一种白花泡桐叶的气质联用指纹图谱鉴别方法

1.本发明属于中药材质量控制技术领域，具体涉及一种白花泡桐叶的气质联用指纹图谱鉴别方法。


背景技术：

2.白花泡桐（paulownia fortunei (seem.) hemsl.）为玄参科泡桐属落叶乔木，在我国10多个省市均有分布。白花泡桐作为一种优质的速生木材，其除了广泛地应用于工农业生产外，还是一种常用的中药材，泡桐的花、叶、皮、根、果均可入药。本草纲目对白花泡桐各个部位的药理作用做了详细记载，现代医学研究表明白花泡桐具有抑菌，消炎，抗肿瘤甚至还有杀虫的作用。白花泡桐树枝繁叶茂，叶片的数量巨大，是一笔丰富的资源。用白花泡桐叶作饲料，不仅能促进动物生长，而且能提高动物抗病能力。医疗方面的价值可以体现在治疗痈疽、疔疮、创伤出血等，白花泡桐叶具有重要的经济价值和社会价值。
3.由于泡桐属植物叶片相似度高，特别是中药材经过炮制、切片和打成粉末后通过肉眼难以区分，目前并没有有效的方法对炮制、切片和打成粉末后的白花泡桐叶进行鉴定。


技术实现要素：

4.为克服现有技术的不足，本发明通过大量实验和研究，提出一种白花泡桐叶的气质联用指纹图谱鉴别方法。
5.本发明的白花泡桐叶hplc指纹图谱鉴别方法采取以下步骤：（1）样品溶液的制备：分别称取白花泡桐叶和待鉴别样品适量，粉碎，过三号筛，精密称定0.5 g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入石油醚15 ml，密塞，于40 ℃超声处理（功率500 w，频率40 khz）30 min，减压蒸干，以10 ml色谱正己烷溶解，加入适量的无水硫酸钠干燥，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，分别制得白花泡桐叶样品溶液和待鉴别样品溶液。
6.（2）gc/ms图谱的收集：分别对白花泡桐叶样品溶液和待鉴别样品溶液进行gc/ms检测并记录其指纹图谱，色谱条件为：gc条件：sh-rtx-5ms气相色谱柱(30.0 m
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0.25 mm，0.25 μm) ；载气高纯氦气(纯度＞99. 99%)；载气体积流量0.94 ml/min；进样口温250 ℃；初始温度100 ℃，恒温2 min，以10 ℃/min速率升至200 ℃，恒温5 min，以5 ℃/min速率升温至280 ℃，恒温20 min；进样量1.0 μl；分流比为1：10；质谱条件：离子源为ei 源；离子源温度为230 ℃；接口温度为250 ℃；电离能量为70 ev；溶剂延迟3 min；扫描质量范围m/z 40~550。
7.（3）比对图谱：白花泡桐叶样品的气质联用特征指纹图谱见图1，待鉴别样品gc/ms图谱中应呈现12个共有峰，并与白花泡桐叶gc/ms图谱中的12个共有峰相对应，其中峰5与白花泡桐叶gc/ms图谱中的保留时间一致，其中12个共有峰分别为2(4h)-benzofuranone, 5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimethyl-（共有峰1）、植醇（共有峰2）、乙酸十七酯（共有峰3）、2-甲基二十八烷（共有峰4）、角鲨烯（共有峰5）、二十九烷（共有峰6）、三十烷（共有峰
7）、三十六烷（共有峰8）、三十九烷（共有峰9）、生育酚（共有峰10）、四十烷（共有峰11）、β-谷甾醇（共有峰12）, 并且在保留时间为7.273 min（1,7-octadien-3-ol, 3,7-dimethyl-）、26.404 min（9,12-octadecadienoyl chloride, (z,z)-）、32.363 min（phthalic acid, bis(7-methyloctyl) ester）、39.362 min（campesterol）有特征峰；满足这些特征的待鉴别样品认定为白花泡桐叶，否则不能被认定为白花泡桐叶。
8.本发明是建立在对白花泡桐叶提取液的gc/ms色谱条件和指纹谱图大量研究的基础上的，耗费了大量的精力和创造性劳动，其过程如下：色谱条件的考察：我们从以下四个方面对色谱条件进行考察：分流比考察、程序升温考察、柱前压与流速考察、进样口温度考察。
9.分流比考察：分别考察了分流比1:10、1:20、1:50对于白花泡桐叶石油醚部位gc-ms色谱图的影响。实验研究表明在分流比1:10的条件下得到的图谱较为理想。因此选择分流比为1:10。
10.程序升温考察：对以下三种程序升温进行考察。比较不同程序升温方法，当采用方法3时，共能检测出 17 个峰，各色谱峰分离达到最佳效果，所以将此升温程序确立为 gc 程序升温方法。
