化学发光检测法的检测校准系统建立方法、检测校准方法与流程

1.本发明涉及化学发光检测技术领域，具体涉及一种化学发光检测法的检测校准系统建立方法、检测校准方法。


背景技术：

2.化学发光检测技术作为疾病诊断的一种重要手段，广泛应用于各种体外诊断实验中。
3.现有的化学发光检测试剂在进行检测的过程中，除单独的检测试剂外，还需要有配套的校准品对检测系统进行校准；目前的校准品通常是将与待测物结构相似的抗原(合成或天然)用缓冲液制备成一定浓度值的校准品(液体或固体)，在临床测试前，通过测定校准品对检测系统进行校准。这种校准方法存在一些问题，由于需要每隔一段时间进行一次校准，耗费试剂、时间以及人力；同时为了节约耗材、时间和人力，只是在特定的时间点对检测系统进行校准，在两次校准操作之间，仪器、环境等因素可能使整个系统发生不可预知的变化，从而会影响检测结果。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是现有的化学发光检测技术中的校准过程费时费力及耗费耗材，且在间隔校准操作期间仪器、环境等因素可能使整个系统发生不可预知的变化从而影响检测结果。目的在于提供一种化学发光检测法的检测校准系统建立方法、检测校准方法，以解决以上问题。
5.本发明的第一个目的在于提供的一种化学发光检测法的检测校准系统建立方法，包括：
6.磁珠组分制备；
7.酶组分制备；
8.荧光素组分制备；
9.将待测物与磁珠组分、酶组分、荧光素组分经孵育后，形成分别用于检测和校准的免疫复合物1和免疫复合物2，免疫复合物1和免疫复合物2经磁分离清洗后去除杂质，所述免疫复合物1再与酶底物接触反应，以同时建立检测系统和校准系统，用于同时获取检测系统信号和校准系统荧光信号以得出待测物含量。
10.本发明中对化学发光试剂同时建立检测系统和校准系统，这样在每次检测的时候都可以进行校准，每次检测的时候均可以获得两个光信号，即检测系统的光信号和校准系统的荧光信号，从而可以消除外部因素的干扰；且由于是同时建立的检测系统和校准系统，不需要专门配备校准品，可以节省耗材，并省时、省力。其中免疫复合物1用于检测，如免疫复合物1可以为磁珠(链接单克隆抗体1)-待测物-酶(链接单克隆抗体2)，免疫复合物2用于校准，如免疫复合物2可以为磁珠(链接羊抗鸡igy)-apc荧光素(链接鸡igy)。
11.在一可选地实施例中，所述磁珠组分为用单克隆抗体1和羊抗鸡igy包被磁珠，或
用单克隆抗体1和抗fitc抗体包被磁珠；
12.所述荧光素组分为用鸡igy标记apc，或用fitc标记牛血清白蛋白或酪蛋白；
13.所述酶组分为碱性磷酸酶(alp)链接单克隆抗体2或bnp标记抗体。
14.在一可选地实施例中，所述磁珠组分的制备过程为：将单克隆抗体1和羊抗鸡igy或抗fitc抗体链接生物素酯，利用生物素-链霉亲和素反应体系，将链接有单克隆抗体1的生物素酯再链接至标记有链霉亲和素的超顺磁微粒上，对磁微粒上多余点位用维生素h进行封闭；将制备好的两种免疫磁珠(即是单克隆抗体1包被的磁珠和羊抗鸡igy包被的磁珠；或者单克隆抗体1包被的磁珠和抗fitc抗体包被的磁珠。)进行混合。其中的超顺磁微粒上还可以是羧基磁珠或tosyl磁珠。
15.在一可选地实施例中，所述酶组分制备过程为：将碱性磷酸酶与交联剂smcc链接，单克隆抗体2与交联剂2-it链接，链接为alp-smcc-2-it-抗体复合物，加入氯化锌、氯化镁提升酶活性。
16.在一可选地实施例中，所述荧光素组分制备过程为：先将鸡igy用活化液进行活化；将活化后的鸡igy与荧光素混合，2-8℃条件下避光反应过夜；加入猝灭剂后室温反应；层析柱分离，收集荧光素-鸡igy标记产物。
17.在一可选地实施例中，校准系统与检测系统的磁珠组分用量比值为1:4。
18.本发明的第二个目的在于提供一种化学发光检测法的检测校准方法，采用上述建立的所述的检测校准系统，通过检测系统信号和校准系统荧光信号得出待测物含量；
