一种用于水产养殖底泥孔雀石绿检测的前处理方法与流程

1.本发明涉及渔业环境和水产品质量安全检测分析技术领域，具体涉及一种用于水产养殖底泥孔雀石绿检测的前处理方法。
2.

背景技术：

3.孔雀石绿是水产养殖业一种较为常见的禁用渔药，由于其对预防和治疗水产动物水霉病、小瓜虫病等有特效作用，且无替代渔药可使用，因此仍有部分水产从业者违法使用该药物，造成在水产环境如水体和底泥中的残留。
4.孔雀石绿在使用后易被快速还原为隐色孔雀石绿，残留在水产养殖底泥中，并很难被完全降解。据调查，在孔雀石绿被使用后的两年内，仍能在底泥环境中阳性检出。水产从业者在开始下年度养殖工作时会存在养殖环境不合格的担忧，特别是养殖水域刚从上一个养殖户手上流转过来不清楚背景时。检测底泥孔雀石绿、评估养殖前的环境合格性已经成为水产从业者、行业监管者的日常工作重点任务。
5.目前水产养殖底泥孔雀石绿的检测主要存在的问题并不在检测仪器（高效液相色谱或质谱联用）的使用，也不是高灵敏性快速检测卡（抗原免疫层析法或荧光免疫法）的开发，因为针对水产养殖水体或水产品中孔雀石绿检测方法的文章和专利报道已经很多，只需要对底泥孔雀石绿进行前处理提取净化，获得有效的提取液即可与已有仪器或快速检测技术相兼容。
6.然而，恰恰是底泥孔雀石绿的前处理技术出现了重大难题，目前仍无法提供一个高提取效率和高稳定性的前处理方法。虽然国家行业主管部门已颁布行业标准（sc/t 9435-2019）作为水产养殖环境底泥中孔雀石绿的检测依据，但仍存在如下问题：底泥来源多样，没有专门统一处理步骤，造成后续提取效率不稳定；提取剂与转化剂是将孔雀石绿还原成隐色孔雀石绿造成提转化不稳定；净化液在有机相中保存无法与适用于水相的各类快速检测方法相兼容。
7.

