一种基于金纳米颗粒冻融后颜色及构象变化的快速检测技术

1.本发明属于纳米颗粒检测领域，更具体地，涉及一种基于金纳米颗粒冻融后颜色及构象变化的快速检测技术，利用金纳米颗粒冻融后构象变化一方面能够实现快速检测，另一方面尤其可用于对低浓度目标物待测液进行检测达到降低检出限的目的。


背景技术：

2.在纳米材料中，纳米级的金纳米颗粒(aunps)因具有良好的生物相容性、独特的光学和化学性质，在检测、催化及治疗方向有广泛的应用。由于aunps在可见光区具有较高的消光系数，颗粒间的聚集会引起表面等离子体共振增强，吸收峰发生偏移，溶液颜色由红色逐渐变为蓝色。由于其成本低，变化肉眼可分辨，无需昂贵的光学仪器，常被应用于比色生物传感器。
3.基于上述特点，利用比色法对目标物进行特异性检测，需在aunps表面修饰上抗体、酶、多糖、氨基酸及巯基化合物。通常用的方法，利用点击化学和配位结合等的共价结合，也有用盐老化和低ph的物理吸附。比如，将dna预附着在aunps上，添加靶标会使得dna从aunps解吸，加入nacl会诱导aunps聚集。通过利用竞争结合的原理造成的溶液颜色的变化，直观的反映出靶标的浓度。
4.最近，有研究表明，可以通过冷冻将巯基修饰的随机dna序列装载至aunps上，冻融后溶液颜色仍呈酒红色；而未添加dna的aunps则发生了不可逆的聚集，溶液变为蓝色。向冻融后的样品中加入高浓度的盐，再分散的金纳米颗粒保持稳定。主要是因为冷冻延长和拉伸dna结构，会导致除水分子之外的所有分子被浓缩至冰晶的空隙中，增加相对接触面积，使dna更容易且更高密度负载在aunps上，形成稳定结构。也有研究关于aunps与蛋白冻融后的颜色变化，用于抗冻蛋白活性的快速分析。而中国专利cn113281507a公开了一种特异性分离金黄色葡萄球菌后并对其进行定量分析的试剂盒，根据万古霉素诱导胶体金冻融后发生聚集颜色变化，以a650/a520的比值快速判断金黄色葡萄球菌的浓度，虽然它也公开了在70min内对金黄色葡萄球菌的检测限为2.1cfu/ml，但仍存在当胶体溶液呈无色时，a650/a520的比值约为1，无法再探究更大的浓度范围等问题。
5.目前关于金纳米颗粒冻融的研究仅停留在靶标存在时，金纳米颗粒保持稳定结构；无靶标存在时，颗粒聚集变色。没有具体目标物的浓度与aunps聚集程度的关系，尤其是在颗粒聚集变色后形态变化的研究。


技术实现要素：

6.针对盐老化制备耗时超24小时和低ph的制备方法不能针对所有dna序列的缺点，本发明的目的在于提供一种基于金纳米颗粒冻融后颜色及构象变化的快速检测技术，其中利用金纳米颗粒(aunps)、待测液、第三种物质(可选)构建基于冷冻介导的目标物检测反应体系，先冷冻、再融化，利用冻融后体系的颜色变化和状态的变化，能够对目标物进行定性分析。本发明方法利用目标物诱导aunps在冻融后发生聚集变化，即可通过冻融后体系的颜
色变化和状态的变化，判断待测液中是否含有目标物；本发明通过关注状态变化(如，冻融后液面上漂浮的aunps聚集物的面积大小的变化等)，能够有效降低检出限，拓展aunps冻融方法的检测范围。本发明aunps冻融的方法耗时更短，更快捷方便，所有修饰巯基或聚腺嘌呤(polya)碱基的dna序列都能结合。另外，本发明能够对金纳米颗粒冻融前后颜色和状态变化进行统计分析，实现多种靶标的分析，为核酸或蛋白等目标物的检测等提供了一种快速便捷的方法。
7.为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种基于冷冻介导的目标物快速检测方法，其特征在于，该方法利用金纳米颗粒(aunps)的光学特性，将金纳米颗粒与待测液混匀后冻融，通过冻融后体系的颜色变化和状态的变化，判断待测液中是否含有目标物，从而能够对待测液的目标物进行检测。
8.作为本发明的进一步优选，所述状态的变化具体为冻融后液面上漂浮的aunps聚集物的面积大小的变化。
9.作为本发明的进一步优选，所述目标物为细胞外囊泡(evs)、蛋白、带巯基或聚腺嘌呤(polya)修饰的dna、细菌和病毒中的至少一种；冻融前的各混匀体系中，除金纳米颗粒溶液和待测目标物外，还可以进一步增加添加剂；所述添加剂优选为能够与待测目标物发生相互作用的物质，更优选为核酸适配体；其中，所述相互作用为静电相互作用、疏水作用、范德华力、亲和作用中的至少一种。
