样周期，面罩内的温度逐步稳定上升(图2b)，说明面罩紧扣没有漏气，且采样过程面罩没有发生显著移位。环境温度上升速度较快的原因可能是抽气泵稳定工作发热。面罩中的压力和co2含量呈潮汐式变化(图2c-d)，压力和co2同步上升表明受试者在呼气。反之，则表明受试者在吸气。压力和co2的变化可用于学习受试者的呼吸模式。采样结束后，将面罩从受试者口鼻区取下，拔出吸附管，用黄铜帽盖住两端，样品放入低温箱中保存，带回实验室前处理。
59.从低温箱中取出的吸附管在常温下回温10min后，以100ml/min的流速吹入氮气，除去吸附管中的水汽。除水后的吸附管用进样针注射1μl内标，后继续用氮气吹2min，确保内标完全吸附在吸附剂上。
60.加标后的样品可直接在td-gc
×
gc-tof ms/fid仪器上机分析。
61.样品先在热脱附仪上解析附，预吹扫1min后，预浓缩的样品在300℃热脱附5min，用氮气将解析的目标化合物吹入低温冷阱(30℃)。待化合物富集后，吹扫气将上方残余水汽吹脱(1min)。冷阱重新加热至300℃，保持5min。释放的vocs在氦气流下，以不分流方式通过180℃传输线进入全二维气相色谱中。
62.全二维气相色谱的一维柱采用中极性db-624柱子，二维柱采用高极性db-wax柱子，以氦气作为载气，流速分别恒定在为0.6ml/min和23.67ml/min。柱温箱升温程序为：初始温度为50℃，保持5min，然后以6℃的速度升到140℃，再以10℃的速度升到220℃，保持30min。低温调制器的温度为30℃，调制周期为3s(载荷时间为2.799s，注射时间为0.201s)。分离后的vocs以18:2(fid:ms)的分流比进入tof ms和fid。
63.飞行时间质谱仪条件：电子轰击源，灯丝发射电流150μa，电子能量70ev，离子源温度230℃，接口温度250℃，采集质核比范围34-350，采集速率100hz。
64.fid的温度为280℃，数据采集频率为200hz。
65.如图3所示为某健康正常人呼气vocs的全二维图谱，表明通过本发明可以获得500多种含量不一的挥发性化合物。通过nist谱库对比，确定各种目标物的化学身份。图中通过软件自动积分，获得各化合物的峰面积。可根据科研需要，选取特定化合物通过内标校正和标准曲线对化合物进行准确定量。图3中标明了100种出现频率大于60％的呼气vocs，其具体的名称列于下方表格中。
66.实施例2：方法性能检验
67.通过连续采集同一个人的4次呼吸样品，评估采集和分析方法的重复性。平行样品中，7种挥发性不同的化合物和内标氯苯-d5的峰面积如图4所示。结果表明，所发明的采集和分析方法的重复性较好，各化合物的相对标准偏差(rsd)可控制在10％以内。
68.选择36种出现率较高的化合物配制不同浓度(0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200μg/ml)的标准品溶液。在老化后的吸附管内注射1μl标准品溶液，氮吹30s后再加入1μl内标溶液，继续氮吹2min，充分吸附标准品溶液的吸附管与呼吸样品的上机分析条件一致。通过软件自动识别不同浓度下的标准品峰面积，基于低浓度端的信噪比，确定方法检出限(lod)和定量检出限(lqd)，计算公式如下式1和2所示。
[0069][0070][0071]
式中，指信噪比，可通过软件自动计算获得。
[0072]
使用内标峰面积对化合物峰面积进行归一化，消除仪器波动产生的干扰。以归一化后的相对浓度为纵坐标，相对应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。通过标曲换算成呼气中的实际浓度的计算公式如式3所示。
[0073][0074]
式中，表示某种vocs的呼气浓度，ng/l；表示样品中某种vocs对应的标准品浓度，μg/ml。
[0075]
36种目标化合物的线性、lod和lqd如表1所示。由于fid的灵敏度和定量效果更好，优先考虑使用fid定量。若化合物受到溶剂影响，fid信号干扰较大，则考虑使用质谱定量。表中化合物标准品的线性范围已经转化对应呼气中的浓度。由表可知，本发明对呼气中痕量vocs分析具有良好的灵敏度和线性，对不同量级的化合物适应性也较强。
[0076]
表1，出现率较高的34种呼气vocs的线性、lod和lqd
[0077]
[0078]