一种稳定性强的活化凝血测定试剂的制作方法

1.本发明涉及医学检验技术领，尤其涉及一种稳定性强的活化凝血测定试剂。


背景技术：

2.凝血是机体内各类促凝系统与纤溶系统互相调节、互相平衡的结果。一旦机体组织受到外界有害因素侵袭时，其黏膜屏障功能就会受损，导致大量凝血物质被释放于机体血液中，影响了机体促凝系统与纤溶系统的平衡，从而导致机体凝血功能异常的发生。
3.目前凝血检测常见的有凝血四项、血栓弹力图。凝血四项检测包括凝血酶原时间(prothrombin time，pt)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastintime，aptt)、凝血酶时间(thrombin time，tt)和纤维蛋白原(fibrinogen，fib)，是临床上常用的凝血功能初筛的检测试验。凝血四项检测需要将血液离心，仅从血浆对血液凝固问题进行分析，不能反映血小板在止血过程中的重要作用，亦不能动态观察血栓形成及纤维蛋白溶解过程。
4.血栓弹力图实验(thrombelastography，teg)是1948 年由德国人hartert发明的一种通过采集全血样本测定凝血功能，原理是基于凝血过程的最终结果是形成血凝块，而血凝块的物理特性(形成速率、血凝块强度和稳定性) 决定是否具有正常凝血功能。利用血栓弹性扫描仪描述整个凝血的动态过程，从而模拟机体内的凝血全过程，该检测结果受各成分间的相互作用，能更真实的反映机体的凝血功能。teg的主要参数有：
①
r值：指血样置入teg开始到第一块纤维蛋白凝块形成所需的时间；
②
k值：从r时重点到描记幅度达到20mm所需要的时间，反映血凝块形成的速率，其中以纤维蛋白的功能为主；
③
angle值：描记图最大曲线弧度的切线与水平线的夹角，代表血凝块形成的速率；
④
ma值：最大振幅，用于评估已形成的血凝块的最大强度或硬度，主要反映血小板聚集功能。与传统的凝血检测指导临床输血相比，使用血栓弹力图作为输血指导的实验组，能够显著降低新鲜冰冻血浆的输注。表明血栓弹力图性价比高并且在临床上表性优于传统的凝血功能检测，血栓弹力图的检测结果来综合评估患者的凝血全貌，指导成分血的输注。
5.目前国内血栓弹力图活化凝血试剂检测主要是与 haemonetics teg5000作为参比系统，其主要原理是：teg 分析仪监测血凝块的某一物理性质，即切应力：因此，它对所有影响血凝块的结构或速率及其溶解的细胞和血浆成份之间的相互作用均很敏感。活化凝血检测试剂通过表面激活机制激发内源凝血途径(
ⅻ
因子)，使血样发生凝固。随着血凝块的形成、回缩和/或溶解，电脑控制的teg分析仪自动记录这些血样(全血、血浆、富含血小板的血浆) 的动力学变化。因此，形成的凝血图是检测血凝块的形成、溶解及血凝块凝血功能的动态变化。
6.以高岭土作为激活剂，主要用于评估凝血全貌和判断凝血状态，指导成分输血，判断促凝和抗凝等药物的疗效及评估患者血栓发生几率，预防手术后的血栓发生；但是现有的高岭土激活剂装量极低，只有40μl甚至10μl，很容易挥发，只能储存在密封性要求极高的试剂瓶(冻存管)，一旦高岭土激活剂在储存过程中出现挥发的情况，则将其应用至检测中
会直接导致r值延长，影响检测效果。