10.作为本发明的进一步优选，所述金纳米颗粒优选是以aunps分散液的形式与待测液混匀的；所述aunps分散液中aunps的浓度优选不超过10nm，优选为5nm；
11.所述aunps优选是由柠檬酸三钠还原的方法制备得到的；
12.所述aunps的尺寸为1-1000nm，优选为13nm；更优选的，所述aunps的表面还生长有pt壳或se壳，外壳的厚度为1-10nm，优选为2nm。
13.作为本发明的进一步优选，所述冻融中的冷冻处理是在-4℃至-196℃的温度条件下进行的，更优选是在-80℃的温度条件下进行的；
14.所述冻融中的融化处理是在4℃至37℃的温度条件下进行的，更优选是在25℃的温度条件下进行的。
15.作为本发明的进一步优选，所述待测液与金纳米颗粒混匀后，在冻融处理前，不会破坏aunps的稳定性。
16.作为本发明的进一步优选，所述方法还包括利用多个目标物浓度已知的标准品溶液建立回归曲线，具体的，对于任意一个标准品溶液，将金纳米颗粒与标准品溶液混匀后冻融，分析冻融后体系的颜色变化和状态的变化，如此利用多个标准品，即可拟合得到回归曲线；再通过将待测液的颜色变化和状态的变化与该回归曲线相对照，即可得到待测液中目标物的浓度。
17.按照本发明的另一方面，本发明提供了一种基于冷冻介导的目标物检测分类方法，其特征在于，该方法针对多个待测液样品，利用金纳米颗粒(aunps)的光学特性，将金纳米颗粒、第三种物质与每一个待测液样品混匀后冻融，冻融后不同待测液体系产生不同的颜色变化和状态的变化；利用不同的第三种物质，重复操作；通过统计不同待测液、不同第三种物质体系的颜色变化和状态的变化，利用机器学习方法，即可对不同待测液样品进行分类。
18.作为本发明的进一步优选，所述第三种物质优选为能够与至少一种待测液所含目标物发生相互作用的物质，更优选为核酸适配体；其中，所述相互作用为静电相互作用、疏水作用、范德华力、亲和作用中的至少一种。
19.通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，利用纳米金(aunps)、目标物(或可额外加入第三种物质)构建反应体系，先冷冻、再融化，利用冻融后体系的颜色变化和状态的变化，能够对目标物进行定性分析。不同于现有技术仅利用颜色的变化、存在检出限高等缺陷，本发明进一步通过冻融后体系状态的变化，即使在目标物浓度很低、混合体系冻融变为无色时，仍可利用状态的变化(如漂金面积，即，漂浮的aunps聚集物的面积)来半定量的检测目标物浓度(漂金面积与目标物的浓度呈正相关)，大大降低检出限。尤其是当冻融后的溶液呈无色时，传统检测方法将失效，而本发明则能够利用产生的漂金，基于目标物的浓度与漂金面积的相关性进行检测，大大降低检出限(以后文图5为例，检出限能够降低1～2个数量级)。
20.本发明之所以能够对待测液中的目标物进行高效检测，是因为经过冻融处理后：
21.当目标物浓度较高时，目标物能够高密度的结合到aunps上，aunps呈分散状态，溶液呈红色至无色，裸眼观察颜色变化或用全波长光吸收酶标仪扫描后进行统计分析；
22.而当目标物浓度较低时，aunps的稳定性被破坏，呈聚集状态漂浮在液面之上，溶液呈无色。在变为无色的更低数量级浓度范围内，漂金面积(即，漂浮的aunps聚集物的面积)大小与目标物浓度呈一定相关性，可以用裸眼观察初步判断，也可以光学显微镜进行拍摄更准确的统计。如后文实施例所示例的，基于本发明方法，当冻融后的溶液呈无色后，仍能发现在比传统检测方法(仅利用颜色的变化)检出限低1-2个数量级的浓度范围内，漂金面积与目标物的浓度呈正相关。
23.进一步，通过在体系中添加除纳米金及目标物外的第三种物质(即，添加物)作为辅助，结合图像识别和机器学习，可实现对多种目标物的分类判别。例如，在已知多种目标物浓度的前提下，通过在上述反应体系中添加至少一种除纳米金、目标物外的第三种物质，在不同组合中，同一目标物具有不同的显色或漂金面积大小不一致，利用图像识别及机器学习可对目标物进行分类。根据具体实验要求对目标物进行统计分析。
