一种原位观测共生真菌根外菌丝动态的方法

1.本发明属于菌根生态学的研究技术领域，具体涉及一种原位观测植物根系共生真菌根外菌丝动态的方法。


背景技术：

2.陆地上90％以上的高等植物根系与共生真菌形成菌根，共生真菌消耗植物通过光合作用固定的碳，在土壤中构建庞大的根外菌丝网络，帮助植物进行水分和养分的获取，共生菌根真菌菌丝的变化动态及其周转在土壤碳和养分循环中具有重要作用。然而，现有对共生真菌菌丝变化及其周转动态观测方法仍需改进。传统室内接种培养观察法通过利用培养液培养草本植物幼苗，人为接种特定菌种来观察共生菌根的根外菌丝的变化，与自然状态下实际土壤环境中植物选择的共生真菌有很大差异；同位素示踪方法是在实验开始和各阶段取样测定根外菌丝的同位素分配量，仅能从植物分配给共生真菌的同位素含量的变化间接推算出菌丝周转的速率和时间，但无法考虑共生真菌同化和代谢成其他组分的那部分同位素从而导致实验误差；微根管观测法和扫描仪观测法在理论上尽管能直接观察菌丝，但由于土壤中的根菌丝很细，一般都小于30μm，难以被肉眼所识别，并且受到取样范围的限制，无法准确区分共生真菌根外菌丝还是腐生真菌菌丝，因此，如何利用更精确的方法原位直接观测共生菌根真菌菌丝动态是菌根生态学研究的技术瓶颈。
3.中国专利(申请号：201210473731.9)中公开了一种一种生态环境勘察中的外生菌根菌丝野外原位动态监测方法，为微根管观测法。
4.主要有以下几个缺点：
5.1、尽管能直接观察菌丝，但由于土壤中的根外菌丝很细，一般都小于30μm，难以被肉眼所识别，影响后续图片提取的准确性。
6.2、受到取样范围的限制，无法准确区分共生真菌根外菌丝还是腐生真菌菌丝
7.3、采用微根管设备，其中使用透明的塑料管子一旦安装使用则不可移动，不可重复利用，使用软件为微根管配套专业软件，成本较高。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种原位、可操作性强、并能够直接观测目标树种的共生真菌根外菌丝动态的方法。
9.本发明具体技术方案如下：
10.一种原位观测植物根系共生真菌根外菌丝动态的方法，具体包括如下步骤：
11.1)制作底部和四周为钢化玻璃的透明玻璃根箱；
12.2)在玻璃根箱内种植目标树种；
13.3)组装由单反相机、连接器、体式显微镜和可调节前后和左右距离的支架构成的观测装置；
14.4)从透明玻璃根箱侧面观测并拍摄共生真菌根外菌丝图片，获取图片频率为一周
一次；
15.5)使用图片分析软件imagej获取共生真菌根外菌丝长度、直径、数量的动态数据。
16.本发明的有益效果：
17.1、本发明的研究方法将传统的体式显微镜(只能从上向下观测)进行物理和光学转换，使普通的数码相机之可以用来进行在玻璃根箱的侧面进行放大拍摄，拍摄面积广，取样范围大。
18.2、由于共生真菌菌丝的直径肉眼难以识别，必须在显微镜下才能清晰的观察到菌丝的形态；本发明中的观测装置不仅综合了前人微根管观测法和扫描仪观测法中无破坏性，连续、直观的优点，还结合了显微镜和高清数码相机拍照的优势，可以调节观测倍数以获取清晰、像素高的菌丝图片。
19.3、本发明采用imagej图片处理软件进行数据提取，imagej是一款专业的、开源的图片处理软件，可以手动追踪图片中菌丝的长度、直径、数量等参数，精确性高，简单易学，成本低。
附图说明
20.本发明有1幅附图。
21.图1为实施例1玻璃根箱结构示意图；
22.图2为实施例1拍摄装置结构示意图；
23.图3为显微镜放大20倍同一视野不同时间拍摄的乐昌含笑的共生菌根菌丝图片；
24.图4为用image j软件分别提取菌丝长度、直径、数量数据过程图；
25.图2中1-单反相机，2-连接器，3-体式显微镜，4-支架；
具体实施方式
26.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
27.实施例1
28.一种原位观测植物根系共生真菌根外菌丝动态的方法，具体包括如下步骤：
