中性粒细胞CD64感染指数的测定试剂及其测定方法

中性粒细胞cd64感染指数的测定试剂及其测定方法
技术领域
1.本发明涉及医学检测技术领域，具体而言，涉及一种中性粒细胞cd64感染指数的测定试剂及其测定方法。


背景技术：

2.中性粒细胞是机体早期抵抗感染的主要细胞亚群之一，被激活后其表面cd64的表达上调，进而介导机体的免疫反应发挥抗感染作用，越来越多的研究表明，中性粒细胞cd64感染指数作为一项新指标，在感染性疾病的早期诊断、病情监测和预后评估等方面有重要的价值。白细胞分化抗原14(cd14)是机体免疫反应过程中的关键分子，近年研究认为cd14阳性细胞表面hla-dr的表达是反映感染性疾病患者机体免疫功能的敏感指标cd14
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细胞hla-dr水平过低可能导致免疫功能低下，甚至出现免疫麻痹状态。因此观察患者cd14
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细胞的hla-dr表达率有助于了解病情变化及指导临床治疗。
3.上述对cd64和hla-dr/cd14的测定对临床感染性疾病的诊断意义重大，但由于测定过程繁杂，无法同时进行，导致测定效率不佳。


技术实现要素：

4.本发明解决的问题是当前对cd64和hla-dr/cd14的测定过程繁杂，导致测定效率不佳的技术问题，实现了简化测定步骤，提高检测效率，并提高检测准确度的技术效果。
5.为解决上述问题，本发明提供一种中性粒细胞cd64感染指数的测定试剂，包括：cd45抗体；cd14抗体；cd64抗体；hla-dr抗体；cd14抗体，cd64抗体，cd45抗体与hla-dr抗体的配比为(5-20)：(5-20)：(5-20)：(2-5)。
6.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的测定试剂，预先对cd14抗体，cd64抗体，cd45抗体与hla-dr抗体进行了合理的配比获得，进而操作者在测定cd64感染指数时，直接将血液样本与上述测定试剂混合后进行检测即可，无需逐个添加上述抗体，简化了操作步骤。其中，cd14
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hla-dr-表达率还是评价疾病严重程度的有效指标。
7.本发明还提供一种中性粒细胞cd64感染指数的测定方法，采用上述实例的测定试剂，测定方法包括以下步骤：
8.s10：获得血液样本，并在血液样本中加入测定试剂，获得检测样本；
9.s20：采用流式细胞仪对检测样本中经cd45抗体、cd14抗体、cd64抗体和hla-dr抗体共孵育过的血液样本进行圈门，根据光学信息分别圈出血液样本中的中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，cd45抗体、cd14抗体、cd64抗体和hla-dr抗体分别用不同的荧光基团进行标记；
10.s30：分别获取中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的中的cd64抗体的荧光强度的平均值；
11.采用如下公式对cd64指数进行计算：
12.cd64指数＝(中性粒细胞cd64抗体的荧光强度平均值/淋巴细胞cd64抗体的荧光
强度平均值)/(单核细胞cd64抗体的荧光强度平均值/中性粒细胞cd64抗体的荧光强度平均值)。
13.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用流式细胞术检测血液样本中中性粒细胞的cd64表达量，用cd14、cd45、cd64、hla-dr四种抗体联合进行圈门，集合了单抗、双抗的所有优点，不仅以cd45通道将白细胞群与碎片区分，能够将淋巴细胞和中性粒细胞圈出来，还可以用cd14通道将单核细胞圈出来，淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的三圈更为独立，相互之间影响、重叠部分较少，圈门结果更为准确，且提高了计算准确性。
14.在本发明的一个实例中，s30包括以下步骤：
15.s31：分别获取中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞上cd64抗体的荧光强度峰图；
16.s32：根据荧光强度峰图，计算平均值。
17.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：根据平均荧光强度计算cd64指数，准确率更高。
18.在本发明的一个实例中，圈门的步骤包括：
19.用侧向散射光和cd45荧光检测经cd45抗体、cd14抗体、cd64抗体和hla-dr抗体共孵育过的血液样本，圈出样本中的白细胞；
