一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法与流程

本发明属于生物检测试剂，具体涉及一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂及其制备方法。

背景技术：

1、甘胆酸(cholylglycine，cg)，其结构式如式ⅶ所示：

2、

3、式ⅶ。

4、甘胆酸是由胆酸和甘氨酸结合而成的结合型胆酸，是胆汁酸的主要成分之一。胆固醇在肝细胞内经过极其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸，包含胆酸（ca）和鹅去氧胆酸（cdca），胆酸的类固醇核上有三个羟基（c3、c7、c12），侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合成为甘胆酸，分子量为 466.3。甘胆酸由肝细胞合成后，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物中脂肪的消化吸收。大部分胆汁酸在回肠和结肠被重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用，重吸收的甘胆酸又进入肝-肠循环，通过这种机制，机体能充分利用甘胆酸。在正常情况下，外周血中甘胆酸含量甚微，正常人无论空腹或餐后，其甘胆酸浓度都稳定在低水平。当人体肝细胞受损或胆汁淤滞时，就会引起甘胆酸代谢和循环紊乱，使肝细胞摄取甘胆酸的能力下降，导致血液中甘胆酸含量升高，且甘胆酸值高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。

5、研究指出：肝细胞一旦病变，血液中的甘胆酸浓度随即升高，肝胆疾病患者甘胆酸水平升高的阳性率很高，在肝病中具有出现早、恢复慢的特点，且较 alt、ast、总胆红素（tbil）、碱性磷酸酶（alp）、谷酰转肽酶（ggt）及血清白蛋白（alb）等常规肝功能指标更为敏感。各种肝脏疾病如：肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎等患者的甘胆酸水平均显著升高，因此甘胆酸可作为诊断这些疾病的良好指标。研究显示，肝硬化、急性肝炎、慢性活动性肝炎和胆石症等肝病患者的甘胆酸含量明显高于正常人，甘胆酸也是检测胆汁郁积和早期酒精肝损伤的重要指标。甘胆酸检测对其它多种疾病的诊断与治疗也具有重要的参考价值。研究发现：酒精性肝损害、黄疸、胆管胆囊排泄功能障碍、梗阻性肝病、肠-肝循环障碍等疾病患者的甘胆酸含量也显著高于正常人，甘胆酸检测对早期诊断这些疾病具有重要意义。此外，对妊娠期高血压及重度子痫的诊断也具有重要价值。

6、化学发光法是目前常用的体外定量测定甘胆酸含量的方法，该检测方法是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，这种激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测定甘胆酸的浓度。该方法灵敏度较高，但测定速度较慢，测试结果的准确度和试剂稳定性较差，而且需要昂贵的专用化学发光检测设备，不利于常规实验室开展，临床应用局限性明显。因此，针对现有技术中存在的缺陷，研发一种性能指标达到临床检测要求，灵敏度高、特异性强、稳定性好、结果准确，可应用于全自动生化分析仪的高通量、快速化检测的甘胆酸检测试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明所采用的技术方案是：

2、本发明一方面提供了一种甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，包括：r1试剂与r2试剂；

3、所述r1试剂由甘胆酸-共轭蛋白偶联物和r1缓冲液组成，所述r2试剂由抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球和r2缓冲液组成；

4、所述的甘胆酸-共轭蛋白偶联物由甘胆酸衍生物1与共轭蛋白偶联而成，其结构式如式ⅰ所示：

5、

6、式ⅰ；

7、所述甘胆酸衍生物1，结构式如式ⅱ所示：

8、

9、式ⅱ；

10、所述共轭蛋白为血清白蛋白；所述r1缓冲液为含有聚乙二醇20000与普瑞克宁300的tirs缓冲液；

11、所述的抗甘胆酸特异性抗体为甘胆酸免疫原免疫实验动物后得到的抗体；所述的甘胆酸免疫原由式ⅱ所示的甘胆酸衍生物2与载体蛋白偶联而成，其结构式如式ⅲ所示：

12、

13、式ⅲ；

14、所述甘胆酸衍生物2，结构式如式ⅳ所示：

15、

16、式ⅳ；

17、所述的载体蛋白是具有免疫原性的蛋白质或多肽；所述的实验动物为哺乳动物；

18、所述抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球由抗甘胆酸特异性抗体通过连接分子与胶乳微球偶联而成；