11.方法1：初始温度60 ℃，恒温5 min，以8 ℃ /min 速率升至160 ℃，恒温5 min，以12 ℃ /min 速率升温至280 ℃，恒温20 min。
12.方法2：初始温度120 ℃，恒温3 min，以12 ℃ /min 速率升至220 ℃，恒温5 min，以5 ℃ /min 速率升温至280 ℃，恒温10 min。
13.方法3：初始温度100 ℃，恒温2 min，以10 ℃ /min 速率升至200 ℃，恒温5 min，以5 ℃ /min 速率升温至280 ℃，恒温20 min。
14.柱前压与流速考察：分别考察了在三种不同柱前压下60 kpa、70 kpa、80 kpa条件下进行gc-ms分析。比较可知柱前压为70 kpa所对应的流速为0.94 ml/min时，各主要成分色谱峰的分离效果较好，故本实验确定柱前压为70 kpa，流速为0.94 ml/min。
15.进样口温度考察：分别考察了进样口温度250 ℃、270 ℃、290 ℃对于白花泡桐叶石油醚部位gc-ms色谱图的影响。在其它的色谱条件一致的情况下，三种进样口温度下，白花泡桐叶石油醚部位中7种主要成分相对含量的rsd值均较小，说明主成分的相对含量几乎无差别，同时各主要色谱峰的分离效果姣好。在能满足汽化需要的前提下，应尽量选择较低温度，确定进样口温度为 250 ℃。
16.因此，色谱条件确定为：gc条件：sh-rtx-5ms气相色谱柱(30.0 m
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0.25 mm，0.25 μm) ；载气高纯氦气(纯度＞99. 99%)；载气体积流量0.94 ml/min；进样口温250 ℃；初始温度100 ℃，恒温2 min，以10 ℃/min速率升至200 ℃，恒温5 min，以5 ℃/min速率升温至280 ℃，恒温20 min；进样量1.0 μl；分流比为1：10。质谱条件：离子源为ei 源；离子源温度为230 ℃；接口温度为250 ℃；电离能量为70 ev；溶剂延迟3 min；扫描质量范围m/z 40~550。
17.样品提取方法的考察：提取方式考察了超声提取、索式提取两种方法，结合石油醚提取物中7种主要成分峰面积结果，两种提取方法中，超声提取法各主要成分的峰面积略大于索式提取，故选之。
18.料液比的考察：取白花泡桐叶适量，粉碎，过三号筛，精密称取三份0.5 g细粉，置
于具塞锥形瓶中，分别加入石油醚5 ml、10 ml、15 ml，于40 ℃下超声处理（功率500 w，频率40 khz）30min，减压蒸干，以10 ml色谱正己烷溶解，加入适量的无水硫酸钠干燥，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。结合石油醚提取物中7种主要成分峰面积结果，三种料液比中，1:30的料液比中各共有峰的峰面积略大于其他两种料液比，最终选定1:30作为提取料液比。
19.提取时间的考察：取白花泡桐叶适量，粉碎，过三号筛，精密称取三份0.5 g细粉，置于具塞锥形瓶中，加入石油醚15 ml，于40 ℃下分别超声处理（功率500 w，频率40 khz）30 min、40 min、60 min，减压蒸干，以10 ml色谱正己烷溶解，加入适量的无水硫酸钠干燥，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。结合石油醚提取物中7种主要成分峰面积结果，不同提取时间中，提取30 min时各共有峰的峰面积略大于其他两种提取时间，最终选定30 min作为提取时间。
20.提取温度的考察：取白花泡桐叶适量，粉碎，过三号筛，精密称取三份0.5 g细粉，置于具塞锥形瓶中，加入石油醚15 ml，分别于30 ℃、40 ℃、50 ℃下超声处理（功率500 w，频率40 khz）30 min，减压蒸干，以10 ml色谱正己烷溶解，加入适量的无水硫酸钠干燥，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。结合石油醚提取物中7种主要成分峰面积结果，三种提取温度中，40 ℃中各共有峰的峰面积略大于其他两种提取温度，最终选定40 ℃作为提取温度。
21.参照物的确定：色谱指纹图谱中必须选择一个峰作为基准峰，其对应的物质称为参照物。在白花泡桐石油醚部位中角鲨烯（5号峰）是出峰面积最大、最稳定的一个峰，可与相邻色谱峰达到较好分离，故确定将其作为本指纹图谱检测标准的参照物。
22.白花泡桐叶气质联用特征指纹图谱研究如下：精密度实验：取白花泡桐叶样品，按照本发明方法连续进样6次，每次进样1
