一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法与流程

1.本发明属于生物样本脂肪酸检测技术领域，特别涉及一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法。


背景技术：

2.骨质疏松是以骨量减少、骨微结构破坏为特征，致使骨的脆性增加、易于发生骨折的一种全身代谢性骨病。老年人尤其是绝经后女性罹患骨质疏松导致脆性骨折事件的概率急剧攀升，大大增加了医疗及家庭社会的支出成本，骨质疏松的防治已成为目前迫切需要解决的公共健康问题。大量研究表明骨质疏松在骨矿物质密度降低的同时伴随骨髓脂肪组织增加，骨髓脂肪细胞不仅仅填充扩大的骨小梁间隙，而且为骨髓提供必要的能量需求和稳定的骨髓微环境。最近的研究进一步表明骨髓脂肪细胞通过自分泌和旁分泌功能释放一系列蛋白、细胞因子、脂肪酸等，骨髓微环境中的脂肪酸可以调节涉及骨细胞生长、分化、炎症和凋亡过程的各种关键信号通路，激活/表达骨稳态中起重要作用的不同核转录因子，影响邻近骨细胞的存活与功能，最终可能触发骨质疏松。
3.既往大多数有关骨质疏松的代谢组学研究都分析了生物体血液(血清或血浆)的脂质代谢包括脂肪酸的变化，但是由于血液中脂肪酸含量检测技术在实际应用中存在较大不足，如各实验室的分析方法不一样、定量方法未统一、没有使用标定的质量控制物质校正结果、未对脂肪酸做甲酯化处理等，因此各个研究结果的可靠性较难评判。有学者最近对比研究了37名绝经后女性的髂嵴穿刺骨髓样本的骨髓上清液中的脂肪酸和血浆中的脂肪酸，结果表明，骨髓液中的脂肪酸不同于血液的脂肪酸，它包含了骨髓微环境中由骨细胞提供的脂肪酸和由血液循环主动提供的脂肪酸，能够准确反映骨骼的能量需求，暗示了骨髓微环境产生的脂质的重要性。骨髓液中脂肪酸的组成引起了研究者们的高度关注，成为研究热点，但由于骨髓液的获取相对繁琐而且骨髓液含量相对较少，因此，骨髓液的收集过程必须小心细致，同时采用灵敏的方法对骨髓液标本进行测定。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法，该方法能够便捷、准确、高效的提取检测卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液中的脂肪酸，是研究骨质疏松动物模型骨髓液中脂肪酸组成及其代谢途径的关键一步。
5.本发明提供了一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法，包括如下步骤：
6.(1)构建两侧卵巢切除诱导大鼠骨质疏松模型，术后4-12周处死大鼠，取出子宫分离大鼠两侧股骨，清除两侧股骨上的肌肉、筋膜，再用pbs液冲洗两侧股骨，置于培养皿中备用；(2)将股骨两端的骨端剪去约5mm，暴露骨髓腔，然后用pbs液冲洗股骨干骨髓腔、股骨骨
端，将含有骨髓的pbs冲洗液装入标记好的试管；将pbs液冲洗后的股骨干、股骨骨端一起放入装有氘化氯仿的试管中浸泡，进一步提取股骨残留骨髓脂质，获得含有骨髓脂质的氯仿冲洗液；
7.(3)配制51种脂肪酸甲酯混标溶液；将含有骨髓的pbs冲洗液浓缩干燥为组织粉末，采用硫酸甲醇法对组织粉末、步骤(2)中的含有骨髓脂质的氯仿冲洗液进行甲酯化预处理；利用gc-ms检测甲酯化预处理后的组织粉末、含有骨髓脂质的氯仿冲洗液样本，获得样本各组分总离子流色谱图，进而获得各组分峰面积，根据标准曲线方程计算得到脂肪酸含量，单位为μg/g。
8.所述步骤(1)中取一侧股骨装入冻存管后立即放入液氮中，次日行高空间分辨率micro ct扫描，测定松质骨感兴趣区内有关骨微结构参数。
9.所述步骤(3)中的配制51种脂肪酸甲酯混标溶液具体为：用正己烷配置成1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml，2000μg/ml十个混合标准浓度梯度，其中浓度为各组分的总浓度。
10.所述步骤(3)中利用eppendorf 5305真空浓缩仪将骨髓pbs冲洗液浓缩干燥为组织粉末。
11.所述步骤(3)中gc-ms色谱条件：色谱柱thermo tg-fame毛细管柱；进样量1μl，分流比8:1；进样口温度250℃，离子源温度230℃，传输线温度250℃，四极杆温度150℃；程序升温起始温度80℃，保持1min；以20℃/min升至160℃，保持1.5min；以3℃/min升至196℃，保持8.5min；最后以20℃/min升至250℃，保持3min；载气为氦气，载气流速0.63ml/min；