19.在化学发光检测仪上加装光学模块，所述光学模块包括所述半导体激光器、滤光片、光敏二极管；
20.所述检测系统信号的获取方法为：免疫复合物1上的酶催化底物脱去磷酸基产生光子，光电倍增管将光信号转换为电信号2输出得到；
21.所述校准系统信号的获取方法为：半导体激光器发射激光聚焦到免疫复合物2，激发出来的荧光经滤光片后聚集到光敏二极管上，光敏二极管将荧光收集，并将荧光的强弱转换为电信号1输出得到。
22.由于本发明对化学发光试剂是同时建立的检测系统和校准系统，且在化学发光检测仪上加装了光学模块来获取校准系统的荧光信号，从而可以利用同一个待测物体系在同一台仪器上同时获取检测系统信号和校准系统荧光信号，不需要采用专门的仪器采集专门配套的校准品的信号，操作简单、节约耗材，省时省力，每次检测均可采集到检测系统信号和校准系统荧光信号，进而通过校准系统的信号对检测系统的信号进行修正，消除外部因素的干扰。
23.在一可选地实施例中，所述光学模块加装在化学发光检测仪上的光电倍增管的侧面；
24.所述滤光片位于所述半导体激光器与所述光敏二极管之间，以接收半导体激光器发生的激光并对所述激光进行选取，将得到的所需辐射波段的光聚集到光敏二极管上。
25.在一可选地实施例中，免疫复合物2被激发出来的荧光的波长与酶催化底物发出的光波的波长之间的差值大于20nm。
26.在一可选地实施例中，半导体激光器发出的激光波长为630nm；免疫复合物2被激发出来的荧光的波长为660nm；酶催化底物发出的光波的波长为470nm。
27.在一可选地实施例中，所述通过检测系统信号和校准系统荧光信号得出待测物含量的过程为：
28.通过测定不同浓度的参考品制作校准曲线，并根据所述标准曲线得到浓度-信号比值的拟合公式，所述信号比值为电信号2/电信号1的比值；
29.当检测完待测物后，计算信号比值并代入拟合公式，即可得待测物含量。
30.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
31.本发明实施例提供的一种化学发光检测法的检测与校准系统的建立方法，通过对化学发光试剂同时建立检测系统和校准系统，在每次检测的时候都可以进行校准，每次检测的时候均可以获得两个光信号，即检测系统的光信号和校准系统的荧光信号，从而可以消除外部因素的干扰；且由于是同时建立的检测系统和校准系统，可以节省耗材，并省时、省力。
32.检测校准方法中，由于对化学发光试剂是同时建立的检测系统和校准系统，且在化学发光检测仪上加装了光学模块来获取校准系统的荧光信号，从而可以利用同一个待测物体系在同一台仪器上同时获取检测系统信号和校准系统荧光信号，不需要采用专门的仪器采集专门配套的校准品的信号，操作简单、节约耗材，省时省力，每次检测均可采集到检测系统信号和校准系统荧光信号，进而通过校准系统的信号对检测系统的信号进行修正，消除外部因素的干扰，测定结果准确、可靠。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
34.图1为本发明实施例提供的化学发光检测法的检测校准系统建立方法流程图；
35.图2为本发明实施例1的标准曲线图；
36.图3为本发明实施例2的标准曲线图；
37.图4为本发明实施例检测使用的化学发光检测仪上加装的光学模块与pmt模块相配合的结构示意图；
38.图中各部件及标记分别为：
39.1-pmt模块，2-光学模块，3-连接板。
具体实施方式
40.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
41.在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特
征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
42.实施例1：
43.一种化学发光检测法的检测校准系统的建立，如图1所示，包括：
