一种高木质化、高异质化材料的石蜡切片制作方法

1.本发明涉及切片技术领域，特别是涉及一种高木质化、高异质化材料的石蜡切片制作方法。


背景技术：

2.当前，以石蜡切片为观察手段的树木维管束观察研究，通常选取低龄树苗或低年份生枝等观察其初生结构分化过程，而对于成年树次生维管束的研究通常以微生长锥钻取微树芯作为石蜡切片制作材料。例如张军周的微树芯石蜡切片制作技术就是以微生长锥钻取微树芯，经faa固定，甘油-乙醇法软化，再经常规的乙醇脱水，二甲苯透明后浸蜡包埋，常规的切片展片后染色封片。整体较常规的制片方法并未有太大改变。
3.而现文章公示效果较好的硬质石蜡切片制作方法为周乃富的木本植物非均质化组织石蜡切片制作方法，此方法以叔丁醇代替乙醇和二甲苯，简化了石蜡切片的切片步骤，并提出了过氧化氢-冰醋酸和叔丁醇-丙三醇复合处理的软化方法。此方法步骤如下：
4.1.材料经改良固定液(70％叔丁醇:35％
–
40％甲醛:丙酸:丙三醇＝85:5:5:5,v/v/v/v)固定后抽真空至材料下沉，固定48h以上。
5.2.将茎段置于过氧化氢-冰醋酸混合溶液(1:1，v/v)，抽真空30min，处理3h，再将材料转入装有70％叔丁醇-丙三醇混合溶液(1:1，v/v)的带盖玻璃瓶中，置于50℃恒温培养箱中处理2d。
6.3.采用叔丁醇梯度脱水法，即50％叔丁醇1.5h
→
70％叔丁醇1.5h
→
85％叔丁醇1.5h
→
95％叔丁醇1h
→
纯叔丁醇30min
→
纯叔丁醇30min。更换脱水剂后均进行抽真空处理。
7.4.将茎段浸在50％石蜡(叔丁醇:石蜡＝1:1，v/v)溶液中处理6h,温度54
–
56℃；然后转移到75％石蜡(叔丁醇:石蜡＝1:3，v/v)溶液中处理6h，温度56
–
58℃；最后转入预先熔化好的纯石蜡溶液中，温度58
–
60℃，每隔4h更换1次石蜡溶液，更换3次，整个过程在恒温箱中进行。再经常规切片展片染色封片。
8.此方法被证实可制作低木质化材料的石蜡切片。但此方法仍有很大局限性，由于叔丁醇透明效果不如二甲苯，此方法所用的软化方法也较温和，当实验材料为木质化程度很高的材料时，蜡带容易破裂，所制成切片也经常出现不完整的情况。


技术实现要素：

9.本发明的目的是提供一种高木质化、高异质化材料的石蜡切片制作方法，以解决上述现有技术存在的问题，实现高木质化、高异质化材料的石蜡切片制备。
10.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
11.本发明提供一种高木质化、高异质化材料的石蜡切片制作方法，包括以下步骤：
12.1)取样及固定
13.将材料取样后放入faa固定液中，抽真空后置于4℃冰箱固定72h以上；
14.2)软化
15.将固定处理后的材料置于盐酸-乙醇软化液或naoh-乙醇软化液中进行第一次软化，之后利用70vol％乙醇置换软化液，置换完成后，将材料置于甘油-乙醇软化液中进行第二次软化；所述盐酸-乙醇软化液为36％浓盐酸和无水乙醇体积比2:3的混合物；
16.所述naoh-乙醇软化液为naoh与70vol％乙醇质量体积比24g:100ml的混合物；
17.所述甘油-乙醇软化液为70vol％乙醇和丙三醇体积比1:1的混合物；
18.优选的，第一次软化处理的时间为2h，第二次软化处理的时间为2d；
19.3)脱水
20.材料软化结束后，利用乙醇溶液进行脱水；