技术实现要素：

8.解决的技术问题：针对现有技术中行业中标准和其它使用过程中存在的底泥孔雀石绿前处理难的问题，本发明提供一种用于水产养殖底泥孔雀石绿检测的前处理方法，能够克服以往行业标准中提取效率或高或低不稳定的缺点，也能够保证该提取液既适用于有机相的仪器检测，也适用于水相的各类快速检测方法。
9.技术方案：一种用于水产养殖底泥孔雀石绿检测的前处理方法，步骤如下：步骤一.取待检测水产养殖底泥，滤干游离水，置于离心管中，随后加入分散稳定包，涡旋混匀后待用，待检测水产养殖底泥与分散稳定包的质量比为5:0.5；步骤二.向步骤一中待用的离心管中加入提取转化包液体，涡旋混匀，静置，离心，
然后立即准确移出1ml上清液置于新的离心管中待用，提取转化包液体与待检测水产养殖底泥的比值为10ml：0.5g；步骤三.向步骤二中待用的离心管中加入固定兼容包液体，置于-20℃保存，等待检测，固定兼容包液体与步骤二中待用的离心管中上清液的比值为5ml：1ml。
10.作为优选，所述步骤一中分散稳定包的原料按质量份数配比如下：1-3份含铁金属有机框架材料、4-5份硅藻土和0.5-1份对甲基苯磺酸。分散稳定包的作用是将我国常见的水产品种在养殖过程中形成的底泥进行归一化稳定处理，保证后续操作能够统一而稳定，避免取样或人为误差。
11.作为优选，所述步骤二中提取转化包液体由乙腈、二氯甲烷和二氯二氰基苯醌组成，乙腈与二氯甲烷的比值为1ml：1ml，二氯二氰基苯醌的乙腈和二氯甲烷混合溶液的浓度为0.88*10-9 mol/l。提取转化包的作用是在保证底泥中孔雀石绿和隐色孔雀石绿均能够高效被提取出来的同时，也能够将提取液中的隐色孔雀石绿转化为孔雀石绿，方便后续检测。
12.作为优选，所述步骤三中固定兼容包液体的原料按质量份数配比如下：1-3份1mol/l磷酸二氢钾溶液、0.2-0.5份牛血清蛋白和0.01-0.02份1mol/l硝酸溶液。固定兼容包的作用是能够将提取液中的孔雀石绿保持长期稳定存在，也能够将提取液转化成有机相和无机项均兼容的状态，目的是让该液体既适合仪器检测，亦能够用于大多数的快速免疫检测技术。
13.作为优选，所述步骤一中涡旋混匀1 min后待用；所述步骤二中涡旋混匀5 min，静置2 min，3000 rpm离心5 min。
14.有益效果：本发明所述前处理方法能够将水产养殖底泥中孔雀石绿的提取效率保持在95%至100%，并且稳定性高，变异系数控制在5%以内。完全克服了以往行业标准中提取效率或高或低不稳定的缺点，也能够保证该提取液既适用于有机相的仪器检测，也适用于水相的各类快速检测方法。
15.附图说明
16.图1 为应用例2中高效液相色谱定量结果图。
具体实施方式
17.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
18.本说明书实施例中用到的原料来源如下：三个包中涉及的材料购置于：铁金属有机框架材料：铁离子与有机配体通过自组装形成的具有周期性网络结构的晶体多孔材料，苏州为度生物技术有限公司定制合成；硅藻土：上海安谱实验技术有限公司购置；对甲基苯磺酸、乙腈、二氯甲烷、二氯二氰基苯、磷酸二氢钾溶液、牛血清蛋白、硝酸：国药集团购置。
19.实施例1一种用于水产养殖底泥孔雀石绿检测的前处理方法，步骤如下：
步骤一.取待检测水产养殖底泥，滤干游离水，置于离心管中，随后加入分散稳定包，涡旋混匀1min后待用，待检测水产养殖底泥与分散稳定包的质量比为5:0.5，分散稳定包的原料按质量份数配比如下：1份含铁金属有机框架材料、4份硅藻土和0.5份对甲基苯磺酸；步骤二.向步骤一中待用的离心管中加入提取转化包液体，涡旋混匀5min，静置2min，3000rpm离心5min，然后立即准确移出1ml上清液置于新的离心管中待用，提取转化包液体与待检测水产养殖底泥的比值为10ml：5g，提取转化包液体由乙腈、二氯甲烷和二氯二氰基苯醌组成，乙腈与二氯甲烷的比值为1ml：1ml，二氯二氰基苯醌的乙腈和二氯甲烷混合溶液的浓度为0.88*10-9 mol/l；步骤三.向步骤二中待用的离心管中加入固定兼容包液体，置于-20℃保存，等待检测，固定兼容包液体与步骤二中待用的离心管中上清液的比值为5ml：1ml，固定兼容包液体的原料按质量份数配比如下：1份1mol/l磷酸二氢钾溶液、0.2份牛血清蛋白和0.01份1mol/l硝酸溶液。
20.实施例2一种用于水产养殖底泥孔雀石绿检测的前处理方法，步骤如下：步骤一.取待检测水产养殖底泥，滤干游离水，置于离心管中，随后加入分散稳定包，涡旋混匀1min后待用，待检测水产养殖底泥与分散稳定包的质量比为5:0.5，分散稳定包的原料按质量份数配比如下： 3份含铁金属有机框架材料、5份硅藻土和1份对甲基苯磺酸；步骤二.向步骤一中待用的离心管中加入提取转化包液体，涡旋混匀5min，静置2min，3000rpm离心5min，然后立即准确移出1ml上清液置于新的离心管中待用，提取转化包液体与待检测水产养殖底泥的比值为10ml：5g，提取转化包液体由乙腈、二氯甲烷和二氯二氰基苯醌组成，乙腈与二氯甲烷的比值为1ml：1ml，二氯二氰基苯醌的乙腈和二氯甲烷混合溶液的浓度为0.88*10-9 mol/l；步骤三.向步骤二中待用的离心管中加入固定兼容包液体，置于-20℃保存，等待检测，固定兼容包液体与步骤二中待用的离心管中上清液的比值为5ml：1ml，固定兼容包液体的原料按质量份数配比如下： 3份1mol/l磷酸二氢钾溶液、0.5份牛血清蛋白和0.02份1mol/l硝酸溶液。