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l，记录其中12个共有色谱峰的保留时间和峰面积。以角鲨烯为参照峰，计算图谱中各个峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算它们之间的值。结果表明，各共有峰相对保留时间rsd均小于0.72%，相对峰面积rsd均小于1.09%，说明仪器精密度良好。
23.重复性实验：取白花泡桐叶样品6份，按照本发明方法制备成供试溶液并分别进样，每次进样1
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l，记录其中12个共有色谱峰的保留时间和峰面积。以角鲨烯为参照峰，计算图谱中各个峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算它们之间的值。结果表明，各共有峰相对保留时间rsd均小于0.87%，相对峰面积rsd均小于2.49%，说明仪器重复性良好。
24.稳定性实验：取白花泡桐叶样品，按照本发明方法制备成同一供试溶液，分别在供试液放置0、2、4、8、12、24 h时进样，每次进样1
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l，照3.2.5项下确定的色谱条件进行测定。记录其中12个共有色谱峰的保留时间和峰面积。以角鲨烯为参照峰，计算图谱中各个峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算它们之间的值。结果表明，各共有峰相对保留时间rsd均小于1.66%，相对峰面积rsd均小于3.81%，说明样品24 h稳定性良好。
25.本发明条件下，对19批白花泡桐叶进行gc/ms 分析，记录各批样品的指纹图谱。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 a版）》对19批白花泡桐叶的指纹图谱进行分析，并筛选出重复性好的色谱峰作为共有峰，分别计算各样品指纹图谱中各共有峰与参照峰的相对峰面积，各样总离子流图见图2。供试品特征图谱中应呈现12个共有峰，并应与对照药材参照物色谱峰中的12个共有峰相对应，其中峰5应与参照物峰保留时间一致，其中12
个共有峰分别为2(4h)-benzofuranone, 5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimethyl-（共有峰1）、植醇（共有峰2）、乙酸十七酯（共有峰3）、2-甲基二十八烷（共有峰4）、角鲨烯（共有峰5）、二十九烷（共有峰6）、三十烷（共有峰7）、三十六烷（共有峰8）、三十九烷（共有峰9）、生育酚（共有峰10）、四十烷（共有峰11）、β-谷甾醇（共有峰12）, 并且在保留时间为7.273 min（1,7-octadien-3-ol, 3,7-dimethyl-）、26.404 min（9,12-octadecadienoyl chloride, (z,z)-）、32.363 min（phthalic acid, bis(7-methyloctyl) ester）、39.362 min（campesterol）有特征峰。
26.白花泡桐叶gc/ms指纹图谱相似度评价：采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 a版）》对采集的19批白花泡桐叶进行相似度评价，计算各批次指纹图谱与对照指纹图谱（r）之间的相似度。结果显示，各批次白花泡桐叶指纹图谱与对照指纹图谱（r）的相似度在0.973~1之间。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明首次利用gc/ms指纹图谱对白花泡桐叶进行质量控制，该方法能稳定、精密、重现地对白花泡桐叶进行质量控制和有效鉴别，填补一项该领域的技术空白。
28.本发明首次公开了白花泡桐叶gc-ms指纹图谱的检测方法，以参照峰的保留时间为1，计算共有峰相对保留时间，得到白花泡桐叶gc-ms指纹图谱或gc-ms特征图谱。该方法确立了白花泡桐叶中12个特征峰，选择角鲨烯作为参照峰，确定了各特征峰的相对保留时间, 确定白花泡桐叶的四个特征峰分别为7.273 min（1,7-octadien-3-ol, 3,7-dimethyl-）、26.404 min（9,12-octadecadienoyl chloride, (z,z)-）、32.363 min（phthalic acid, bis(7-methyloctyl) ester）、39.362 min（campesterol）。本发明提供的白花泡桐叶中脂溶性成分的gc-ms指纹图谱检测方法灵敏度和精密度高，稳定性和重复性好，该方法可以更客观、全面、准确的控制白花泡桐叶中脂溶性成分质量，对保证临床药效具有重要意义。