21.具体的：将材料重复3次放入70vol％乙醇中处理，每次2h，最后一次结束后，将材料于70vol％乙醇中室温浸泡过夜；次日以70％-2h、85％-2h、95％-2h、100％-1h、100％-1h的乙醇浓度及时间梯度逐级进行脱水。
22.4)透明
23.将脱水后的材料在50vol％二甲苯+50vol％无水乙醇溶液中过渡，之后利用二甲苯进行透明，之后将材料置于50vol％二甲苯+50vol％石蜡混合溶液中在40℃下过夜；
24.5)浸蜡
25.在60℃条件下对材料进行浸蜡处理；
26.6)包埋
27.利用石蜡对浸蜡完成后的材料进行包埋；
28.7)切片、贴片及烤片
29.将包埋后的材料在50vol％甘油+50vol％水溶液中静置，之后进行切片、贴片、烤片，然后染色处理；
30.烤片完成后，将材料经二甲苯脱蜡，并利用50vol％二甲苯+50vol％无水乙醇进行过渡，之后复水、经番红染液浸染，然后脱水、固绿浸染。
31.复水时采用两次无水乙醇3min、95vol％乙醇3min、85vol％乙醇3min、70vol％乙醇3min、50vol％乙醇3min的顺序逐级复水。
32.番红浸染结束后经50vol％乙醇、70vol％乙醇、85vol％乙醇、95vol％乙醇以每次2min逐级脱水。
33.8)封片处理
34.进一步地，所述第一次软化的温度为55℃，时间为1-4h。
35.更进一步地，所述第一次软化的时间为2h。
36.进一步地，所述第二次软化的温度为50℃，时间为2-5d。
37.更进一步地，所述第二次软化的时间为2d。
38.进一步地，步骤8)封片处理具体步骤为：将染色后的切片依次经95vol％乙醇溶液、100vol％乙醇溶液、50vol％二甲苯+50vol％无水乙醇、2次二甲苯溶液逐级处理，后以中性树胶封片。
39.步骤8)中逐级处理过程中每次处理时间为2min。
40.当前，以石蜡切片为基础的树木维管束观察通常截取低龄树苗，低年份生枝的一段等作为观察材料，这类材料的石蜡制作工艺相对成熟，但这类方法只适合探究树木的初
生结构变化及低龄时期的组织分化过程等。高龄级的维管组织结构，组织分化情况及细胞的木质化沉积特征相较于低龄树苗和低年份生枝有很大差异，目前以微树芯为材料制作石蜡切片是常用的大树次生维管束观察手段，但这类方法仍有很大局限性，若材料为大块材料，树种为高硬度树种或为野外生长的不规则高木质化、高异质化的材料时仍存在石蜡切片制作困难的问题，因此衍生了多种包埋剂与其他切片机的组合以制作坚硬的切片材料，但以石蜡切片为基础方法制作高质量的高木质化的切片仍是难以解决的问题。
41.而周乃富等所公布的方法，虽然可制作木质化程度不高的材料，但在制作高木质化、高异质化的材料时效果较差，常出现切片不完整，破损等情况，难以获得高质量的石蜡切片。为解决这一难题，本发明提供了一种能够广泛用于不同龄级、不同树种的高木质化、高异质化的植物材料的石蜡切片制作方法，克服了当前以石蜡切片制作这类高木材料时切片破裂、卷曲、不完整的问题，经实验证实所制成切片结构完整、清晰，适用性极高，为观察树木茎干的次生生长过程奠定了基础。
42.本发明公开了以下技术效果：
43.本发明提供了一种能够广泛用于不同龄级、不同树种的高木质化、高异质化材料的石蜡切片制作方法，从而在保证切片脆弱组织完整性的前提下对材料进行软化处理，获得高质量的硬质切片。
附图说明
44.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