20.在圈出的白细胞中，用cd45荧光分别圈门中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。
21.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：散射光设门，以fsc和ssc(侧向散射光)联合设门较常用，可以排除碎片或噪声的干扰，可以根据fscvsssc散点图上不同细胞分布不同来设门目的细胞群。
22.在本发明的一个实例中，圈门的步骤还包括：
23.在圈门的白细胞中，用cd14荧光圈门cd14
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hla-dr-细胞。
24.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：cd14
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hla-dr-的表达率能够作为感染严重程度的参考。
25.在本发明的一个实例中，孵育为避光孵育。
26.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：由于上述抗体为荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。
27.在本发明的一个实例中，避光孵育的时间为15min～30min。
28.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：cd45抗体、cd14抗体、cd64抗体和hla-dr抗体分别用不同的荧光基团进行标记，避光孵育后，测定试剂能够对血液样本进行染色，以便后续检测。
29.在本发明的一个实例中，s20还包括：
30.在圈门之前，去除在抗体共孵育后的血液样本中的红细胞。
31.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本测定方法针对白细胞中的中性细胞、淋巴细胞、单核细胞进行测定，故为防止红细胞给检测观察带来干扰，需对血液样本中的红细胞进行去除。
32.在本发明的一个实例中，去除在抗体共孵育后的血液样本中的红细胞的方法为用溶血素孵育。
33.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：溶血素可以溶解红细胞，另外溶血素还可以作用于白细胞膜，可以导致白细胞的胞浆流失，剩下细胞核，从而可以对于
白细胞当中的细胞，比如说中性细胞、淋巴细胞、单核细胞进行比较准确的计数以及观察。
34.在本发明的一个实例中，用溶血素孵育的时间为10min～15min。
35.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：既要红细胞完全破坏释放血红蛋白,又要保证白细胞计数及其分数的准确性，溶血素的加入量及溶血时间的长短至关重要。
附图说明
36.图1为本发明实施例提供的未圈门的结果。
37.图2为本发明实施例提供的前侧向圈门的结果，通过细胞大小和复杂程度可以来圈门看出白细胞(wbc)所占百分比。
38.图3为以cd45荧光通道圈门白细胞(wbc)所占比值。
39.图4为圈门的淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞。
40.图5为圈门的cd14
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hla-dr-细胞比例。
41.图6为淋巴细胞的荧光强度峰图。
42.图7为中性粒细胞的荧光强度峰图。
43.图8为单核细胞的荧光强度峰图。
具体实施方式
44.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
45.实施例一：
46.本发明提供一种中性粒细胞cd64感染指数的测定试剂，包括：cd45抗体；cd14抗体；cd64抗体；hla-dr抗体；cd14抗体，cd64抗体，cd45抗体与hla-dr抗体的配比为(5-20)：(5-20)：(5-20)：(2-5)。
47.具体的，将上述抗体按照配比，进行相应混合，即可得到测定试剂，试剂制备简单快捷。
48.举例来说，测定试剂一包括：20微升cd45抗体，20微升cd14抗体，20微升cd64抗体，5微升hla-dr抗体。
49.具体的，cd45：分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原(leukocyte commonantigen,lca)。cd45由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用，能使底物p56lck和p59fyn上酪氨酸脱磷酸而激活，在细胞的信息传导中发挥重要作用，cd45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义，cd45的分布可作为某些t细胞亚群的分类标志。