24.以后文实施例为例，图5中的a为0、200、500、1000、2000、5000ug/ml bsa与aunps冻融后的紫外吸收波谱。当bsa处于较高浓度时，在400-700nm的波长范围内，有良好的吸收曲线且波峰无明显偏移，说明aunps呈分散状态；图5中的b为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500、1000ug/ml的bsa与5nm aunps冻融后的a520/a650和漂金面积的数据统计；图5中的d从左至右从上至下依次是图5中b的每个数据点对应的实物图。在图5中的b和d中可看出，在50～1000ug/ml相对高范围内时，溶液中的aunps可能发生部分聚集，溶液呈有色状态，对应的液体融化状态为未观察到有明显的漂金产生；在0.2～20ug/ml范围内时，比值基本为1，表明溶液中的aunps已经发生完全聚集，此时有肉眼可见的漂金的产生。对漂金的面积进行统计后，发现bsa的浓度与漂金面积的大小呈正相关。
25.本发明的最大优势是扩大了aunps的检测范围，即漂金面积的发现。传统的冻融方法是依赖于金纳米的光学特性的比色传感检测，当目标物浓度较低时，因其含量不足以保护全部的aunps，aunps发生聚集后失去光学特性，溶液呈无色，认为该目标物浓度即为检测限。而在本发明的方法中发现，当溶液呈无色时，aunps以“漂金”的形式悬浮在液面之上，目
标物浓度与漂金面积的大小呈相关性，根据漂金面积的大小可对目标物进行检测，可将检出限浓度降低1～2个数量级。基于上述发现，本发明进一步拓展了aunps冻融方法检测目标物的检出限。
26.由于高浓度的离子会破坏aunps的稳定性，导致aunps直接聚集失去光学特性及冻融后的漂金产生，因此检测对象为要求所检测的目标物在冻融处理前不破坏aunps的稳定性(可表现为分别向aunps分散液中加入相同体积的待测液与超纯水，两个溶液体系的紫外吸收光谱一致)；本方法是基于aunps与目标物的直接冻融，适用于对单一待测物的半定量检测。未来可能通过结合适配体或抗体等方法，使用间接检测的方法达到特异性检测并借助“漂金”的现象拓展检测限。
27.可见，本发明能够取得以下有益效果：
28.1、本发明利用冷冻融化后aunps后的颜色变化(酒红色至无色)作为检测手段，相较于盐老化、低ph的方法，具有耗时低、操作简单的特点，可用于对evs、细菌和病毒等进行检测。
29.2、本发明继发现变化至无色后，还会有漂金面积大小的变化，漂金面积与目标物浓度具有相关性。漂金面积与目标物浓度具有一定相关性，若aunps与目标物直接结合时，冻融后漂金面积与目标物浓度呈正相关。若间接检测目标物时，即溶液中存在第三种物质，且该物质和aunps与目标物竞争结合，漂金面积与目标物浓度呈相关关系(如后文实施例中所展示的正相关；当然，也不排除存在负相关的情况)。
30.3、进一步，通过在体系中添加至少一种除纳米金、目标物外的第三种物质(包括但不限于核酸、蛋白及小分子)，在不同的组合中，同一目标物具有不同的显色或漂金面积大小不一样，利用图像识别及机器学习可对目标物进行分类。以后文实施例为例，如图9所示，以乳腺细胞系的细胞外囊泡(evs)为例，添加纳米金和不同dna序列冻融后，结合漂金面积统计的热图及机器学习分类图，可用于区分乳腺细胞的亚型。
31.4、利用本发明，可实现蛋白、核酸和多糖等的检测，进一步分析不同的因子加入aunps/靶标后的变化，可对其进行分类分析。
附图说明
32.图1为本发明aunps与不同浓度靶标混合后示意图。
33.图2为aunps与不同浓度靶标冻融后示意图。
34.图3为aunps与不同浓度靶标混合后实物图(自左至右的7个样品浓度分别为0、5、10、25、50、100、200ug/ml)
35.图4为aunps与不同浓度靶标冻融后实物图(自左至右的7个样品浓度分别为0、5、10、25、50、100、200ug/ml)