45.图1为本发明实施例1制备得到的树龄30年以上，胸径30cm+的马尾松木质部与落皮层石蜡切片，其中(a)为木质部、(b)为落皮层；
46.图2为本发明实施例2制备的胸径30cm+柏木维管束石蜡切片；
47.图3为本发明实施例2制备的胸径50cm+雪松维管束石蜡切片；
48.图4为本发明实施例3制备的马尾松一年生苗茎干石蜡切片；
49.图5为本发明对比例1制备的石蜡切片；
50.图6为本发明对比例2制备的切片样本；
51.图7为本发明对比例3未用木块底座的并且软化超时的切片；
52.图8为本发明对比例4制备的未经50％甘油浸泡的切片。
具体实施方式
53.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
54.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括
或排除在范围内。
55.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
56.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
57.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
58.本发明的切片制备方法包括如下步骤：
59.1)取样及固定
60.取样后放入faa固定液中，抽真空后置于4℃冰箱固定72h以上；
61.2)软化
62.为了适应不同硬度的材料，本发明软化过程提供了两种(强软化液+弱软化液)软化液组合：
63.①
细胞结构观察软化液组合：
64.(盐酸-乙醇)+(甘油-乙醇)＝(36％浓盐酸:无水乙醇体积比＝2：3)+(70vol％乙醇:丙三醇体积比＝1:1)。优点：以分解木质素的方式进行软化，大幅度降低切片硬度，可应对不同硬度等级的材料，组织结构完整，切片效果极佳。缺点：会与细胞的糖内含物发生反应，若要保留糖内含物不建议使用。
65.②
保留细胞内含物的软化液组合：
66.(naoh-乙醇)+(甘油-乙醇)＝(naoh与70vol％乙醇质量体积比为24g:100ml)+(70vol％乙醇:丙三醇体积比＝1:1)。优点：适应于大多数硬质材料，软化效果好，同时，对细胞内含物及结构性碳水化合物破坏小，可保留细胞内含的多糖内含物。缺点：软化能力略低于组合
①
。
67.具体的，naoh-乙醇软化液可由24g naoh溶于100ml70 vol％乙醇得到。
68.软化步骤如下：
69.将材料从固定液中取出放入玻璃瓶，倒入盐酸-乙醇软化液或naoh-乙醇软化液，软化液刚好浸没材料即可，最好不超过瓶子容积一半，放入55℃烘箱处理2h(可根据材料硬度适当调整，经软化处理时间探索，低硬度材料1h即可，naoh-乙醇软化最好不超过4h，盐酸-乙醇则不超过3h)。降温至室温后，放入70vol％乙醇中2h置换软化液，于烘箱中35℃置换2次后，将材料于常温下在70vol％乙醇中静置过夜，待软化液置换完全后将材料放入甘油-乙醇软化液中，软化液最好不超过玻璃瓶容积一半，密封好后置于50℃烘箱处理2天(可根据硬度适当加长，最好不超过5天)。
70.3)脱水
71.材料软化结束后，重复3次放入70vol％乙醇进行脱水及软化液置换，每次2h，前两次放入35℃烘箱处理，最后一次结束后室温过夜；次日以70％-2h、85％-2h、95％-2h、
100％-1h、100％-1h的乙醇浓度(体积浓度)及时间梯度逐级进行脱水；