附图说明
29.图1是白花泡桐叶的气质联用指纹图谱。
30.图2是19批白花泡桐叶石油醚部位的气质联用比对指纹图谱。
31.图3是白花泡桐、兰考泡桐、毛泡桐和台湾泡桐四种泡桐叶气质联用比较图谱。
具体实施方式
32.现结合具体实施例，对本发明进一步具体说明。
33.白花泡桐、兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐的gc-ms指纹图谱鉴定：（1）样品溶液的制备：分别称取白花泡桐叶和待鉴别样品适量，粉碎，过三号筛，精密称定0.5 g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入石油醚15 ml，密塞，于40 ℃超声处理（功率500 w，频率40 khz）30 min，减压蒸干，以10 ml色谱正己烷溶解，加入适量的无水硫酸钠干燥，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，分别制得白花泡桐叶样品溶液和待鉴别样品溶液。
34.（2）hplc图谱的收集：分别对白花泡桐叶样品溶液和待鉴别样品溶液进行gc/ms检测并记录其指纹图谱，色谱条件为：gc条件：sh-rtx-5ms气相色谱柱(30.0 m
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0.25 mm，
0.25 μm) ；载气高纯氦气(纯度＞99. 99%)；载气体积流量0.94 ml/min；进样口温250 ℃；初始温度100 ℃，恒温2 min，以10 ℃/min速率升至200 ℃，恒温5 min，以5 ℃/min速率升温至280 ℃，恒温20 min；进样量1.0 μl；分流比为1：10；质谱条件：离子源为ei 源；离子源温度为230 ℃；接口温度为250 ℃；电离能量为70 ev；溶剂延迟3 min；扫描质量范围m/z 40~550。
35.（3）比对图谱：白花泡桐叶样品的气质联用特征指纹图谱见图1，待鉴别样品gc/ms图谱中应呈现12个共有峰，并与白花泡桐叶gc/ms图谱中的12个共有峰相对应，其中峰5与白花泡桐叶gc/ms图谱中的保留时间一致，其中12个共有峰分别为2(4h)-benzofuranone, 5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimethyl-（共有峰1）、植醇（共有峰2）、乙酸十七酯（共有峰3）、2-甲基二十八烷（共有峰4）、角鲨烯（共有峰5）、二十九烷（共有峰6）、三十烷（共有峰7）、三十六烷（共有峰8）、三十九烷（共有峰9）、生育酚（共有峰10）、四十烷（共有峰11）、β-谷甾醇（共有峰12）, 并且在保留时间为7.273 min（1,7-octadien-3-ol, 3,7-dimethyl-）、26.404 min（9,12-octadecadienoyl chloride, (z,z)-）、32.363 min（phthalic acid, bis(7-methyloctyl) ester）、39.362 min（campesterol）有特征峰；满足这些特征的待鉴别样品认定为白花泡桐叶，否则不能被认定为白花泡桐叶。
36.本发明条件下，白花泡桐、兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐gc/ms比对色谱图见图3（从下到上分别为白花泡桐、兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐）。从四种泡桐对比图谱比较来看，白花泡桐与其他三种泡桐相比有四个特征峰，保留时间为7.273 min的1,7-octadien-3-ol, 3,7-dimethyl-；26.404 min的9,12-octadecadienoyl chloride, (z,z)-；32.363 min的phthalic acid, bis(7-methyloctyl) ester；39.362 min的campesterol。，兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐的gc/ms指纹图谱均不符合白花泡桐叶gc/ms特征指纹图谱的认定条件，将白花泡桐叶区分出来。
37.上述只是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。