19、所述连接分子为马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯，其结构式如式ⅴ所示：

20、

21、式ⅴ；

22、式ⅴ中n为1-12之间的任意整数；

23、所述胶乳微球为表面带有氨基、羧基、羟基、巯基、酰肼基或氯甲基中任意一种基团修饰的聚苯乙烯胶乳微球，直径范围为50-450nm；

24、所述r2缓冲液为含有普瑞克宁300的磷酸钠缓冲液。

25、优选地，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、羊血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白中的一种。更优选地，所述血清白蛋白为羊血清白蛋白。

26、优选地，所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为血清白蛋白、甲状腺球蛋白、丙种球蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种；所述哺乳动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。更优选地，所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为牛丙种球蛋白；所述哺乳动物为家兔。

27、优选地，所述连接分子为马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯，其结构式如式ⅵ所示：

28、

29、式ⅵ；

30、优选地，所述胶乳微球为表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球，直径为200nm。

31、本发明另一方面提供了一种上述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，所述的制备方法包含以下步骤：

32、（a1）r1试剂的制备：将甘胆酸-共轭蛋白偶联物溶解于纯化水中，然后添加聚乙二醇20000、普瑞克宁300、三羟甲基氨基甲烷，搅拌均匀，将ph值调节至7.0-9.0，制得r1试剂；

33、（a2）r2试剂的制备：将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球加入纯化水中，然后添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、普瑞克宁300，搅拌均匀，将ph值调节至7.0-9.0，制得r2试剂。

34、具体地，上述的甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法包含以下步骤：

35、（a1）r1试剂的制备：将甘胆酸-共轭蛋白偶联物按照终浓度质量分数为0.01%的比例溶解于纯化水中，然后添加终浓度质量分数为0.1%的聚乙二醇20000、0.05%的普瑞克宁300，终浓度摩尔浓度为100.0mmol/l的三羟甲基氨基甲烷，搅拌均匀，将ph值调节至8.0，制得r1试剂；

36、（a2）r2试剂的制备：将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球按照终浓度质量分数为2.5%的比例加入纯化水中，然后添加终浓度摩尔浓度为8.0 mmol/l的磷酸氢二钠、5.0mmol/l的磷酸二氢钾，终浓度质量分数为0.05%的普瑞克宁300，搅拌均匀，将ph值调节至8.0，制得r2试剂。

37、优选地，所述甘胆酸-共轭蛋白偶联物的制备方法，包含以下步骤：

38、（b1）将共轭蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中，然后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下搅拌反应，得到共轭蛋白溶液；

39、（b2）将上述式ⅱ所示的甘胆酸衍生物1溶解于二甲基甲酰胺中，然后加入乙醇、磷酸钾缓冲液，搅拌均匀，得到甘胆酸衍生物1溶液；

40、（b3）将步骤（b2）得到的甘胆酸衍生物1溶液加入到步骤（b1）得到的共轭蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到甘胆酸-共轭蛋白偶联物。

41、具体地，所述甘胆酸-共轭蛋白偶联物的制备方法，包含以下步骤：

42、（b1）将200.0mg羊血清白蛋白溶解于100.0ml(10.0mmol/l、ph=5.0)的磷酸钾缓冲液中，然后加入400.0mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50.0mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下搅拌15分钟进行反应，得到羊血清白蛋白溶液；

43、（b2）将50.0mg上述式ⅱ所示的甘胆酸衍生物1溶解于10.0ml二甲基甲酰胺中，然后加入2.5ml乙醇、20.0ml(0.2mol/l、ph=8.5)的磷酸钾缓冲液，搅拌均匀，得到甘胆酸衍生物1溶液；