72.4)透明
73.脱水后将材料在50vol％二甲苯+50vol％无水乙醇溶液中过渡2h，过渡完成后在纯二甲苯溶液中透明两次，时间均为2h，透明结束后置于50vol％二甲苯+50vol％石蜡＝1:1的混合溶液中，在40℃恒温箱中进行过夜存放；
74.5)浸蜡
75.浸蜡全程使用纯蜡(加热溶解后的液体石蜡)处理，浸蜡温度为60℃，期间共进行3次纯蜡的更换，间隔时间分别为4h、2h、2h，最后放入60℃烘箱中石蜡浸泡过夜；
76.6)包埋
77.待次日浸蜡完全后进行包埋，将融化的石蜡倒入包埋盒进行包埋，以酒精灯烧热镊子，用镊子在包埋盒中搅动去除气泡，随后把材料夹入冰盒中，根据需要调整材料的位置，于常温下冷却，待蜡块完全凝固后取出修样，要求前后左右相互平行，以融化的蜡粘附于木块上，要求粘附紧实，难以脱落；
78.包埋底座选用木块，常规包埋盒由于硬度与密度不足及水浴时连接的底座蜡块会变软，在切片时会因材料过硬产生轻微形变，影响切片效果。随后直接以高温融化的石蜡粘连蜡块，连接后以高温石蜡围绕蜡块滴定加固，保证切片时蜡块不脱落；
79.7)切片、贴片及烤片
80.在切片前，以丙三醇：蒸馏水体积比＝1：1配置50％甘油溶液，将样品于切片机上切片，切至想要的切面后倒置放入50％甘油溶液中于常温下静置，静置时间最好在12h以上，可长期静置(可静置多日，静置时间越长效果越好。)。静置结束后开始正式切片，若材料硬度极大，效果仍欠佳，还可将蜡块倒置放入50％甘油溶液后以37-40℃加热10min以上，使材料进一步软化，并降低材料与刀片间的摩擦力。用切片机将蜡块切成8～12μm的蜡带，将粘片剂滴于载玻片上，混合均匀，将蜡带平缓贴放于载玻片上，于展片机上以48℃展片，待蜡带充分展开后，倾斜载玻片，用吸水纸将多余的粘片剂吸掉，随后将载玻片放在40℃烘箱中干燥1-2d，之后进行染色；
81.具体的，可采用以下方式进行染色：
82.将切片经纯二甲苯脱蜡两次，每次10min，并以50vol％二甲苯+50vol％无水乙醇中过渡3min，随后以两次无水乙醇3min、95％乙醇3min、85％乙醇3min、70％乙醇3min、50％乙醇3min的顺序逐级复水，番红染液浸染14h。番红浸染结束后经50vol％乙醇、70vol％乙醇、85vol％乙醇、95vol％乙醇以每次2min逐级脱水，固绿浸染15-20s。
83.8)封片
84.将染色后的切片依次经95vol％乙醇溶液、100vol％乙醇溶液、50vol％二甲苯+50vol％无水乙醇、两次纯二甲苯逐级处理，每次2min，后以中性树胶封片。
85.下面结合实施例对本发明进行进一步详细的说明：
86.实施例1
87.制备树龄30年以上、胸径30cm+的马尾松木质部与落皮层石蜡切片(原材料特点木质化程度高，异质化程度高，内含大量石细胞)：
88.1)取样及固定
89.对木质部与落皮层分别取样后放入faa固定液中，抽真空后置于4℃冰箱固定72h；
90.2)软化
91.采用naoh-乙醇+甘油-乙醇软化液组合进行软化处理，其中naoh-乙醇软化液的配制为：将24g naoh溶于100ml 70vol％乙醇；甘油-乙醇软化液为70vol％乙醇和丙三醇体积比1：1的混合液。
92.软化步骤如下：