44.一、制备磁珠组分：磁珠组分包括链霉亲和素磁珠、单克隆抗体1、羊抗鸡igy、生物素酯、牛血清白蛋白、triton x-100、海藻糖、0.02m pbs缓冲液、0.1mol/l tris缓冲液、pc300、甘氨酸、维生素h；
45.具体制备方法如下：
46.(1)将单克隆抗体1、羊抗鸡igy用0.02m pbs缓冲液透析过夜；
47.(2)将单克隆抗体1、羊抗鸡igy分别与10mmol/l生物素酯按1毫克抗体：13.3μl 10mmol/l生物素酯的比例在室温反应30min；
48.(3)反应完后，用0.1mol/l tris缓冲液终止，tris终浓度为0.01mol/l；
49.(4)终止完后用0.02m pbs缓冲液透析过夜；
50.(5)制备得到的生物素化抗体与链霉亲和素磁珠按2ug生物素化抗体：1mg链霉亲和素磁珠的比例进行包被，室温反应60min；
51.(6)用0.05m维生素h室温封闭30min，封闭剂使用量为50ul维生素h：1mg链霉亲和素磁珠，使用缓冲液清洗3次，磁珠组分制备完成。
52.缓冲液包括以下浓度的组分：
53.pbs：0.02m；
54.牛血清白蛋白：5g/l-20g/l；
55.甘氨酸：1g/l-5g/l；
56.海藻糖：3g/l-10g/l；
57.triton x-100：1ml/l-5ml/l；
58.pc300：1ml/l-2ml/l；
59.二、制备酶组分：酶组分包括单克隆抗体2、碱性磷酸酶、smcc、2-it、0.02m pbs缓冲液、tsmz缓冲液、tse缓冲液、0.1mol/l tris缓冲液、酪蛋白、pc300、吐温-20、氯化钠、氯化锌、氯化镁、丙三醇；
60.具体制备方法如下：
61.(1)将单克隆抗体2用tsmz缓冲液透析过夜；将碱性磷酸酶用tse缓冲液透析过夜；
62.(2)1mg单克隆抗体2中加入5ul 20mm smcc溶液，室温反应60min；1mg碱性磷酸酶中加入20ul 50mm 2-it溶液室温反应60min；
63.(3)反应完后，单克隆抗体2用0.02m pbs缓冲液透析过夜；碱性磷酸酶用tse缓冲液透析过夜；
64.(4)将二者按1:1混合室温反应120min；使用缓冲液稀释，酶组分制备完成。
65.缓冲液包括以下浓度的组分：
66.tris：0.1mol/l；
67.酪蛋白：5g/l-20g/l；
68.氯化钠：9g/l-27g/l；
69.氯化锌：0.001mol/l-0.01mol/l；
70.氯化镁：0.001mol/l-0.01mol/l；
71.丙三醇：1ml/l-5ml/l；
72.pc300：1ml/l-2ml/l；
73.吐温-20：1ml/l-5ml/l；
74.三、制备荧光素组分：荧光素组分包括apc荧光素、鸡igy、0.1mol/l tris缓冲液、0.1mol/lmes缓冲液、edc；
75.具体制备方法如下：
76.(1)将edc溶于0.1mol/l mes缓冲液，配制成5mg/ml溶液。
77.(2)向1mg鸡igy抗体中加入20μl5mg/ml的edc溶液，轻轻混匀，室温下反应60min。
78.(3)向活化的抗体中加入100μl 10mg/ml的apc溶液，室温避光反应120min；
79.(4)向步骤(3)溶液中加入20ul0.1mol/l tris缓冲液，室温下反应30min；
80.(5)将液体经脱盐柱纯化，收集纯化产物，用上述酶组分稀释液稀释，荧光素组分制备完成。
81.四：建立检测校准系统
82.将待测物与磁珠组分、酶组分、荧光素组分经孵育后，形成分别用于检测和校准的免疫复合物1和免疫复合物2，免疫复合物1和免疫复合物2经磁分离清洗后去除杂质，免疫复合物1再与酶底物接触反应，以同时建立检测系统和校准系统。
83.五：待测物含量测定
84.通过测定不同浓度的参考品制作校准曲线，并根据所述标准曲线得到浓度-信号比值的拟合公式，所述信号比值为电信号2/电信号1的比值；
85.当检测完待测物后，计算信号比值并代入拟合公式，即可得待测物含量。