36.图5为aunps的颜色变化和状态变化与bsa浓度的关系；其中图5中的a为不同浓度bsa与5nm aunps冻融后的紫外吸收光谱(浓度分别为0、200、500、1000、2000、5000ug/ml)；图5中的b为不同浓度(即，0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500、1000ug/ml)的bsa与5nm aunps冻融后的a520/a650和漂金面积的数据统计；图5中的c是不同温度对冻融结果的影响；图5中的d从左至右、从上至下依次是图5中b所示bsa浓度由小到大每个数据点对应的实物图(图中所示各样品小图中，红色标记线范围内的可作为重点的aunps聚集物面积比对对
象)。
37.图6为aunps与不同浓度的巯基修饰dna冻融后实物图，从左至右6个样品浓度依次为0、79、158、237、316、395nm。
38.图7为aunps与不同浓度ev及dna序列冻融的实物图；其中，图7中的a对应浓度0、1.6、3.2、6.4、12.8ug/ml的evs与5nm的aunps的冻融后的实物图，图7中的b对应浓度0、1.6、3.2、6.4、12.8ug/ml的evs与5nm的aunps和79nm的寡核苷酸序列冻融的实物图，图7中的c所示为添加寡核苷酸序列前后对evs的检测的拟合线斜率的变化。
39.图8为添加第三种物质用于多种已知浓度的未知样品的分类示意图。
40.图9为aunps和ev与不同的dna序列冻融用于乳腺细胞分类判别；其中，图9中的a为79nm的不同dna序列和5nm aunps及0.04mg/ml的evs冻融后漂金面积的统计图，图9中的b为该方法用于区分正常细胞和癌症细胞的效果，图9中的c采用分类判别用于细胞亚型的区分。
41.图10为金纳米颗粒冻融后颜色及构象变化的示意图。
具体实施方式
42.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
43.基于本发明，在实际应用时，可以包括如下步骤：
44.(s1)制备纳米尺寸的aunps，将5mg/ml的bsa按浓度梯度稀释得到标准品；标准品与aunps按一定体积比在96孔板混匀后冷冻，待其彻底冷冻后放置室温融化；观察冻融后样本的颜色、状态变化，为后续对未知的待测液样品的检测判断提供依据；
45.(s2)而对于待测液，将待测液与准备好的aunps按一定体积比在96孔板混匀后冷冻，待其彻底冷冻后放置室温融化；观察冻融后样本的颜色和状态变化，进而对待测液中是否含有目标物以及目标物的浓度进行定性和半定量分析。
46.例如，可以包括以下步骤：
47.(1)制备aunps：按照经典柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备纳米尺寸的aunps，4℃保存备用；
48.(2)靶标准备：考虑到保证待测靶标的生物活性，将待测的靶标用pbs按浓度梯度稀释，以避免高离子浓度导致的aunps聚集，如：针对5nm的aunps的体系控制pbs的终浓度低于2mm；
49.(3)冷冻融化：制备好的浓度梯度的bsa与aunps按1:1的体积比在96孔板混匀后冷冻，待其彻底冷冻后放置室温自然融化为液体状态，如图1-4所示，将目标物(溶液无色且阳离子浓度低于5nm)与靶标混匀后放置于孔板内，溶液保持酒红色，经过冻融后，由于目标物浓度不相同，孔板内的溶液呈现不同程度的红色或漂浮着aunps聚集物或漂浮着aunps聚集物；为后续的待测样品的定性及半定量提供依据；
50.(4)检测：观察冻融后样本的颜色及状态变化。
51.当靶标浓度较高时，能够高密度的结合到aunps上，aunps呈分散状态，溶液呈不同
程度的红色；但当浓度较低时，靶标不足以完全保护aunps，aunps成聚集状态漂浮在液面之前，溶液呈无色。且在接近无色的一个数量级浓度范围内，漂浮的aunps聚集物的面积(即，漂金面积)与靶标浓度呈相关性。
52.以下为具体实施例：
53.实施例1：利用aunps的比色及漂金面积对牛血清白蛋白(bsa)进行超敏定量检测。
54.(1)待测bsa按浓度梯度稀释好后备用(浓度分别为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000ug/ml，当浓度低于0.2ug/ml时，漂金面积不在发生变化，因此没有选用更低的浓度)；