50.具体的，cd14：即lps(lipopolysaccharide)受体，最初是一种存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的白细胞分化抗原。cd14(包括mcd14和scd14)的化学结构为糖蛋白，其生物学功能主要是识别、结合lps或lps/lbp复合物，介导lps所致的细胞反应，在lps性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。
51.具体的，cd64：能识别免疫球蛋白、对igg单体具有高亲和力、介导体液免疫和细胞
免疫、对感染性疾病具有早期诊断价值的igg fc片段受体1(fcγrⅰ)。正常情况下，cd64主要表达于巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞表面，中性粒细胞表面几乎不表达cd64。当机体患感染性疾病(例如：绝大多数的上呼吸道感染，乙肝、丙肝病毒感染引起的病毒病肝炎，脓毒血症，eb病毒感染，传染性单核细胞增多症，乙型脑炎，败血症等)时，中性粒细胞表面cd64表达迅速升高。cd64作为感染性疾病良好的诊断指标，在临床上具有广泛的应用前景。
52.因此，将中性粒细胞单独筛选出来，并对其上的cd64表达进行检测，可用于作为感染性疾病良好的诊断指标。
53.需要说明的是，本发明属于非疾病诊断目的的检测方法，cd64指数并不能够100％直接判断感染性疾病的发生，需要配合其他临床诊断方法进行综合判定。
54.进一步的，cd14阳性细胞表面hla-dr的表达是反映感染性疾病患者机体免疫功能的敏感指标，cd14
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细胞hla-dr表达水平过低可能导致免疫功能低下，甚至出现免疫麻痹状态，cd14
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单核细胞上的hla-dr表达的降低可以作为多器官功能衰竭(mods)早期诊断标准之一。因此，观察患者hla-dr/cd14的表达率有助于了解病情变化及指导临床治疗。
55.实施例二：
56.本发明还提供一种中性粒细胞cd64感染指数的测定方法，采用实施例一提供的测定试剂，测定方法包括以下步骤：
57.s10：获得血液样本，并在血液样本中加入测定试剂，获得检测样本；
58.s20：采用流式细胞仪对检测样本中经cd45抗体、cd14抗体、cd64抗体和hla-dr抗体共孵育过的血液样本进行圈门，根据光学信息分别圈出血液样本中的中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，cd45抗体、cd14抗体、cd64抗体和hla-dr抗体分别用不同的荧光基团进行标记；
59.s30：分别获取中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的中的cd64抗体的荧光强度的平均值；
60.采用如下公式对cd64指数进行计算：
61.cd64指数＝(中性粒细胞cd64抗体的荧光强度平均值/淋巴细胞cd64抗体的荧光强度平均值)/(单核细胞cd64抗体的荧光强度平均值/中性粒细胞cd64抗体的荧光强度平均值)。
62.具体的，通过流式细胞术分析细胞样品时，欲获得更加准确的分析结果，应用最优化的设门策略非常重要。要考虑的因素包括：排除细胞碎片；应用合适的荧光阴性对照；排除死细胞；如果合适，使用一种共享标记物(比如cd45白细胞标记或与之等效的泛细胞群标记)染色；设置必需的荧光分析点图。
63.进一步的，s30包括以下步骤：
64.s31：分别获取中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞上cd64抗体的荧光强度峰图；
65.s32：根据荧光强度峰图，计算平均值。
66.进一步的，圈门的步骤包括：
67.用侧向散射光和cd45荧光检测经cd45抗体、cd14抗体、cd64抗体和hla-dr抗体共孵育过的血液样本，圈出样本中的白细胞；
68.在圈出的白细胞中，用cd45荧光分别圈门中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。
69.进一步的，圈门的步骤还包括：
70.在圈门的白细胞中，用cd14荧光圈门cd14
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hla-dr-细胞。
71.进一步的，孵育为避光孵育。