12.ms条件：电子轰击电离源，sim扫描模式，电子能量70ev。
13.有益效果
14.本发明能够便捷、准确、高效的提取检测卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液中的脂肪酸，是研究骨质疏松动物模型骨髓液中脂肪酸组成及其代谢途径的关键一步。本发明首先通过pbs冲洗股骨干骨髓腔、股骨骨端，获得大部分骨髓脂质，其次通过使用氘化氯仿对冲洗后的股骨干、股骨骨端进行浸泡，对未能冲洗下来的残留骨髓脂质进一步溶解、提取，减少大鼠股骨骨髓液中脂肪酸在提取过程中的丢失。本发明中的两个步骤操作简便易行，能够更加准确、有效地提取大鼠股骨骨髓液中的脂肪酸。
附图说明
15.图1为各组分总离子流色谱图；其中，上：空白；中：混标tic图；下：样本。
具体实施方式
16.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
17.实施例1
18.本实施例提供了一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法，包括以下步骤：
19.(1)卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠模型的构建：
20.构建两侧卵巢切除诱导大鼠绝经后骨质疏松模型。3月龄雌性sd大鼠经腹腔注射2％戊巴比妥钠(50mg/kg体重的剂量)进行麻醉，将麻醉后的雌性sd大鼠侧卧，用剃毛刀剃除雌性sd大鼠两侧下腹部的鼠毛，再用碘伏对雌性sd大鼠两侧下腹部皮肤消毒。用手术刀在雌性sd大鼠右侧髋关节水平上方约1cm处割开大鼠皮肤，然后依次切开脂肪组织、腹肌、腹膜，进入盆腔，沿输卵管找到右侧卵巢组织，以无菌手术线结扎输卵管及血管后切除右侧卵巢组织，再用无菌手术线缝合各层切口，关闭右侧盆腔，再次用碘伏消毒手术区域。使用上述相同方法切除雌性sd大鼠左侧卵巢组织。为了避免术后进一步感染，整个手术过程严格遵循无菌操作原则，所有雌性sd大鼠均谨慎缝合切口，且术后腹腔注射1ml哌拉西林他唑巴坦钠注射液。手术后的雌性sd大鼠常规饲养，自由饮水和进食。
21.(2)卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨的获取：
22.雌性sd大鼠双侧卵巢切除术后12周，腹腔注射200mg/kg戊巴比妥钠对雌性sd大鼠安乐死。采用手术解剖刀离断sd大鼠的髋关节、膝关节获得两侧股骨，再借助解剖刀刮除、咬骨钳夹除、纱布条摩擦清除两侧股骨上附着的肌肉、肌腱、筋膜，获得清洁的股骨，再用20ml常温pbs液冲洗清洁的股骨两遍。右侧股骨置于培养皿中备用。左侧股骨装入冻存管后立即放入液氮中，次日行高空间分辨率micro ct扫描，测定松质骨感兴趣区内有关骨微结构参数，包括骨矿物质密度[bmd]、骨容积系数[bv/tv]、骨连接密度[conn.d]、骨结构模型指数[smi]、骨小梁数[tb.n]、骨小梁厚度[tb.th]、骨小梁间距[tb.sp]等。结果显示股骨干骺端骨小梁数量明显减少，骨小梁间隙增加，骨皮质厚度变薄，骨质疏松建模成功。
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(3)从卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨中分离骨髓液，提取脂质：
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将右侧股骨两端的骨端剪去约5mm，暴露骨髓腔，然后用装满pbs液的2ml注射器冲洗股骨干骨髓腔、剪下的股骨骨端各5次，含有骨髓的pbs冲洗液装入标记好的试管。然后将pbs冲洗后的股骨干、股骨骨端一起放入装有20ml氘化氯仿(d:99.8％)的试管中浸泡1小时，进一步提取股骨残留骨髓脂质，从而获得含有骨髓脂质的氯仿冲洗液。
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(4)气相色谱-质谱(gc-ms)分析骨髓液中脂肪酸：