93.将材料从固定液中取出放入玻璃瓶，倒入naoh-乙醇软化液，软化液刚好浸没材料，且不超过瓶子容积一半，放入55℃烘箱处理3h，软化液处理结束后常温静置，温度降至常温后倒掉软化液，倒入70vol％乙醇后置于35℃烘箱中置换样本中残留软化液，2h一次，置换2次后，第3次常温过夜。第二天将70vol％乙醇倒掉后换用甘油-乙醇软化液于50℃烘箱中处理3d，之后将材料置于70vol％乙醇中，于35℃烘箱中置换样本中残留软化液，重复3次，每次2h，第3次常温过夜。
94.3)脱水
95.次日以70％-2h、85％-2h、95％-2h、100％-1h、100％-1h的乙醇浓度(体积浓度)及时间梯度逐级进行脱水；
96.4)透明
97.脱水后将材料在50vol％二甲苯+50vol％无水乙醇溶液中过渡2h，过渡完成后在纯二甲苯溶液中透明两次，时间均为2h，透明结束后置于50vol％二甲苯+50vol％石蜡的混合溶液中，在40℃恒温箱中进行过夜存放；
98.5)浸蜡
99.浸蜡全程使用纯蜡处理，浸蜡温度为60℃，期间共进行3次纯蜡的更换，间隔时间分别为4h、2h、2h，最后石蜡浸泡过夜；
100.6)包埋
101.待次日浸蜡完全后进行包埋，将融化的石蜡倒入包埋盒进行包埋，以酒精灯烧热镊子，用镊子在包埋盒中搅动去除气泡，随后把材料夹入冰盒中，根据需要调整材料的位置，于常温下冷却，待蜡块完全凝固后取出修样，要求前后左右相互平行，以融化的蜡粘附于木块上，要求粘附紧实，难以脱落；
102.7)切片、贴片及烤片
103.在切片前，50vol％甘油+50vol％蒸馏水溶液，将样品于切片机上切片，切至想要的切面后倒置放入50vol％甘油+50vol％蒸馏水溶液中于常温下浸泡过夜。用切片机将蜡块切成10μm的蜡带，将粘片剂滴于载玻片上，混合均匀，将蜡带平缓贴放于载玻片上，于展片机上以48℃展片，待蜡带充分展开后，倾斜载玻片，用吸水纸将多余的粘片剂吸掉，随后将载玻片放在40℃烘箱中干燥24h后用间苯三酚染色；
104.8)封片
105.将染色后的切片依次经95vol％乙醇溶液、100vol％乙醇溶液、50vol％二甲苯+50vol％无水乙醇溶液、两次纯二甲苯、纯二甲苯中逐级处理，每次2min，后以中性树胶封片。
106.图1为制备得到的树龄30年以上，胸径30cm+的马尾松木质部与落皮层石蜡切片，其中(a)为木质部、(b)为落皮层。
107.图中：c-维管形成层；xy-木质部；sc-石细胞；phe-木栓层；phl-木栓形成层；pe-栓
内层；co-皮层。
108.实施例2
109.制备胸径30cm+柏木维管束及胸径50cm+雪松维管束石蜡切片(原材料特点：木质化，异质化程度高)：
110.1)分别取样及固定步骤同实施例1
111.2)软化
112.采用盐酸-乙醇+甘油-乙醇软化液组合进行软化处理，盐酸-乙醇软化液为36％浓盐酸与无水乙醇体积比2：3的混合物；甘油-乙醇软化液为70vol％乙醇与丙三醇体积比1:1的混合物。
113.软化步骤如下:
114.将材料从固定液中取出放入玻璃瓶，倒入盐酸-乙醇软化液，软化液刚好浸没材料，且不超过瓶子容积一半，放入55℃烘箱处理3h，软化液处理结束后常温静置，温度降至常温后倒掉软化液，倒入70vol％乙醇后置于35℃烘箱中置换样本中残留软化液，2h一次，置换2次后，第3次常温过夜。第二天将70vol％乙醇倒掉后换用甘油-乙醇软化液于50℃烘箱中处理3d，之后将材料置于70vol％乙醇中，于35℃烘箱中置换样本中残留软化液，重复3次，每次2h，第3次常温过夜。
115.3)-6)同实施例1；
116.7)切片、贴片及烤片