44、（b3）将步骤（b2）得到的甘胆酸衍生物1溶液加入到步骤（b1）得到的羊血清白蛋白溶液中，并在4℃下搅拌反应12小时，经透析纯化，得到甘胆酸-共轭蛋白偶联物。

45、优选地，所述式ⅱ所示的甘胆酸衍生物1的制备方法，其合成路径如下：

46、。

47、具体地，所述甘胆酸衍生物1的制备方法包括以下步骤：

48、（c1）化合物2的合成

49、

50、将化合物1 (250 mg，0.48 mmol)溶解于二氯甲烷(25 ml)中，然后在0℃下逐滴加入氯甲酸苄酯(85 mg，0.5 mmol)制成反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌12小时，然后将溶剂在真空中挥发去除，再通过硅胶层析柱进行纯化得到化合物2。

51、（c2）化合物3的合成

52、

53、将化合物2(160 mg，0.24 mmol)溶解于四氢呋喃(10 ml)中，然后在0℃下加入氢化铝锂(19 mg，0.5 mmol)制成反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌0.5小时，然后将甲醇加入溶剂中，并在真空中将溶液浓缩，再通过硅胶层析柱进行纯化得到化合物3。

54、（c3）化合物6的合成

55、

56、将化合物4 (500 mg，1.2 mmol)溶解于n,n-二甲基甲酰胺 (10 ml)中，然后在0℃下加入化合物5 (634 mg，1.0 mmol)、三乙醇胺(101 mg，1.0 mmol)及2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯 (380 mg，1.0 mmol)制成反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌12小时，然后将纯化水加入到溶剂中，接着进行过滤。将滤饼在真空中进行干燥处理得到化合物6。

57、（c4）甘胆酸衍生物1的合成

58、

59、将化合物6(825 mg，0.8 mmol)溶解于甲醇 (25 ml)中，然后在室温下加入钯碳催化剂(0.1 g)制成反应溶液。将反应溶液在充入氢气的条件下于室温下搅拌12小时，然后通过过滤将固体沉淀物去除，再将滤液进行浓缩。最后将浓缩产物通过制备级高效液相色谱进行纯化，得到甘胆酸衍生物1。

60、优选地，所述抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备方法，包含以下步骤：

61、（d1）将聚苯乙烯胶乳微球加入磷酸钠缓冲液中，轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中，离心后去除上清液，然后用磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬，制得胶乳微球悬浊液；将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中，制成马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液；将马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液加入胶乳微球悬浊液中，充分搅拌溶解，在室温下搅拌反应。反应结束后，将溶液离心，去除上清液，用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次，得到胶乳微球-连接分子偶联物。

62、（d2）将步骤（d1）制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液；将抗甘胆酸特异性抗体用硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液，将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中，然后在室温下搅拌反应；反应完成后，加入半胱氨酸，静置2小时，以阻断过量的马来酰亚胺反应位点；然后离心，去除上清液，再将沉淀物用硼酸钠缓冲液洗涤3次，得到抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球；最后将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于甘氨酸缓冲液中，加入叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。

63、具体地，所述抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球的制备方法，包含以下步骤：

64、（d1）将10.0mg直径为200nm的聚苯乙烯胶乳微球加入15.0 ml(10.0mmol/l、ph=7.2)的磷酸钠缓冲液中，轻柔振荡使聚苯乙烯胶乳微球悬浮于上述磷酸钠缓冲液中，10000r/min离心10分钟后去除上清液，然后用15.0 ml(10.0mmol/l、ph=7.2)的磷酸钠缓冲液将沉淀物重悬，制得胶乳微球悬浊液；将马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜(dmso)中，制成终浓度为20.0mmol/l的马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液；将马来酰亚胺-六聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液以体积比1∶20的比例加入胶乳微球悬浊液中，充分搅拌溶解，在室温下搅拌反应1小时。反应结束后，将溶液用10000r/min离心5分钟，去除上清液，用上述相同的磷酸钠缓冲液快速洗涤沉淀物两次，得到胶乳微球-连接分子偶联物。

