一种用于蛋白质组学的样品处理方法

本申请属于蛋白质组学领域，涉及一种用于蛋白质组学的样品处理方法。

背景技术：

1、一份用于进行蛋白质组学测试的细胞组织生物样本通常要含有至少数十微克的起始蛋白。这主要是由于：1.这些蛋白质无法扩增且丰度的动态范围很宽；2.常用质谱(ms)平台的分析灵敏度仍不够高。

2、蛋白异质性是解释病变发生的关键内容。但均质提取蛋白中，单类细胞或组织之间异质性消失。采用流式细胞分选和激光显微切割技术是解决蛋白空间异质性的有效方法。但对于随后的蛋白质组学前处理过程，往往又带来样本量少(0.5～5μg)、蛋白浓度极低，以及蛋白质提取方法不兼容ms等问题。

3、fasp(filter-aided sample preparation)和sp3(single-pot,solid-phase-enhanced,sample preparation)是目前蛋白质组学前处理方法的金标准。fasp前处理法无法耐受洗涤剂浓度大于5％(洗涤剂浓度过高形成胶束无法透过超滤膜去除)，而且低蛋白浓度样本(蛋白浓度<50ng/μl)经多次清洗后，蛋白回收率仅约为10％且结果变异系数大。因此fasp前处理法并不适用于含有洗涤剂的微量样本。

4、sp3前处理法使用两种羧基磁珠对蛋白质进行富集，通过调整ph等条件提高蛋白回收率。sp3发明者认为其富集原理为亲水作用。但在实际实验中使用羧基磁珠时，大部分蛋白在反应体系的上清部分，且无法使用缓冲盐溶液将蛋白质从羧基磁珠表面完全洗脱下来，这与亲水作用原理相违背。sp3前处理法使用乙醇作为蛋白结合溶剂，蛋白回收率约50％，对于微量样本而言其损失率可达80％。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提出一种用于蛋白质组学的羧基磁珠富集蛋白的方法，校正sp3的实验原理，以提高蛋白回收率，尤其是微量蛋白回收率。

2、为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

3、第一方面，一种用于蛋白质组学的样品处理方法，所述方法包括以下步骤：

4、获取待处理样本的蛋白质溶解液；

5、对所述蛋白质溶解液进行去折叠化与巯基钝化；

6、制备羧基磁珠工作液，并按照预设的比例加入所述去折叠化的蛋白质溶解液；所述羧基磁珠的粒径为150nm～300nm；

7、使用有机试剂促进所述去折叠化蛋白质与所述羧基磁珠的结合。

8、可选地，所述待处理样本包括动物组织样本、动物细胞样本、石蜡包埋样本、植物组织样本、微生物样本、体液样本或亚细胞器样本。

9、具体地，所述蛋白溶解液依次通过破碎样本与裂解样本获得。

10、具体地，对所述蛋白质溶液进行去折叠化和巯基钝化，包括以下步骤：

11、95℃水浴所述蛋白质溶解液与添加烷基化试剂；或在所述样本蛋白溶解液中加入还原试剂与烷基化试剂；

12、所述还原试剂为二硫苏糖醇，所述烷基化试剂为碘乙酰胺。

13、第二方面，所述制备羧基磁珠工作液包括以下步骤：

14、取出冷藏保存的羧基磁珠储液，并恢复至室温；

15、对所述羧基磁珠储液进行磁分离，弃去上清，取分离后的羧基磁珠；

16、使用超纯水洗涤所述羧基磁珠，向装有羧基磁珠的管子加入超纯水，将管子置于混合仪上旋转混合3min～5min,磁分离，吸弃去上清，重复洗涤3次；

17、使用超纯水重悬洗涤后的羧基磁珠，即为羧基磁珠工作液。

18、第三方面，当蛋白浓度小于0.1μg/μl时，所述羧基磁珠与蛋白质溶液体积的混合比例为2:1；当蛋白质浓度大于0.1μg/μl时，所述羧基磁珠与蛋白质含量的混合比为20:1。

19、进一步地，所述有机试剂为纯乙腈，加入所述纯乙腈，使得纯乙腈终浓度为70％体积比。

20、具体地，加入所述纯乙腈后，所述羧基磁珠与所述去折叠化蛋白质孵育反应30min。

21、第四方面，所述孵育反应过程使得所述去折叠化蛋白质在所述羧基磁珠表面形成规则有序的基团，实现样本蛋白的富集。

22、相比现有技术，本申请的技术方案具有以下优点：

23、1.本申请校正了sp3的实验原理，设计了新的实验方法。sp3是通过两种羧基磁珠利用亲水作用原理对蛋白进行富集，通过本申请发现蛋白富集在微粒表面并非通过亲水作用原理，而是由磁珠作为载体，以成为蛋白沉淀的成核点实现蛋白的富集。

24、2.本申请通过使用更小粒径的羧基磁珠以及调整羧基磁珠与蛋白质的体积比可有效提高蛋白质的回收率，当样本中的蛋白浓度小于0.1μg/μl时，也可有效回收大量的蛋白质。

25、3.本申请使用纯乙腈作为促进蛋白质与羧基磁珠的结合试剂，由羧基磁珠作为载体，以成为蛋白沉淀的成核点，形成规则有序的基团，为后续洗脱蛋白提供良好基础。

26、4.本申请使用小粒径羧基磁珠，具有显著降低蛋白质组学前处理成本的优势，市面关于羧基磁珠的定价规则是粒径越大，则售价越昂贵。

27、本申请附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显。

技术特征：

1.一种用于蛋白质组学的样品处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据要求1所述的方法，其特征在于，所述待处理样本包括动物组织样本、动物细胞样本、石蜡包埋样本、植物组织样本、微生物样本、体液样本或亚细胞器样本。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白溶解液依次通过破碎样本与裂解样本获得。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述蛋白质溶解液进行去折叠化与巯基钝化，包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备羧基磁珠工作液包括以下步骤：

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当蛋白浓度小于0.1μg/μl时，所述羧基磁珠与蛋白质溶液体积的混合比例为2:1；当蛋白质浓度大于0.1μg/μl时，所述羧基磁珠与蛋白质含量的混合比为20:1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机试剂为纯乙腈，加入纯乙腈，使得纯乙腈终浓度为70％体积比。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入所述纯乙腈后，所述羧基磁珠与所述蛋白质孵育反应30min。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述孵育反应过程使得所述去折叠化蛋白质在所述羧基磁珠表面形成规则有序的基团，实现样本蛋白的富集。

技术总结
本申请提供一种用于蛋白质组学的样品处理方法，通过对含有蛋白质的样品进行前处理以及通过使用更小粒径的单种亲水羧基磁珠，根据蛋白浓度调节羧基磁珠的输入比例、调整蛋白结合步骤的有机试剂及比例、增加孵育时间优化实验条件，以达到提高蛋白质的回收率的效果，并且可有效避免试剂不兼容对蛋白质组学研究带来的影响。

技术研发人员：汪艳,王泳而,石俊敏
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24