29.1、玻璃根箱制作：制作多个长宽高各80cm，底部和四周为4mm厚的钢化玻璃根箱，其中底部留孔，用于排水；在玻璃根箱底部填入去除根和石块后的野外采集的土壤，在玻璃根箱外围用3cm厚的高密度黑色橡塑海绵膜包裹一层，再用反射膜包裹一层，以防光线透入并防止吸热。
30.2、目标树种幼苗移栽：选取多种生长均匀(基径相近)且叶片健康的2年生幼苗作为目标树种，移栽前小心剥落目标树种根上的泥土，然后移栽于填满去除根和石块后的土壤玻璃根箱底部，目标树种移栽入玻璃根箱后，每2～3天浇一次水，保证土壤湿度田间持水量的60％左右；设置移栽同种目标树种的玻璃根箱3～4个，根箱数量可根据实验需求进行调整，每个玻璃根箱种植同种目标树种至少5株；
31.3、观测装置的组装：采用一台单反数码相机1(canon60d)、一个连接器2、一台体式显微镜3和一个可调节前后和左右距离的支架4组成(图4)，该装置的每个观测视野的拍摄面积是11.31mm
×
7.54mm，放大倍数范围是13.2～100倍。
32.4、菌丝观测：目标树种幼苗移栽一段时间后，随着目标树种植物根系的生长，打开
步骤1包裹在玻璃根箱四周的橡塑海绵膜和反射膜，使用步骤3组装完成的观测装置观测目标树种根系及共生真菌菌丝在玻璃根箱四周窗户出现的情况。
33.5、观察视野选择与图片拍摄：在移栽同种目标树种的多个玻璃根箱随机选择8个侧面，每个侧面选择5个观测视野，同一目标树种共选择40个视野进行观测和拍照。
34.在观测初期，对同一目标树种同一视野进行观测和拍照频率为每周1次。随着菌丝和根系形态结构变得稳定，观测和拍照的间隔可延长至每2～8周进行1次。同种目标树种的每次拍摄工作在一天内完成。
35.为了定期观测和拍摄的方便并减少土壤深度的影响，在每个玻璃根箱侧选择观测视野时，保证所有的观测视野在相同的土壤深度(距离土壤表面30cm左右)；要求所有选择的观测视野都是包含吸收根(至少一个根尖)的视野。
36.对菌丝进行观察和图片拍摄时，拍摄装置上显微镜的放大倍数可设为20倍、40倍和100倍，以便获取清晰的共生真菌菌丝图片。6、图片数据提取：将同一目标树种同一视野不同时间拍摄的图片按照时间序列排序，共生真菌菌丝首次出现，到菌丝断裂或消失的时间定义为共生真菌菌丝的存活时间。
37.例如，以乐昌含笑这一树种的共生真菌菌丝图片为例，(图3)首先将同一观测视野下拍摄的乐昌含笑吸收根图片按照时间序列排序，观察到图片中共生真菌菌丝于2013年，9月27日首次出现，而在2013年11月07日拍摄的图片中该共生菌丝消失，因此该共生真菌菌丝的存活时间计为42天；观察多个乐昌含笑共生真菌菌丝的存活时间，计算共生真菌菌丝平均存活时间。
38.使用imagej图片分析软件(https://imagej.nih.gov/ij/)提取每张图片中菌丝的长度、直径和数量数据。由于菌丝交织成网状结构，根外菌丝数量以菌丝与根连接点的个数为计算标准。根外菌丝的密度定义为图片中菌丝的数量除以图片面积。
39.打开image j软件，在image j的“file
→
open”菜单中导入要进行数据提取的图片；进行图片校准，选中工具栏中的直线工具，画一条与图片长边平行且等长的线段，选中菜单栏analyze
→
set scale，在known distance中输入11310(观测视野获取图片长为11.31mm)，在unit of length中输入长度单位μm，勾选global选项，将比例尺应用到相同放大倍数拍摄的图片中，点击ok。
40.校准后，对图片中显示的每个菌丝长度、直径、数量等数据分别进行提取：右键点击工具栏图标，选择segmented line工具，对图片中的菌丝的长度进行描绘和测量；使用键盘
“↑”“↓”
键进行图片缩放，选择直线工具对观察到的菌丝直径进行测量，同个菌丝不同位置测量3次，取均值为该菌丝的直径。
41.选择工具栏multi-point工具，点选图片中菌丝与根连接点，点的个数为图片中菌丝数量。该图片获得的菌丝的数量除以图片面积为共生真菌菌丝密度。见图4。