55.(2)用柠檬酸三钠还原氯金酸制备直径为13nm浓度为10nm的aunps，4℃避光保存备用；具体的，可参照现有技术，将100ml的0.01％氯金酸搅拌加热至沸腾，再加入10ml 38.8mm的柠檬酸三钠，继续加热20分钟后，关闭加热，搅拌冷却至室温；
56.(3)向干净的96孔板内按1:1的体积比加入不同浓度的bsa和aunps混合均匀。待其冷冻彻底后，室温静置融化为液体状态；
57.(4)观察冻融前后样品颜色及形态的变化。有颜色的部分用全波长光吸收酶标仪进行检测，无色的部分用光学显微镜记录漂金面积的大小；
58.(5)结果观察如图5所示，图5中的a为0、200、500、1000、2000、5000ug/ml bsa与aunps冻融后的紫外吸收波谱。当bsa处于较高浓度时，在400-700nm的波长范围内，有良好的吸收曲线且波峰无明显偏移，说明aunps呈分散状态；
59.(6)为准确计算bsa浓度与aunps聚集程度的相关性，用a520/a650的比值表示。图5中的b为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500、1000ug/ml的bsa与5nm aunps冻融后的a520/a650和漂金面积的数据统计；图5中的d从左至右、从上至下依次是图5中b所示bsa浓度由小到大的每个数据点对应的实物图。在图5中的b和d中可看出，在50～1000ug/ml相对高范围内时，溶液中的aunps可能发生部分聚集，溶液呈有色状态，对应的液体融化状态为未观察到有明显的漂金产生；在0.2～20ug/ml范围内时，比值基本为1，表明溶液中的aunps已经发生完全聚集，此时有肉眼可见的漂金的产生。对漂金的面积进行统计后，发现bsa的浓度与漂金面积的大小呈正相关。
60.(7)为了评估反应温度对实验结果的影响，在-20、-80℃和液氮中分别对标准品进行冻融，结果如图5中的c所示，不论是有色区间统计的a520/a650，还是无色区间统计的漂金面积大小，冻融的温度对最终的结果没有明显差异。而要溶液达到完全冷冻的状态，-20℃时需要2小时，-80℃需要30分钟，液氮中仅需要2分钟。如果为了快速得到实验结果，可使用液氮冷冻后，37℃水浴融化，可在10分钟内完成整个过程。但考虑到液氮储存不便，也为了避免漂金的形态及大小因稳定性不好产生变化影响实验结果，本实验选用-80℃冷冻和室温静置自然融化。
61.(8)将待测蛋白样品与aunps按1:1的体积比冻融后，通过颜色变化进行定性判定，进一步通过形态变化与上述bsa的检测范围对比进行半定量检测。
62.实施例2：利用aunps的漂金面积对核酸进行超敏定量检测。
63.(1)对随机的dna序列进行巯基修饰或末端添加聚腺嘌呤(polya)；
64.(2)用柠檬酸三钠还原制备直径为13nm浓度为10nm的aunps，4℃避光保存备用；
65.(3)向干净的96孔板内按1:1的体积比加入dna序列和aunps，引物序列为5’caccc
cacctcgctcccgtgacactaatgctatttttt-sh3’。为了验证dna序列是否会有漂金面积的变化，使用较低浓度的dna与aunps冻融。如图6所示，从左至右浓度依次为0、79、158、237、316和395nm，与10nm的aunps混合均匀后，冷冻后放置室温自然融化为液体状态；
66.(4)观察冻融前后，样品颜色及形态的变化。有颜色的部分全波长光吸收酶标仪进行检测，无色的部分可以裸眼观察或用光学显微镜记录漂金面积的大小。
67.(5)为研究巯基修饰的或带有polya的dna序列与aunps冻融后在溶液无色的范围内，是否也会产生漂金面积的变化。如图6中所示，裸眼观察到漂金面积的产生，且随着dna浓度的增加，漂金面积也在增加。光学显微镜的观察更是验证这一结果的准确性。
68.实施例3：本发明结合冷冻介导的aunps快速检测细胞外囊泡(evs)来详细阐述。
69.(1)从1ml血清中按照超速离心法或其他方法(如超滤，微流控芯片分离)的方法提取ev，最终用0.2m的pbs重悬后，避免过高的离子浓度破坏aunps的稳定性，导致溶液直接变色；
