用于质谱检测呼吸道病原体感染的前处理试剂组合物及其检测试剂盒的制作方法

本发明属于蛋白质谱检测领域。涉及一种利用飞行时间质谱技术快速检测新型冠状病毒和其它呼吸道病原体感染的产品。

背景技术：

1、近年来，已出现质谱技术用来检测新型冠状病毒感染者特征多肽的质谱技术，也就是说，当患者被新型冠状病毒感染后，体内会出现特异性特征多肽，通过检测这些特征多肽，能较为准确的鉴定感染结果。例如，detection ofsars-cov-2in nasal swabs usingmaldi-ms报道了基于maldi-ms直接检测鼻拭子样本的研究。该研究使用新型冠状病毒核酸检测剩余样本进行分析，基于机器学习的方法建立质谱检测模型，最高准确率为93.9％。但该研究没有对样本保存试剂进行改进，因而保存液中的部分成分严重影响了质谱谱图的质量。

2、novel application of automated machine learning with maldi-tof-ms forrapid high-throughput screening of covid-19:a proof of concept提出了结合机器学习和maldi-tof技术联合开发的新型冠状病毒入境检测方案。该方案检测性能与现有商业测试相当，且检测时间更短。可以完成1104次/仪器的日检测量。这项研究中的鼻拭子样本被保存在生理盐水中，靠紫外线照射质谱靶板来实现病毒灭活。虽然简单的保存液成分较大程度地减少了对质谱信号的干扰，但样本多肽在保存中易发生降解的问题依然存在。而且简单的紫外消毒和滞后的消毒步骤依然无法保证检测过程的安全性。

3、中国专利申请202010251209.0、一种新型冠状病毒n蛋白提取保存液及其制备方法和应用，公开了一种新型冠状病毒n蛋白提取保存液，包括：酪蛋白、抗生、牛血清白蛋白、乙基苯基聚乙二醇、抗红细胞单克隆抗体等。该发明所提供的新型冠状病毒提取保存液，其对鼻拭子、咽拭子、口腔拭子、肺泡灌洗液、痰液、唾液等不同样本具有较好的兼容性，为病毒样本提供了一个合适稳定的缓冲环境，利于样本检测和保存。然而，该发明只是用于免疫检测用途，并且该保存液成分复杂，并不适合大批量和快速检测爆发性新型冠状病毒的样品处理。

4、中国专利申请202010587255.8、一种提高核酸稳定性的保存液及其应用公开了一种提高核酸稳定性的保存液及其应用，本发明所述的保存液，包括三羟甲基氨基甲烷(tris)、非离子表面活性剂、edta、无机盐、山梨糖醇中的一种或几种。然而，该保存液是用于保存样品核酸，并不适合去保存含有被病毒感染后出现的特征多肽。

5、作为最接近的现有技术，中国专利申请201610150642.9、一种用于检测及分离样本的呼吸道病毒的样本前处理液公开了一种用于检测及分离样本的呼吸道病毒的样本前处理液，包括：(i)病毒保护剂，所述病毒保护剂选自下组：氯化钙、无水硫酸镁、氯化钾、氯化钠、无水磷酸二氢钠、无水葡萄糖、或其组合；(ii)显色剂；(iii)灭菌剂。其中，所述显色剂选自下组：苯酚红、中性红、或其组合。虽然该发明引入显色剂来提示样本保存状况，但该发明仍然是关注病毒的保存，而不是关注保存被病毒感染后所产生的特征多肽，因此上述前处理液仍然不适合去保存含有被病毒感染后出现的特征多肽。另外，该前处理液中包含氯化钙、硫酸镁、氯化钾等盐类化合物，在激光质谱电离中产生杂质，影响质谱信号，因此不适宜作为蛋白质谱的前处理溶液成分和基质成分。

6、综上，现有用于检测包括新型冠状病毒在内的呼吸道病原体的质谱检测试剂盒，均存在难以前处理样本的缺陷，如不能快速灭活病毒，或被灭活的病毒易于降解或出现干扰质谱信号，这都导致检测患者体内所出现的特征多肽或免疫多肽。