技术实现要素：

7.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种稳定性强的活化凝血测定试剂。本发明的一种实施例解决其技术问题所采用的技术方案是：
8.一种稳定性强的活化凝血测定试剂，包括：
9.高岭土激活剂，体积按1l计算，原料成分包括：
10.30-60mmol氯化钠、10-50mmol三羟甲基氨基甲烷、0.1％-0.8％高岭土、0.001％-0.015％磷脂、0.5-2mlop-10、0.1-1mltritonx-100、0.1-0.5g聚谷氨酸、0.5-2mlproclinic300、余量纯水；
11.凝血触发剂，体积按1l计算，原料成分包括：
12.0.1-0.5mol氯化钙以及余量纯水。
13.优选的，所述高岭土激活剂包括50mmol氯化钠、20mmol三羟甲基氨基甲烷、0.2％高岭土、0.008％合成磷脂、1mlop-10、0.5mltritonx-100、0.2g聚谷氨酸、0.5mlproclin300、余量纯水；
14.所述凝血触发剂包括0.2mol氯化钙以及余量纯水。
15.优选的，高岭土激活剂制备工艺如下：
16.s1：量取纯水至三角瓶中，并加入氯化钠、三羟甲基氨基甲烷搅拌溶解均匀，调节ph至7.4，制成预处理液；
17.s2：量取200ml上述预处理液加入至反应瓶，加入高岭土搅拌溶解，得第一处理物；
18.s3：量取200ml上述预处理液加入至反应瓶，加入磷脂搅拌溶解，得第二处理物；
19.s4：剩余的预处理液加入op-10、tritonx-100、聚谷氨酸、proclin300溶解完全；
20.s5：将第一处理物、第二处理物投入步骤s4所制备的溶液中并搅拌均匀，制得高岭土激活剂；
21.凝血触发剂制备工艺如下：
22.用量筒量取纯水至三角瓶中，加入氯化钙并搅拌均匀，制得凝血触发剂。
23.相比现有技术，本发明的有益效果是：
24.1、上述各原料成分之间配伍形成的高岭土激活剂具有高稳定性能的优点，解决了需要极高密封性能的冻存管才能防止高岭土激活剂挥发的问题。
25.2、本发明利用op-10与tritonx-100之间的协同作用对磷脂进行分散，分散后的磷脂与水分子形成胶束，形成双亲结构，双亲结构可进一步防止水分的挥发。
26.3、聚谷氨酸与高岭土复配后，聚谷氨酸能改进高岭土的蓬松度、空隙度，从而改善高岭土的保水能力，进而减少水分的蒸发。
附图说明
27.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
28.图1为基准试剂与对比试剂的r值数据拟合图；
29.图2为基准试剂与本发明试剂的r值数据拟合图；
30.图3为基准试剂与对比试剂的angle值数据拟合图；
31.图4为基准试剂与本发明试剂的angle值数据拟合图；
32.图5为基准试剂与对比试剂的ma值数据拟合图；
33.图6为基准试剂与本发明试剂的ma值数据拟合图。
具体实施方式
34.如下结合具体实施例，对本技术方案作进一步描述：
35.实施例
36.高岭土激活剂(按体积分数1l计算)
37.50mmol氯化钙、20mmol三羟甲基氨基甲烷、0.2％高岭土、0.008％合成磷脂、1mlop-10、0.5ml tritonx-100、0.2g 聚谷氨酸、0.5mlproclin300、余量纯水；
38.凝血触发剂(按体积分数1l计算)
39.0.2mol氯化钙以及余量纯水。
40.高岭土激活剂制备工艺：
41.s1：量取纯水至三角瓶中，并加入氯化钠、三羟甲基氨基甲烷搅拌溶解均匀，用盐酸调节ph值至7.4
±
0.2，制成预处理液；
42.s2：量取200ml上述预处理液加入至反应瓶，加入高岭土搅拌1小时溶解，得第一处理物；
43.s3：量取200ml上述预处理液加入至反应瓶，加入磷脂搅拌30分钟溶解，得第二处理物；
44.s4：剩余的预处理液加入op-10、tritonx-100、 proclin300、聚谷氨酸搅拌20分钟溶解完全；
45.s5：将第一处理物、第二处理物投入步骤s4所制备的溶液中并搅拌均匀，按每瓶40μl进行分装，要求边搅拌边分装，制得高岭土激活剂；
46.凝血触发剂制备工艺：
47.用量筒量取纯水加到三角瓶中，后将0.2mol氯化钙加入到三角瓶中搅拌溶解均匀，按每瓶1ml进行分装，制得凝血触发剂。
48.对比试剂(按体积分数1l计算)：
49.50mmol氯化钠，20mmol三羟甲基氨基甲烷，0.2％高岭土，0.01％脑磷脂，1mlop-10，0.5mltritonx-100， 0.5mlproclin300、余量纯水。
50.高岭土激活剂制备工艺：
51.s1：量取纯水至三角瓶中，并加入氯化钠、三羟甲基氨基甲烷搅拌溶解均匀，用盐酸调节ph值至7.4
±
0.2，制成预处理液；
52.s2：量取200ml上述预处理液加入至反应瓶，加入高岭土搅拌1小时溶解，得第一处理物；
53.s3：量取200ml上述预处理液加入至反应瓶，加入脑磷脂搅拌30分钟溶解，得第二处理物；