21.实施例3一种用于水产养殖底泥孔雀石绿检测的前处理方法，步骤如下：步骤一.取待检测水产养殖底泥，滤干游离水，置于离心管中，随后加入分散稳定包，涡旋混匀1min后待用，待检测水产养殖底泥与分散稳定包的质量比为0.5:0.5，分散稳定包的原料按质量份数配比如下：1份含铁金属有机框架材料、4份硅藻土和0.5份对甲基苯磺酸；步骤二.向步骤一中待用的离心管中加入提取转化包液体，涡旋混匀5 min，静置2 min，3000 rpm离心5 min，然后立即准确移出1 ml上清液置于新的离心管中待用，提取转化包液体与待检测水产养殖底泥的比值为10 ml：0.5 g，提取转化包液体由乙腈、二氯甲烷和二氯二氰基苯醌组成，乙腈与二氯甲烷的比值为1ml：1ml，二氯二氰基苯醌的乙腈和二氯甲烷混合溶液的浓度为0.88*10-9 mol/l；
步骤三.向步骤二中待用的离心管中加入固定兼容包液体，置于-20℃保存，等待检测，固定兼容包液体与步骤二中待用的离心管中上清液的比值为5ml：1ml，固定兼容包液体的原料按质量份数配比如下：2份1mol/l磷酸二氢钾溶液、0.3份牛血清蛋白和0.01份1mol/l硝酸溶液。
22.本实施例中在江苏宜兴高塍镇某团头鲂水产养殖池塘采取底泥，滤干游离水，通过加标的方式使得该底泥中含有0.5 μg/kg的孔雀石绿和0.5μg/kg的隐色孔雀石绿。制备好阳性质控样品后，取0.5g底泥置于15 ml离心管中，随后加入分散稳定包，涡旋混匀1min后待用，待检测水产养殖底泥与分散稳定包的质量比为0.5:0.5，加入10ml提取转化包液体，涡旋混匀5 min，静置2 min，3000 rpm离心5 min，然后立即准确移出1 ml上清液置于新的离心管中，随后加入5 ml固定兼容包液体。以上过程重复三次。通过高效液相色谱仪器检测方式（图1中low 为本实施例色谱结果），获得检测值分别为1.03μg/kg、0.96μg/kg和0.98μg/kg，回收率分别为103%、96%、98%。
23.实施例4同实施例3，区别在于，所述步骤二中二氯二氰基苯醌的乙腈和二氯甲烷混合溶液的浓度为0.88*10-6 mol/l。
24.实施例5同实施例3，区别在于，所述步骤二中二氯二氰基苯醌的乙腈和二氯甲烷混合溶液的浓度为0.88*10-7 mol/l。
25.通过高效液相色谱仪器检测方式，实施例4采用的方法处理后的色谱峰形比实施例5中的杂峰多，不利于定量，实施例5中的杂峰高于实施例3。
26.应用例1采用实施例3的前处理方法，区别在于不采用步骤一，即不使用分散稳定包。
27.在江苏宜兴高塍镇某团头鲂水产养殖池塘采取底泥，滤干游离水，通过加标的方式使得该底泥中含有0.5 μg/kg的孔雀石绿和0.5μg/kg的隐色孔雀石绿。制备好阳性质控样品后，取0.5g底泥置于15 ml离心管中，加入10ml提取转化包液体，涡旋混匀5 min，静置2 min，3000 rpm离心5 min，然后立即准确移出1 ml上清液置于新的离心管中，随后加入5 ml固定兼容包液体。以上过程重复三次。
28.该实施案例没有使用分散稳定包。通过高效液相色谱仪器检测方式，获得检测值分别为1.11μg/kg、0.72μg/kg和0.83μg/kg。该结果显示回收率值分别为111%、72%和83%，变异系数达到23%。可见没有使用分散稳定包缺点明显，不能控制回收率的波动范围在5%以内。
29.应用例2采用实施例3的前处理方法，在苏州太仓双凤镇某中华绒螯蟹水产养殖池塘采取底泥，滤干游离水，通过加标的方式使得该底泥中含有0.5 μg/kg的孔雀石绿和0.5 μg/kg的隐色孔雀石绿。制备好阳性质控样品后，取0.5 g底泥置于离心管中，随后加入0.5 g的分散稳定包，加入10 ml提取转化包液体，此处额外加入二氯二氰基苯醌，使二氯二氰基苯醌的乙腈和二氯甲烷混合溶液的浓度为2.18*10-9 mol/l，改变提取转化包的组成比例，涡旋混匀5 min，静置2 min，3000 rpm离心5 min，然后立即准确移出1 ml上清液置于新的离心管中，随后加入5 ml固定兼容包液体。
30.通过高效液相色谱仪器检测方式发现，在额外二氯二氰基苯醌添加后，目标峰前方会出现过多杂峰，影响色谱定量结果（图1中high）。图1色谱峰在高剂量的二氯二氰基苯醌额外添加后，明显有过多杂峰出现。
31.在提取转化包中，本研究使用了二氯二氰基苯醌，目的是将隐色孔雀石绿重新氧化为孔雀石绿。因为孔雀石绿这种药品使用后易降解为隐色孔雀石绿。造成两种并存的局面。
32.本专利通过二氯二氰基苯醌的氧化行为，只需在后续测定中只测定孔雀石绿一种即可。已有报道或专利也使用了该物质作为转化剂。但本专利的发明人首次明确了使用量是0.88*10-9 mol/l，在该浓度下的用量能够保证在转化效率不受影响的基础上，还可使续检测仪器上不会出现杂峰，影响结果。
33.对比例1按照国家行业标准《水产养殖环境（水体、底泥）中孔雀石绿的测定 高效液相色谱法（sc/t 9435-2019）》对水产养殖底泥孔雀石绿进行检测。实验时，依据标准，第一步只是将底泥直接准确称取适量用于后续的目标物提取，并没有对底泥进行如本专利所述的归一化分散稳定处理。结果发现，同时对一份阳性样本底泥进行测定时，得到的结果回收率从72%至111%不等，变异系数大，结果很不稳定。