一种DNA自组装体原子力显微镜检测方法与流程

一种dna自组装体原子力显微镜检测方法
技术领域
1.本发明涉及原子力检测技术领域，具体涉及一种dna自组装体原子力显微镜检测方法。


背景技术：

2.dna自组装体（dna self-assembly）是 dna 分子在非共价的氢键、范德华力等作用下，依照碱基互补配对原则（a-t 和 g-c），自下而上组装成各种纳米结构，包括纳米线、纳米管、组装体、纳米球等。研究表明，一般的dna由于负电性进入细胞遇到障碍，但dna 纳米自组装体因其结构类似病毒，能够以内吞的方式进入细胞，并且不易被细胞内的酶降解。小干扰rna（small interfering, sirna）可以通过靶向结合mrna来降低相关基因的表达水平。sirna在体内易被核酸酶降解，相对较高的分子量、负电荷和亲水性使其不易透过细胞膜。sirna在肾脏中聚集随尿液排出体外，及网状内皮系统捕获无法发挥作用。限制了其在肿瘤治疗方面的应用前景。利用dna自组装体来递送sirna，与结合穿膜肽有效打破血脑屏障，高效递送sirna药物实现基因治疗促进肿瘤细胞凋亡。
3.sirna的形貌表征受其尺寸限制难以表达。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种dna自组装体原子力显微镜检测方法。
5.本发明目的通过以下方案实现：一种dna自组装体原子力显微镜检测方法，包含以下步骤：步骤一：制备sirna/dna组装体纳米材料，将dna 组装体的每条组装链上分别与sirna基因片段结合；步骤二：原子力显微镜表征sirna/dna组装体纳米材料的形貌的方法，具体为：（1）将试样sirna/dna组装体沉积在基底上，对基底进行修饰使生物组装体与基底所带电性相反，并用纯水清洗，氮气氛吹干；（2）安装探针；（3）调节激光：将激光光斑打至悬臂前端位置；（4）调节四象限检测器：调整head后部反光镜，使sum值最大；（5）将样品固定在样品托（如：不锈钢小圆片）上，并将样品托放入样品台上；（6）根据所选探针的探针盒上的参数f0范围填写start frequency 和 end frequency，单击auto tune选项寻找共振峰后退出tuning界面；（7）进针：调节scan size（扫描大小），选择合适的扫描范围，观察height 图中 trace 和 retrace 两条曲线的重合情况，在tapping模式下，调节amplitude setpoint直到trace和retrace两条扫描线基本一致，优化 integral gain 和 proportional gain，调节扫描范围和扫描速率，并拍照，取得通过原子力显微镜在液相轻敲模式下表征sirna/dna组装体纳米颗粒形貌结构。
6.本发明为实现sirna的有效递送，制备的sirna/dna组装体纳米颗粒，通过原子力显微镜在液相轻敲模式下表征sirna/dna组装体纳米颗粒形貌结构。
7.本发明通过sirna与dna组装体的结合得到sirna/dna组装体纳米材料。原子力显微镜由于其高精度，环境扫描更适合测试生物样本。原子力显微镜轻敲模式下，处于振动状态的探针针尖对样品表面进行敲击，振幅随样品表面形貌的起伏而变化。与非接触模式相比，轻敲模式下针尖与样品的间距更小，可维持微悬臂在设定振幅值振荡，检测针尖与样品表面之间的作用力。消除对样品造成的损伤并降低图像分辨率的横向力影响，扫描速度适中。液相下测量有助于生物组装体在原液中保持固有形貌，因此在液相中测得的形貌更接近于真实形貌。
8.进一步的，步骤二中，所述的基底需与sirna/dna组装体所带电荷电性相反，当采用云母作为基底时，因其与sirna/dna组装体所带电荷电均为负电性，因此，将云母或sirna/dna组装体溶液中加入带正电荷的离子。
9.优选的，步骤二中，所述的探针为 v 型氮化硅悬臂梁的探针。
10.本发明优越性在于：本发明方法制备的sirna/dna组装体纳米材料，通过原子力显微镜在液相轻敲模式下表征sirna/dna组装体纳米颗粒形貌结构。可消除探针对样品造成的损伤并降低图像分辨率的横向力影响，扫描速度适中。同时液相模式有助于生物组装体在溶液状态下保持固有形貌，因此得到的形貌更接近于真实形貌。
附图说明
11.图1是实施例1sirna/dna的原子力显微镜afm图。
具体实施方式
12.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
13.制备sirna/dna组装体纳米材料：采用现有技术将dna 组装体的每条组装链上分别与sirna基因片段，得到试样sirna/dna组装体纳米颗粒。