65、（d2）将步骤（d1）制备的胶乳微球-连接分子偶联物重悬于10.0ml(10.0mmol/l、ph=7.2)的磷酸钠缓冲液中制成胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液；将1.0mg抗甘胆酸特异性抗体用5.0ml（50.0mmol/l、ph=8.2）的硼酸钠缓冲液稀释得到抗体溶液，将抗体溶液立即加入到上述胶乳微球-连接分子偶联物悬浊液中，然后在室温下搅拌反应6小时；反应完成后，加入50.0mmol/l的半胱氨酸，静置2小时，以阻断过量的马来酰亚胺反应位点；然后10000r/mim离心8分钟，去除上清液，再将沉淀物用10.0ml（50.0mmol/l、ph=8.0）的硼酸钠缓冲液洗涤3次，得到抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球；最后将抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球重悬于15.0ml（50.0mmol/l、ph=8.0）的甘氨酸缓冲液中，加入质量分数为0.01%的叠氮钠防腐剂于0-4℃下保存。

66、优选地，所述抗甘胆酸特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：

67、（e1）将上述结构式ⅲ所示的甘胆酸免疫原用磷酸钠缓冲液稀释，得到抗原溶液，然后将所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；

68、（e2）15-45天后，再用上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔10-20天注射一次，共计注射4-6次；

69、（e3）对步骤（e2）免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗甘胆酸特异性抗体；

70、具体地，所述抗甘胆酸特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：

71、（e1）将上述结构式ⅲ所示的甘胆酸免疫原用磷酸钠缓冲液(0.2mol/l、ph=7.5)稀释至终浓度为3.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将3.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射；

72、（e2）30天后，再用3.0ml上述的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述家兔注射一次，之后每隔15天注射一次，共计注射5次；

73、（e3）对步骤（e2）免疫后的家兔取血，分离纯化抗血清，得到抗甘胆酸特异性抗体。

74、优选地，所述结构式ⅲ所示的甘胆酸免疫原的制备方法，包含以下步骤：

75、（f1）将载体蛋白溶解于磷酸钾缓冲液中，得到载体蛋白溶液；

76、（f2）将上述式ⅳ所示的甘胆酸衍生物2与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到甘胆酸衍生物2溶液；

77、（f3）将步骤（f2）得到的甘胆酸衍生物2溶液加入到步骤（f1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到甘胆酸免疫原。

78、具体地，所述的甘胆酸免疫原的制备方法包括以下步骤：

79、（f1）将800.0mg牛丙种球蛋白溶解于100.0ml(0.3mol/l、ph=8.3)的磷酸钾缓冲液中，得到牛丙种球蛋白溶液；

80、（f2）将120.0mg上述式ⅳ所示的甘胆酸衍生物2、6.0ml二甲基甲酰胺、6.0ml乙醇、15.0ml(10.0mmol/l、ph=6.5)的磷酸钾缓冲液、150.0mg1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、30.0mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应2小时，得到甘胆酸衍生物2溶液；

81、（f3）将步骤（f2）得到的甘胆酸衍生物2溶液加入到步骤（f1）得到的牛丙种球蛋白溶液中，并在4℃下搅拌反应12小时，经透析纯化，得到甘胆酸免疫原。

82、优选地，所述式ⅳ所示的甘胆酸衍生物2的制备方法，其合成路径如下：

83、。

84、具体地，所述甘胆酸衍生物2的制备方法包括以下步骤：

85、（g1）化合物3的合成

86、

87、称取10.0 g（24.5 mmol）化合物1胆酸，将化合物1溶解于100ml无水二甲基甲酰胺（dmf）中，室温下加入7.04g（36.7 mmol）碳二亚胺盐酸盐（edci）、4.96 g（36.7 mmol）羟基苯并三氮唑（hobt）和10.7 ml（61.2 mmol）二异丙基乙胺（diea），再加入3.07 g（24.5mmol）化合物2甘氨酸，搅拌4小时，得到合成溶液；将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯（etoac）萃取，使用水和卤水冲洗有机层，加入na2so4干燥，通过减压方法使溶剂蒸发，得到化合物3，即甘氨胆酸。