86.校准曲线的制作过程为：设置多组不同浓度的参考品，以参考品浓度为横坐标，以信号2/信号1的比值为纵坐标，制备标准曲线，得出浓度-信号比值的拟合公式。具体地不同参考品浓度下测定的信号值数据如下表1所示。
87.表1不同参考品浓度下测定的信号值
[0088][0089]
制作得到如附图2所示的标准曲线。
[0090]
样品浓度的测定过程为：取6种不同浓度的抗原样品，测定校准系统的信号值1、检
测系统的信号值2，求取信号值2/信号值1的比值，代入上述拟合公式中，即得到各个样品的测定浓度，结果见表2。
[0091]
表2不同样品的测定浓度检测结果
[0092]
样品信号值1信号值2信号值2/信号值1测定浓度抗原样品124485649992.6555.211抗原样品2262961838086.99013.345抗原样品3262532232298.50316.231抗原样品42627033550912.77224.675抗原样品52625850178819.11038.342抗原样品62626165899525.09452.927
[0093]
实施例2：
[0094]
本实施例与实施例1的区别在于：
[0095]
磁珠组分中，用抗fitc抗体代替羊抗鸡igy包被磁珠；磁珠组分制备与实施例1相同；
[0096]
酶组分及制备均与实施例1相同；
[0097]
荧光素组分中用fitc标记牛血清白蛋白；荧光素组分包括fitc、牛血清白蛋白、0.5mol/l碳酸盐缓冲液、0.01mol/l pbs缓冲液，其具体制备方法如下：
[0098]
(1)用碳酸盐缓冲液配制5mg/ml的牛血清白蛋白溶液；
[0099]
(2)用dmso配制1mg/ml的fitc溶液，现配现用；
[0100]
(3)按200ugfitc：1mg牛血清白蛋白的比例混合，2-8℃避光反应4h；
[0101]
(4)反应产物用碳酸盐缓冲液2-8℃透析过夜；收集产物用上述酶组分稀释液稀释，荧光素组分制备完成。
[0102]
四：建立检测校准系统
[0103]
具体方法同实施例1。
[0104]
五：待测物含量测定
[0105]
具体方法同实施例1。
[0106]
其中标准曲线的制作过程中，不同参考品浓度下测定的信号值数据如下表3所示。
[0107]
表3不同参考品浓度下测定的信号值
[0108]
[0109][0110]
制作得到如附图3所示的标准曲线。
[0111]
取6种不同浓度的抗原样品，得到各个样品的测定浓度，结果见表4。
[0112]
表4不同样品的测定浓度检测结果
[0113]
样品信号值1信号值2信号值2/信号值1测定浓度抗原样品177503671340.8664.887抗原样品2821972094832.54914.294抗原样品3777642426973.12117.602抗原样品4821673873294.71427.275抗原样品5788715252296.65940.250抗原样品6820187084208.63755.130
[0114]
实施例3：
[0115]
本实施例与实施例1的区别在于，用bnp包被抗体代替单克隆抗体1，用bnp标记抗体代替单克隆抗体2，其余各试剂组分与实施例1相同，制备过程也与实施例1相同。
[0116]
制备试剂组分后进行校准曲线的制作和样品浓度的测定。
[0117]
校准曲线的制作过程为：设置多组不同浓度的参考品，以参考品浓度为横坐标，以信号2/信号1的比值为纵坐标，制备标准曲线，得出浓度-信号比值的拟合公式：具体地不同参考品浓度下测定的信号值数据如下表5所示。
[0118]
表5不同参考品浓度下测定的信号值
[0119][0120][0121]
样品浓度的测定过程为：取6种不同浓度的抗原样品，测定校准系统的信号值1、检测系统的信号值2，求取信号值2/信号值1的比值，代入上述拟合公式中，即得到各个样品的测定浓度。具体地，不同样品的测定浓度值见下表6所示。
[0122]