7、因此，目前需要一种用于前处理新型冠状病毒等呼吸道病原体的质谱检测试剂盒。

技术实现思路

1、本发明第一原理在于：在现有技术中，虽然已知乙醇能灭活和裂解病毒，但同时也会对蛋白或多肽进行变性失活，因此通常乙醇只是作为病毒灭活和裂解剂，而不会作为多肽或蛋白的保存液或前处理液。然而，发明人意外地发现，在特征多肽质谱中，即使是变性的多肽片段，经过电场激发裂解产生特定的多肽片段的分子量也不会改变，从而不影响具有指示性的特征图谱的采集。

2、本发明第二原理在于：发明人首次提出被病毒感染后，人体产生的特征多肽(可以是抗体片段，也可以是免疫反应后产生的非抗体的特征多肽，即免疫反应多肽产物或免疫多肽)，而通过本发明的预处理剂，能够检测这些特征多肽(免疫反应多肽产物)，从而完成最终鉴定。

3、本发明第三原理在于：验证了所加入的苯酚红，不仅不会影响质谱相应和多肽稳定性，还能作为指示剂显示前处理液的稳定性。

4、本发明第四原理在于：在前处理液中，所增加的甲酸可以辅助样本中的多肽在质谱中电离，提高质谱信号强度。

5、因此，本发明的第一个目的是提供一种用于检测呼吸道病原体的激光质谱检测的前处理试剂组合物，包括鼻拭子保存液、鼻拭子，其中所述鼻拭子保存液包含70％～80％乙醇(v/v)和苯酚红(10～200mg/l)，其中所述呼吸道病原体包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、sars病毒、mers病毒等。

6、在一个实施方案中，所述乙醇有灭活病毒等呼吸道病原体的作用，当鼻拭子样本采集后立即放入鼻拭子保存液中，并混合均匀，保存液可以在病毒保存的同时完成病毒的灭活，缩短检测时间。

7、在另一个实施方案中，苯酚红作为指示剂存在，可以直观的指示鼻拭子样本在样本保存液中的状态，当苯酚红颜色发生明显变化时，说明溶液体系的酸碱度发生了改变，进而说明鼻拭子中蛋白多肽组分发生酸碱类转化的化学反应，表明该样本组分已经不是初始状态，不可再用于质谱检测。

8、在其他实施方案中，鼻拭子保存液中同时含有乙醇、苯酚红和甲酸(0.2％～5.0％，v/v)，其中甲酸可以辅助样本中的多肽在质谱中电离，提高质谱信号强度。

9、在上述任一实施方案中，所述鼻拭子保存液的装量为0.2～4.0ml/管，优选是1.0～3.0ml/管。

10、在上述任一实施方案中，所述激光质谱选自maldi tof ms或clin-tof。

11、本发明第二个目的是提供包含上述试剂组合物且用于检测呼吸道病原体的质谱检测试剂盒，其还包括基质粉末、基质溶剂、质谱校准品、阳性质控品和阴性质控品，其中所述呼吸道病原体包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、sars病毒、mers病毒等。

12、在一个实施方案中，该试剂盒包括保证质谱仪所测分子量准确的校准品管。在一个具体实施方案中，校准品经质谱检测可以得到3～10个特征多肽峰，各个多肽峰的分子量相对均匀地分布在待测分子量范围。所述校准品管中的样品用于质谱仪质量轴的校准，并通过与待测样品进行平行质谱测试，以判断待测样品分子量信息是否准确可靠。

13、在一个优选的实施方案中，校准品包括促肾上腺皮质激素、细胞色素c和肌红蛋白，特征多肽峰的m/z分别为2465m/z、4121m/z、6181m/z、8477m/z、12362m/z、16952m/z。

14、在另一个实施方案中，该试剂盒还包括判断检测结果是否可靠的质控品。该质控品由混合蛋白多肽配制得到，阳性质控品具有与呼吸道病原体感染者相似的特征谱；阴性质控品具有与健康人相似的特征谱。质控品与待测样品进行质谱时进行平行质谱测试，以判断待测检结果是否准确可靠。

15、在上述任一实施方案中，所述激光质谱选自maldi tof ms或clin-tof。

16、本发明的第三个发明目的是提供所述试剂组合物在制备检测呼吸道病原体的质谱检测试剂盒的用途，其中所述呼吸道病原体包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、sars病毒、mers病毒等。