54.s4：剩余的预处理液加入op-10、tritonx-100、 proclin300搅拌20分钟溶解完全；
55.s5：将第一处理物、第二处理物投入步骤s4所制备的溶液中并搅拌均匀，按每瓶40
μl进行分装，要求边搅拌边分装，制高岭土激活剂；
56.凝血触发剂配方(1l)为：0.2mol氯化钙以及余量纯水。
57.凝血触发剂制备工艺：用量筒量取纯水加到三角瓶中，后将氯化钙加入到三角瓶中搅拌溶解均匀，按每瓶1ml进行分装，制得凝血触发剂。
58.检测使用方法：
59.在检验操作前，应先阅读相应血栓弹力图仪的使用说明书，熟悉仪器的操作流程。
60.(1)开始检测前，将凝血触发剂和高岭土激活剂从 2℃～8℃环境中取出，放置室温下平衡15-20分钟；
61.(2)打开高岭土激活剂瓶盖，移取1.0ml枸橼酸钠 (1:9)抗凝全血样本加入试剂瓶中，拧好盖子，轻轻颠倒 5次使血样与高岭土激活剂混合均匀，静置4分钟激活血液。
62.(3)装载样品杯到血栓弹力图杯槽中，移取20μl凝血触发剂至样品杯底；
63.(4)激活完成，移取340μl混合血样，加到样品杯中。
64.(5)将杯槽轻轻上移至测试位置，将控制杆向右推至测试位置，点击“开始”测试；
65.(6)运行样本测试，直到需要的参数确定，在软件界面上点击“停止”。
66.实验设计及结果
67.对比试剂：将所述试剂置于37℃恒温箱中进行7天耐热实验后取出，teg5000血栓弹力图仪对80例枸橼酸钠 (1:9)抗凝全血样本分别与对比试剂进行测试，评估方法按照nccls文件ep9-a3(美国国家临床实验室标准委员会文件批准指南-第三版-用患者标本进行方法比对偏倚评估)规定的进行。
68.本发明试剂：即对应实施例制备成的测定试剂，制备完成后的试剂置于37℃恒温箱中进行7天耐热实验后取出，teg5000血栓弹力图仪对80例枸橼酸钠(1:9)抗凝全血样本分别与对比试剂进行测试，评估方法按照nccls 文件ep9-a3(美国国家临床实验室标准委员会文件批准指南-第三版-用患者标本进行方法比对偏倚评估)进行。
69.基准试剂：选自haemonetics corporation生产的活化凝血检测试剂盒(凝固法)，其生产日期距离实验时间不超过9个月，teg5000血栓弹力图仪对80例枸橼酸钠 (1:9)抗凝全血样本分别与基准试剂进行测试，评估方法按照nccls文件ep9-a3(美国国家临床实验室标准委员会文件批准指南-第三版-用患者标本进行方法比对偏倚评估)进行。
70.表1以及表2为对比试剂、本发明试剂、基准试剂测得的r、k、angle、ma数据，以及对比试剂与基准试剂的绝对误差、本发明试剂与基准试剂的绝对误差。
71.表1
72.73.[0074][0075]
表2
[0076]
[0077]
[0078]
[0079][0080]
由表1与表2实验结果可得：
[0081]
r值：由对比试剂与基准试剂绝对误差可得，市场上的对比试剂与基准试剂的r值绝对误差范围在 0.7-2.6min，本发明试剂与基准试剂的r值绝对误差范围在0.1-0.7min，则本发明试剂的r值更接近基准试剂的r 值。
[0082]
k值：由对比试剂与基准试剂绝对误差可得，市场上的对比试剂与基准试剂的k值的绝对误差范围在 0-0.9min，本发明试剂与基准试剂的k值的绝对误差范围在0.1-0.4min，本发明试剂的k值更接近基准试剂的k值。
[0083]
angle值：由对比试剂与基准试剂绝对误差可得，市场上的对比试剂与基准试剂的angle值的绝对误差范围在 0.5-8.5
°
，本发明试剂与基准试剂的angle值的绝对误差范围在0.2-2.6
°
，本发明试剂的angle值更接近基准试剂的angle值。
[0084]
ma值：由对比试剂与基准试剂绝对误差可得，市场上的对比试剂与基准试剂的ma值的绝对误差范围在 0.2-5.6mm，本发明试剂与基准试剂的ma值的绝对误差范围在0-2mm，本发明试剂的ma值更接近基准试剂的ma值。
[0085]
由上述实验结果可知，本发明试剂与基准试剂的多种实验数据的绝对误差均小于对比试剂与基准试剂的多种实验数据的绝对误差，则本发明试剂相对对比试剂具有更优异的稳定性。
[0086]
除上述实验外，本技术以基准试剂的测试结果作为横坐标，以对比试剂、本发明试剂的测试结果作为纵坐标，通过origin软件做线性回归，选择r、angle、ma进行比较相关性，相关性的结果如图1-6所示，相关系数r2的如下表所示：
[0087][0088]
结合上表相关系数r2的数据以及图1-6可得，本发明试剂与基准试剂相关系数r2的数值均大于对比试剂与基准试剂的相关系数r2，所以本发明试剂与基准试剂两个变量的线性相关性强于对比试剂与基准试剂两者变量的线性相关性，本发明试剂的r、angle、ma值更接近基准试剂的r、 angle、ma值，基于上述分析可知本发明试剂的稳定性优异于对比试剂的稳定性。