70.(2)如图7中的a所示，将提取好的ev样本进行浓度测定并依次稀释至终浓度为3.2、6.4、12.8和25.6ug/ml，并用0.2m的pbs作为对照；
71.(3)用柠檬酸三钠还原制备直径为13nm浓度为10nm的aunps，4℃避光保存备用；
72.(4)将上述稀释过的ev和10nm的aunps按1:1的体积比混合均匀后，加入100微升至干净的96孔板内，待其冷冻彻底后，放置室温自然融化为液体状态；
73.(5)裸眼初步观察冻融前后，样品颜色及形态的变化。若溶液有颜色的，用全波长光吸收酶标仪进行检测，无色的部分用光学显微镜记录aunps的漂金面积。如图7中的a所示，裸眼观察到漂金的产生，并用光学显微镜进行观察，随着evs浓度的增加，漂金面积也在增加。
74.(6)如图8示意图所示，为进一步研究在体系中添加除纳米金和evs外的第三种物质——随机dna序列，漂金面积的变化趋势是否会改变，能否进一步用于目标物分类。在已知浓度梯度的目标物中添加相同浓度的同一dna序列进行冻融。结果如图7的b所示，从左至右，依次是终浓度为0、1.6、3.2、6.4和12.8ug/ml的evs和10nm的aunps及79nm的dna序列的100ul混合体系冻融后的漂金实物图。引物序列为5’caccccacctcgctcccgtgacactaatgcta 3’。结果发现，在保持evs的浓度梯度和dna序列的浓度不变时，漂金面积的大小和evs的浓度呈正相关。如图7中的c所示，比较仅含evs及aunps和添加有dna序列的evs及aunps，两种体系在分析漂金面积和evs浓度相关性的斜率的差异性，结果发现，二者都呈正相关，虽然数值有差异，但均显示漂金面积的大小随evs的浓度增加而增加。总体而言，加入第三种物质不影响该方法的准确性。
75.(7)为了能够对已知浓度的未知来源的evs进行分类，将乳腺系细胞(mcf-10a、mcf-7和mda-mb-231)来源的evs用缓冲液稀释至终浓度为0.04mg/ml；
76.(8)将上述稀释的ev和与10nm的aunps按1:1的体积比混匀后，分别向96孔板内加入100ul混合物，并分别加入8种2微升终浓度为79nm的dna序列进行冻融。8种序列(5'to3')分别为：
77.序列1：caccccacctcgctcccgtgacactaatgcta；
78.序列2：
79.cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttgg cctg；
80.序列3：
81.gggccgtcgaacacgagcatggtgcgtggacctaggatgacctg agtactgtcc：
82.序列4：aattaaagctcgccatcaaatagc；
83.序列5：
84.atctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttaga；
85.序列6：tacaggttctggggggtgggtggggaacctgtt；
86.序列7：
87.tatcaattacttaccctagtggtgtgatgtcgtatggatg；
88.序列8：caccccacctaaaaaaaaaaacactaatgcta。
89.对冻融后的漂金面积进行归一化处理，分析不同组合的ev、aunps和dna序列的差异。如图9中的a所示；不同的evs对不同的dna序列响应不同。如图9中的b所示，该混合体系在区分正常和癌症细胞有显著性差异。对数据进行机器学习后，结果如图9中的c所示，图例1、2和3分别为mcf 10a、mcf-7和mda-mb-231。可以将癌症细胞来源的evs和正常细胞来源的evs区分开来，但在区分不同种类的癌症细胞来源的evs的能力还有待提升。
90.上述实施例仅为示例，例如，aunps聚集漂浮物的图像采集，既可以是光学显微镜，也可以是手机摄像头或其他便捷拍摄设备。另外，基于本发明检测机理，目标物与aunps的体积比可根据需要调整(上述实施例中采用的是1:1)，也可将aunps从10nm稀释至更低浓度后按比例混合。
91.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。