117.在切片前，以丙三醇：蒸馏水体积比＝1：1配置50％甘油溶液，将样品于切片机上切片，切至想要的切面后倒置放入50％甘油溶液中于常温下浸泡过夜。用切片机将蜡块切成10μm的蜡带，将粘片剂滴于载玻片上，混合均匀，将蜡带平缓贴放于载玻片上，于展片机上以48℃展片，待蜡带充分展开后，倾斜载玻片，用吸水纸将多余的粘片剂吸掉，随后将载玻片放在40℃烘箱中干燥24h后；
118.将切片经纯二甲苯脱蜡两次，每次10min，并以1/2乙醇+1/2二甲苯中过渡3min，随后以两次无水乙醇3min、95％乙醇3min、85％乙醇3min、70％乙醇3min、50％乙醇3min的顺序逐级复水，番红染液浸染14h。番红浸染结束后经50vol％乙醇、70vol％乙醇、85vol％乙醇、95vol％乙醇以每次2min逐级脱水，固绿浸染15s。
119.8)封片步骤同实施例1。
120.图2为胸径30cm+柏木维管束石蜡切片，图3为胸径50cm+雪松维管束石蜡切片。其中：ph-韧皮部；c-维管形成层；xy-木质部。
121.实施例3
122.制备马尾松一年生苗茎干石蜡切片(原材料特点：木质化、异质化程度均适中)：
123.1)取样及固定步骤同实施例1
124.2)软化
125.采用盐酸-乙醇+甘油-乙醇软化液组合进行软化处理，盐酸-乙醇软化液为36％浓盐酸与无水乙醇体积比2：3的混合物；甘油-乙醇软化液为70vol％乙醇与丙三醇体积比1:1的混合物。
126.将材料从固定液中取出放入玻璃瓶，倒入盐酸-乙醇软化液，软化液刚好浸没材料，且不超过瓶子容积一半，放入55℃烘箱处理2h，软化液处理结束后常温静置，温度降至
常温后倒掉软化液，倒入70vol％乙醇后置于35℃烘箱中置换样本中残留软化液，2h一次，置换2次后，第3次常温过夜。第二天将70vol％乙醇倒掉后换用甘油-乙醇软化液于50℃烘箱中处理2d，之后将材料置于70vol％乙醇中，于35℃烘箱中置换样本中残留软化液，重复3次，每次2h，第3次常温过夜。
127.3)-8)同实施例2。
128.图4为马尾松一年生苗茎干石蜡切片。其中，ph-韧皮部；c-维管形成层；xy-木质部。
129.对比例1
130.以树龄30年以上的马尾松茎干木芯为原料，采用周乃富的木本植物非均质化组织石蜡切片制作方法制作石蜡切片：
131.1.材料经改良固定液(70％叔丁醇:35％
–
40％甲醛:丙酸:丙三醇＝85:5:5:5,v/v/v/v)固定后抽真空至材料下沉，固定48h。
132.2.将茎段置于过氧化氢-冰醋酸混合溶液(1:1,v/v)，抽真空30min，处理3h，再将材料转入装有70％叔丁醇-丙三醇混合溶液(1:1,v/v)的带盖玻璃瓶中，置于50℃恒温培养箱中处理2d。
133.3.采用叔丁醇梯度脱水法，即50％叔丁醇1.5h
→
70％叔丁醇1.5h
→
85％叔丁醇1.5h
→
95％叔丁醇1h
→
纯叔丁醇30min
→
纯叔丁醇30min。更换脱水剂后均进行抽真空处理。
134.4.将茎段浸在50％石蜡(叔丁醇:石蜡＝1:1，v/v)溶液中处理6h，温度54
–
56℃；然后转移到75％石蜡(叔丁醇:石蜡＝1:3，v/v)溶液中处理6h，温度56
–
58℃；最后转入预先熔化好的纯石蜡溶液中，温度58
–
60℃,每隔4h更换1次石蜡溶液，更换3次，整个过程在恒温箱中进行。再经包埋后直接切片。
135.图5为对比例1制备的石蜡切片，结果显示，切片破损严重，并不适用于高木质化材料的切片制作。
136.对比例2
137.制备过程同实施例1，区别仅在于省略步骤2)的软化步骤。