14.实施例1原子力显微镜表征sirna/dna组装体纳米材料的形貌，按下述步骤：（1）将试样sirna/dna组装体沉积在基底上：对sirna/dna进行修饰使生物组装体与基底所带电性相反，首先，将3.5mmol／l mgcl2缓冲溶液稀释sirna/dna溶液至1 ng/μl；取100μl该溶液至新解离的云母上，沉积30min，用纯水清洗，氮气氛吹干；（2）安装探针：选择 v 型氮化硅悬臂梁的探针；（3）调节激光：将激光光斑打至悬臂前端位置；（4）调节四象限检测器：调整head后部反光镜，使sum值最大；（5）将样品固定在样品托不锈钢小圆片上，并将该样品托放入样品台上；（6）根据所选探针的探针盒上的参数f0范围填写start frequency 和 end frequency，单击auto tune选项寻找共振峰后退出tuning界面；
（7）进针：调节扫描大小（scan size），选择合适的扫描范围，观察height 图中 trace 和 retrace 两条曲线的重合情况；在tapping模式下，调节amplitude setpoint直到trace和retrace两条扫描线基本一致；优化 integral gain 和 proportional gain，调节扫描范围和扫描速率，并拍照，sirna/dna的原子力显微镜afm图见图1所示，取得表征sirna/dna组装体纳米材料的形貌结构。
15.实施例2原子力显微镜表征sirna/dna组装体纳米材料的形貌，按下述步骤：（1）将试样sirna/dna组装体沉积在云母基底上：先对云母基底修饰，产生一个带正电的表面，将带负电的sirna/dna组装体束缚在其表面，通过使用被稀释的0.1%多聚赖氨酸（pll）使云母基底表面带正电；0.1%多聚赖氨酸的制备过程如下：将0.1%的pll与过滤后的去离子水以1：10的比例混合(例如添加0.5 ml的pll到4.5 ml的去离子水中)，使用干净的玻璃器皿稀释和旋涂，将该稀释溶液存储在 4℃的冰箱中以备用；将云母基底在室温下完全浸在稀释的pll中，为减少蒸发可用玻璃盘罩在外面，30 min后取出该云母，用纯水清洗，氮气氛吹干；然后，解离云母片得到新的一层云母面，用移液器取约10μl稀释sirna/dna溶液滴在表面，sirna/dna组装体溶液被均匀地分布在表面上，沉积3 min后，用约200μl纯水冲洗；（2）安装探针：选择 v 型氮化硅悬臂梁的探针；（3）调节激光：将激光光斑打至悬臂前端位置；（4）调节四象限检测器：调整head后部反光镜，使sum值最大；（5）将样品固定在样品托不锈钢小圆片上，并将样品托放入样品台上；（6）根据所选探针的探针盒上的参数f0范围填写start frequency 和 end frequency，单击auto tune选项寻找共振峰后退出tuning界面；（7）进针，调节扫描大小（scan size），选择合适的扫描范围，观察height 图中 trace 和 retrace 两条曲线的重合情况；在tapping模式下，调节amplitude setpoint直到trace和retrace两条扫描线基本一致；优化 integral gain 和 proportional gain，调节扫描范围和扫描速率，并拍照，取得表征sirna/dna组装体纳米材料的形貌结构。
16.实施例3首先制备sirna/dna四面体纳米材料：将dna 四面体的每条组装链上分别与sirna基因片段结合；原子力显微镜表征sirna/dna四面体纳米材料的形貌，按下述步骤：（1）将试样sirna/dna四面体体沉积在基底上：对基底进行修饰使生物组装体与基底所带电性相反，先将3.5mmol／l mgcl2缓冲溶液稀释sirna/dna溶液至1 ng/μl；取100μl该溶液至硅片基底上，沉积20min，用纯水清洗，氮气氛吹干；（2）安装探针：选择 v 型氮化硅悬臂梁的探针；（3）调节激光：将激光光斑打至悬臂前端位置；（4）调节四象限检测器：调整head后部反光镜，使sum值最大；（5）将样品固定在样品托不锈钢小圆片上，并将样品托放入样品台上；（6）根据所选探针的探针盒上的参数f0范围填写start frequency 和 end frequency，单击auto tune选项寻找共振峰后退出tuning界面；
（7）进针：调节扫描大小（scan size），选择合适的扫描范围，观察height 图中trace 和 retrace 两条曲线的重合情况；在tapping模式下，调节amplitude setpoint直到trace和retrace两条扫描线基本一致；优化 integral gain 和 proportional gain，调节扫描范围和扫描速率，并拍照，取得表征sirna/dna四面体纳米材料的形貌结构。