88、（g2）化合物4的合成

89、

90、称取8.27 g（17.2 mmol）化合物3溶解于90 ml的吡啶中，0 oc下加入2.37 g（20.7mmol）甲基磺酰氯（mscl），将此溶液在室温下搅拌1小时，得到合成溶液。将上述合成溶液用水稀释后再用乙酸乙酯（etoac）萃取，使用水和卤水冲洗有机层，加入na2so4干燥，通过减压方法使溶剂蒸发，得到化合物4。

91、（g3）化合物5的合成

92、

93、称取10.0 g（18.0 mmol）化合物4溶解于100 ml的吡啶中，室温下加入20 ml的乙二醇，将此反应混合液加热至110 oc过夜。将上述反应混合液除去溶剂，残留物用水稀释后再用乙酸乙酯（etoac）萃取，使用卤水冲洗有机层，加入na2so4干燥，过滤，浓缩并通过fcc（dcm/meoh = 30/1）方法纯化得到化合物5。

94、（g4）化合物7的合成

95、

96、称取100 mg（0.191 mmol）化合物5和 64 mg（0.21 mmol）碳酸铯（cs2co3），共同悬浮于5 ml的无水二甲基甲酰胺（dmf）中，冰浴条件下加入41 mg（0.21 mmol）化合物6（溴乙酸叔丁酯），室温下搅拌反应过夜。将上述反应液用水稀释后再用乙酸乙酯（etoac）萃取，使用水和卤水冲洗有机层，加入na2so4干燥，过滤，浓缩并通过fcc（dcm/meoh = 35/1）方法纯化得到化合物7。

97、（g5）甘胆酸衍生物2的合成

98、

99、称取80 mg（0.13 mmol）化合物7 溶解于5 ml的二氯甲烷（dcm）中，冰浴条件下加入1 ml三氟乙酸（cf3cooh），室温下搅拌反应2小时。将上述反应液除去溶剂后用1n的氢氧化钠（naoh）调节ph值至9.0，再用乙酸乙酯（etoac）萃取。将水相用1n 的盐酸（hcl）调节ph值至6.0，再用乙酸乙酯（etoac）萃取。使用卤水冲洗有机层，加入na2so4干燥，浓缩得到甘胆酸衍生物2。

100、本发明的有益效果为：现有技术中的胶乳增强免疫比浊试剂常用的胶乳微球为表面带有羧基修饰的胶乳微球（羧基微球），羧基微球能与抗体（igg）上的氨基直接偶联。这种偶联方法较为简单，但偶联后的结果是偶联体（即抗体包被的胶乳微球）中抗体与胶乳微球表面之间的空间距离很小，同时抗体与抗体之间的间隔距离也很小，大量抗体分子相互挤压在一起，导致抗体没有足够空间与抗原进行识别结合反应，进而导致抗体活性和灵敏度下降，降低了抗体利用效率，造成了抗体浪费。

101、本发明使用的胶乳微球为表面带有氨基修饰的聚苯乙烯胶乳微球（氨基微球），首先使用马来酰亚胺-聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯（mal-peg-nhs ester）与氨基微球进行偶联反应，对胶乳微球进行修饰，再用修饰后得到的胶乳微球-聚乙二醇-马来酰亚胺偶联体（latex microspheres-(peg)n-mal）中的-(peg)n-mal作为连接分子，与抗体表面的巯基反应，得到胶乳微球-连接分子-抗体蛋白偶连体（即本发明中的抗甘胆酸特异性抗体包被的胶乳微球）。通过这种偶联方法能扩大抗体与胶乳微球表面之间的空间距离，同时增加抗体与抗体之间的间隔距离，避免抗体分子相互挤压，使抗体有足够空间与抗原进行识别结合反应，有效提高了抗体反应效率，减少了抗体使用量，节省了试剂成本，同时显著提高了甘胆酸检测的灵敏度。本发明的检测试剂可实现在全自动生化分析仪上对甘胆酸含量的高通量、快速化检测，且稳定性好、准确度高、特异性强、使用方便，检测效率显著提高，易于广泛推广使用。