72.进一步的，避光孵育的时间为15min～30min。
73.具体的，避光孵育的时间例如15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min。
74.进一步的，s20还包括：
75.在圈门之前，去除在抗体共孵育后的血液样本中的红细胞。
76.进一步的，去除在抗体共孵育后的血液样本中的红细胞的方法为用溶血素孵育。
77.进一步的，用溶血素孵育的时间为10min～15min。
78.具体的，用溶血素孵育的时间例如10min、11min、12min、13min、14min、15min。
79.实施例三：
80.在实施例一和实施例二的基础上，在一个具体实施例中，中性粒细胞cd64感染指数的测定方法包括以下步骤：
81.s10：用移液枪取20ul的测定试剂一，加到流式上样管底部；
82.s20：用移液枪取50ul充分混匀的血样，加到上述流式上样管底部；
83.s30：用涡旋振荡器对流式上样管中的测定试剂一和血样进行涡旋混匀3-5秒，并在20-25℃温度下避光孵育15分钟；
84.s40：向染色的血样中加入450ul溶血素(1x)进行溶血，避光裂解10分钟；
85.s50：在上述流式上样管中加入2ml pbs洗涤1次，离心去上清，再加入0.5ml pbs，获得检测样本；
86.s60：用流式细胞仪对检测样本进行检测。
87.具体的，本实施例的血样为全血血样，加血样时要避免将血样沾到管壁上。
88.正常情况下，在健康人群中外周血中性粒细胞表面cd64的表达水平较低，当受到感染或内毒素入侵时，释放的促炎因子γ-干扰素(γ-ifn)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)刺激中性粒细胞激活，4-6小时之内外周血中性粒细胞cd64在促炎细胞因子的作用下会明显升高，可高达10倍以上，对于多种感染性疾病，尤其是细菌感染的早期诊断具有重要意义。
89.且中性粒细胞cd64升高只特异性的和感染、脓毒症相关，不受服用皮质激素、抗风湿类药物、免疫抑制剂、白血病、骨髓增生异常综合征等非感染性疾病影响，具有较高的灵敏性和特异性。
90.具体的，流式圈门过程参见图1至5所示。其中lym为淋巴细胞，gra为粒细胞，mono为单核细胞。参见图1至图3，通过细胞大小和复杂程度可以来圈门看出白细胞(wbc)所占百分比，由图3可知，淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞所占百分比为90.92％。通过三系细胞细胞表面cd45表达圈门白细胞(wbc)所占比值，圈门，图4为在图3圈出的wbc中，通过三系细胞细胞表面cd45表达圈门单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞。可以看出，粒细胞所占门控百分比为42.94％，淋巴细胞所占门控百分比为48.33，单核细胞所占门控百分比为7.35％。
91.参见图5，可以知道，cd14
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hla-dr-的门控百分比为0.33％。cd14
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细胞hla-dr表达率能反映感染性疾病尤其是急重症患者机体免疫抑制状况，可作为预测预后及指导免疫刺激治疗的一项敏感而有效的指标；动态观察cd14
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细胞hla-dr表达率可监测疾病的发生发
展及对预后作出正确评估。
92.荧光强度计算参见图6至图8。图6为淋巴细胞的荧光强度峰图，可以清楚知道，淋巴细胞的荧光强度平均值为493.48。图7为中性粒细胞的荧光强度峰图，可以清楚知道，中性粒细胞的荧光强度平均值为15360.78。图8为单核细胞的荧光强度峰图，可以清楚知道，单核细胞的荧光强度平均值为60202.73。根据计算公式，可以得到cd64指数为7.9。通过由荧光抗体标记的cd64抗体在淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞上表达的荧光强度峰图，得到一个平均值。从三抗体的整体图可以看出，三抗体的图集合了单抗双抗所有的优点，不仅以cd45通道将wbc群与碎片区分，还以cd14通道将单核细胞单独出来，三群更为独立，相互之间影响较小，重叠部分较少，所以结果更为准确可靠，可以为我们各个计算公式提供更准确稳定的gra、lym、mono的荧光强度，减少误差。
93.进一步的，本发明提供的测定试剂能够用于制备中性粒细胞cd64感染指数试剂盒，能够大大提高检测效率。
94.虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。