17、在一个实施方案中，所述试剂盒包括鼻拭子保存液、鼻拭子，其中所述鼻拭子保存液包含70％～80％乙醇(v/v)和苯酚红(10～200mg/l)。

18、在其他实施方案中，鼻拭子保存液中同时含有乙醇、苯酚红和甲酸(0.2％～5.0％，v/v)，其中甲酸可以辅助样本中的多肽在质谱中电离，提高质谱信号强度。

19、在上述任一实施方案中，所述鼻拭子保存液的装量为0.2～4.0ml/管，优选是1.0～3.0ml/管。

20、在上述任一实施方案中，所述试剂盒还包括基质粉末、基质溶剂、质谱校准品、阳性质控品和阴性质控品，

21、在上述任一实施方案中，该试剂盒包括保证质谱仪所测分子量准确的校准品管。在一个具体实施方案中，校准品经质谱检测可以得到3～10个特征多肽峰，各个多肽峰的分子量相对均匀地分布在待测分子量范围。所述校准品管中的样品用于质谱仪质量轴的校准，并通过与待测样品进行平行质谱测试，以判断待测样品分子量信息是否准确可靠。

22、在上述任一实施方案中，校准品包括促肾上腺皮质激素、细胞色素c和肌红蛋白，特征多肽峰的m/z分别为2465m/z、4121m/z、6181m/z、8477m/z、12362m/z、16952m/z。

23、在上述任一实施方案中，该试剂盒还包括判断检测结果是否可靠的质控品。该质控品由混合蛋白多肽配制得到，阳性质控品具有与呼吸道病原体感染者相似的特征谱；阴性质控品具有与健康人相似的特征谱。质控品与待测样品进行质谱时进行平行质谱测试，以判断待测检结果是否准确可靠。

24、在上述任一实施方案中，所述试剂组合物与现有的质谱检测试剂进行组合，可以制备所述质谱检测试剂盒。

25、在上述任一实施方案中，所述激光质谱选自maldi tof ms或clin-tof。

26、技术效果

27、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

28、1.本发明的试剂组合物或检测试剂盒10秒钟即可有效灭活鼻拭子样本中可能存在的病毒，并同时将样本中多肽转变为质谱峰信号，通过检测一组特征多肽质谱图谱的变化，进行新型冠状病毒、流感等疾病的诊断。

29、2.本发明样本前处理简便，对检测环境要求低，检测成本低，可做到一人一检，不需混样。相较于已有方法，基于质谱的新型冠状病毒免疫反应鼻拭子多肽特征谱检测方法更适用于大人群中新型冠状病毒感染者的快速筛查，以及流感等其它呼吸道病原体感染的快速检测。其中，现在的核酸检测采用混检方式原因在于检测方法复杂、检测时间长、检测通量低。如1人1检，效率上无法满足大规模筛查需求。混检是一种以牺牲灵敏度为代价来换取检测效率的无奈选择。质谱法主要优势就是速度快、检测简单、通量高。1人1检准确率高，且更有利于溯源和追踪患者的病程变化。因此，虽然本发明同样支持混检，但更多情况下不需要使用混检方式来检测患者。

30、3.与传统方法只针对病毒本身不同，本发明针对不同呼吸道病原体感染者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合进行检测，并同时关注多个免疫特征多肽的变化。

31、4.与核酸检测相比，本发明的方法具有无需额外的病毒灭活步骤、操作简单、检测成本低、通量高等优势，可以将整体检测时间缩短至1min/样本以内。不仅有利于大规模人群的快速筛查，而且在急诊等需要快速得到检测结果的场景中有很高的应用前景。

32、5.本试剂盒检测新型冠状病毒者的准确率达到100％，敏感度为100％，特异度为100％。该结果表明本发明可以满足实际检测需求。

33、6.本发明可以与市场上已有的用于检测新型冠状病毒等呼吸道病原体的质谱检测试剂(如检测基质、病毒特征多肽标志物等)进行组合，以制备相关质谱检测试剂盒。这些已有质谱检测试剂包括但不限于，本发明在先申请的202110155492.1、2021101552589、2021101589526等。以及，基于免疫反应特征多肽谱的鼻拭子检测新型冠状病毒的产品及用途(发明申请号：202211292701.8)。