表6不同样品的测定浓度检测结果
[0123]
样品信号值1信号值2信号值2/信号值1测定浓度
抗原样品12348637191315.836802.9抗原样品2252082133918.465455.3抗原样品324435323261.32389.2抗原样品424740296801.20081.6抗原样品52473133031413.356686.1抗原样品6247391525006.164344.3
[0124]
实施例4：
[0125]
本实施例研究了检测系统和校准系统试剂组分不同用量下，信号值1、信号值2及其比值的变化关系。设置了a、b、c三组，各组中试剂组分用量为：
[0126]
a组：磁珠(单抗1)0.1mg/ml，酶组分1：1000稀释，磁珠(羊抗鸡igy)0.025mg/ml，荧光素组分1:2500稀释。此组中校准系统与检测系统磁珠组分用量比值为1：4。
[0127]
b组：磁珠(单抗1)0.1mg/ml，酶组分1：1000稀释，磁珠(羊抗鸡igy)0.05mg/ml，荧光素组分1:2500稀释。此组中校准系统与检测系统磁珠组分用量比值为1:2。
[0128]
c组：磁珠(单抗1)0.1mg/ml，酶组分1：1000稀释，磁珠(羊抗鸡igy)0.01mg/ml，荧光素组分1:2500稀释。此组中校准系统与检测系统磁珠组分用量比值为1：10。
[0129]
各组中设置了不同的参考品浓度值，测定了各信号值，结果见下表7所示。
[0130]
表7三组检测系统和校准系统在不同参考品浓度下的信号测定值及信号比值
[0131]
[0132][0133]
通过上述表7可知，校准系统的磁珠及荧光素组分的用量，会影响试剂灵敏度(0.2ng/ml与0值的信号比，比值越大，灵敏度越好)、线性等性能，校准系统与检测系统磁珠组分用量≤1:4时，灵敏度、线性基本不变，如a组与c组；但如果校准系统的磁珠用量过少如c组，信号值1重复性受到影响。采用校准系统与检测系统磁珠组分用量为1:4为最佳条件。
[0134]
通过本发明实施例建立的检测校准系统，可以快速、便捷地获得待测物质的浓度，且采用本发明的方法检测灵敏度高、数据稳定可靠。相比于原有技术在仪器孵育温度波动、环境温度变化较大时，测试结果波动较大，而本发明测试结果未受影响。
[0135]
以上各实施例中，使用的检测仪器是在现有的化学发光检测仪(生产厂商为四川新健康成生物股份有限公司、型号为ecl1600)上加装了光学模块，光学模块包括半导体激光器、滤光片、光敏二极管。
[0136]
具体的安装结构见图4所示，在化学发光检测仪的光电倍增管1(pmt模块)的侧面固定安装连接板3，光学模块2(包括半导体激光器、滤光片、光敏二极管)固定安装在连接板3上，且均位于待测物的上方，最终加装的光学模块用来检测校准系统的荧光信号，并将荧光信号转换为电信号输出。半导体激光器可以采用德国dilas生产的，光敏二极管可以采用广州新亿彩生产的，滤光片可以采用汇博光学生产的。pmt模块为日本滨松，加装后，原有的pmt模块依然进行光子计数功能。
[0137]
其中，所述检测系统信号的获取方法为：免疫复合物1上的酶催化底物脱去磷酸基产生光子，光电倍增管将光信号转换为电信号2输出得到；
[0138]
所述校准系统光信号的获取方法为：光学模块的半导体激光器发射激光聚焦到免疫复合物2，激发荧光物质发出荧光信号，激发出来的荧光经滤光片后聚集到光敏二极管上，光敏二极管将荧光收集，并将荧光信号强弱以电流形式输出得到电信号1，从而实现荧光信号的采集。半导体激发器发出的激光波长为630nm；免疫复合物2被激发出来的荧光的波长为660nm；酶催化底物发出的光波的波长为470nm。
[0139]
本发明实施例中，所使用的所有试剂均可以通过市售获得，采用制备方法、使用的检测仪器、检测方法等如无特殊说明，均为采用现有技术。
[0140]
以上的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。