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51种脂肪酸甲酯混标溶液用正己烷配置成1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml，2000μg/ml十个混合标准浓度梯度。其中浓度为各组分的总浓度。51种脂肪酸甲酯的标准品中，各物质信息及浓度占比见下表1。母液保存于-80℃，工作标准溶液现配现用。
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表1脂肪酸物质信息
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利用eppendorf 5305真空浓缩仪将骨髓pbs冲洗液浓缩干燥为组织粉末：开启eppendorf 5305真空浓缩仪右侧电源，在time区按上下键来调节时间为15min，mode vent区调节到v-aq模式，然后按下start键，仪器开启运行，预热仪器15min。预热结束后，等lid旁的指示灯亮起，然后将浓缩仪的透明盖子向上翻起，取全部样本于2ml ep管对称式放入到相应的孔槽中。打开离心管管口，盖上浓缩仪的透明盖子，在time区调节时间为5h，在brake区选择on的模式，在温度区选择常温模式，在mode vent区选择v-aq模式浓缩，以上步骤全部完成后按下start键，仪器开启运行，这时vac旁的指示灯亮起，说明仪器开始正常工作。完成浓缩后，按下stop键停止运行仪器，然后等lid旁的指示灯亮起后，将浓缩仪的透明盖子向上打开。取出ep管，用手指弹一下，若是已经完全干燥，则取出离心管，盖上浓缩仪盖子；如果还有液体残留则重复上述步骤，继续浓缩至完全干燥。
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取骨髓pbs冲洗液组织粉末于2ml离心管中，准确加入1ml的氯仿甲醇(2:1)溶液，
加入100mg玻璃珠，放入高通量组织研磨仪中60hz震荡1min，重复2次；取适量骨髓氯仿冲洗液于2ml离心管中,准确加入1ml的氯仿甲醇(1:1)溶液，加入100mg玻璃珠，放入高通量组织研磨仪中60hz震荡1min，重复2次；将2个批次样本静置10min，12000rpm 4℃离心5min，取全部上清液于15ml离心管中；精确加入2ml1％硫酸甲醇溶液，充分混匀震荡1min；80℃水浴锅中酯化30min；取出后冷却，精确加入1ml正己烷萃取，振荡混匀30s，静置5min，再加入5ml ddh2o(4℃)洗涤,12000rpm 4℃离心10min；精准吸取700μl上清液于2ml离心管中，再加入100mg无水硫酸钠粉末除去多余水分，振荡混匀30s，12000rpm离心5min；精准吸取300μl上清液于2ml离心管中，加入15μl 500ppm水杨酸甲酯作为内标，振荡混匀10s，精准吸取250μl上清液加入到检测瓶中。
[0032]
色谱条件：色谱柱thermo tg-fame毛细管柱(50m*0.25mm id*0.20μm)；进样量1μl，分流比8:1。进样口温度250℃，离子源温度230℃，传输线温度250℃，四极杆温度150℃。程序升温起始温度80℃，保持1min；以20℃/min升至160℃，保持1.5min；以3℃/min升至196℃，保持8.5min；最后以20℃/min升至250℃，保持3min。载气为氦气，载气流速0.63ml/min。
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ms条件：电子轰击电离(ei)源，sim扫描模式，电子能量70ev。
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下表2为检测到51种脂肪酸的含量。
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表2卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸成分及含量
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由以上结果可知，通过pbs以及氘化氯仿两种提取方法均提取了一定含量的骨髓脂肪酸，本发明操作流程简单易操作，两种提取模式的结合能够更加准确、有效地提取卵巢
切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液中的脂肪酸，提高骨髓液中脂肪酸的检测提取效率。