138.图6为对比例2制备的切片样本。结果显示：切片破碎。
139.对比例3
140.与实施例1不同之处在仅于，切片过程不使用木块底座，且步骤2)的软化过程使用单一盐酸-乙醇软化液进行软化：以盐酸-乙醇软化液于55℃烘箱中处理8h，后置于35℃烘箱中利用70vol％乙醇置换样本中残留软化液，2h一次，置换2次后，第3次常温过夜。
141.图7为未用木块底座的并且软化超时的切片。结果显示：切片时因包埋盒轻度形变导致厚度不一，并且幼嫩处破损明显。其中，ph-韧皮部；c-维管形成层；xy-木质部。
142.对比例4
143.采用木质化、异质化程度均很高的原材料制备石蜡切片：
144.1)取样及固定同实施例1
145.2)软化
146.采用盐酸-乙醇+甘油-乙醇软化液组合进行软化处理，盐酸-乙醇软化液为36％浓盐酸与无水乙醇体积比2：3的混合物；甘油-乙醇软化液为70vol％乙醇与丙三醇体积比1:1
的混合物。
147.软化步骤如下:
148.将材料从固定液中取出放入玻璃瓶，倒入盐酸-乙醇软化液，软化液刚好浸没材料，且不超过瓶子容积一半，放入55℃烘箱处理4h，软化液处理结束后常温静置，温度降至常温后倒掉软化液，倒入70vol％乙醇后置于35℃烘箱中置换样本中残留软化液，2h一次，置换2次后，第3次常温过夜。第二天将70vol％乙醇倒掉后换用甘油-乙醇软化液于50℃烘箱中处理2d，之后将材料置于70vol％乙醇中，于35℃烘箱中置换样本中残留软化液，重复3次，每次2h，第3次常温过夜。
149.3)-6)同实施例1；
150.7)不进行50vol％甘油+50vol％蒸馏水浸泡的过程，具体步骤如下：
151.用切片机将蜡块切成10μm的蜡带，将粘片剂滴于载玻片上，混合均匀，将蜡带平缓贴放于载玻片上，于展片机上以48℃展片，待蜡带充分展开后，倾斜载玻片，用吸水纸将多余的粘片剂吸掉，随后将载玻片放在40℃烘箱中干燥24h后；
152.将切片经纯二甲苯脱蜡两次，每次10min，并以1/2乙醇+1/2二甲苯中过渡3min，随后以两次无水乙醇3min、95％乙醇3min、85％乙醇3min、70％乙醇3min、50％乙醇3min的顺序逐级复水，番红染液浸染14h。番红浸染结束后经50vol％乙醇、70vol％乙醇、85vol％乙醇、95fvol％乙醇以每次2min逐级脱水，固绿浸染15s。
153.图8为对比例4制备的未经50vol％甘油+50vol％蒸馏水浸泡的30年以上树龄的马尾松茎干木芯切片。结果显示可能导致木质部不完整。其中，ph-韧皮部；c-维管形成层；xy-木质部。
154.与现有方法相比，本发明提出了
①
盐酸-乙醇+甘油-乙醇，
②
naoh-乙醇+甘油乙醇，两种软化液组合软化的软化方法，软化过程中可根据材料和需求不同进行软化调整，适用于不同的硬度等级的切片材料；并且相比于传统的切片方法，提出在正式切片前的软化处理，将蜡块以切片机切开后以50％甘油浸泡蜡块，甘油会随时间逐渐浸入蜡块的内含材料，甘油软化材料的同时，材料与刀片间的摩擦力也会进一步减弱，大幅度提升切片效果，还提出切片前37-40℃倒置于50％甘油静置10min以上的处理方法，进一步提升切片效果。此方法克服了当前石蜡切片制作方法制作高木质化，异质化材料时切片破裂，卷曲，不完整的问题，经试验证实所制成切片结构完整，清晰，适用性高。
155.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。