雪茄烟叶霉变早期监测方法及霉变标志物与流程

1.本发明属于烟叶仓储检测技术领域，具体涉及一种雪茄烟叶霉变早期监测方法及霉变标志物。


背景技术：

2.霉变一直以来都是困扰全球烟草行业的棘手问题之一，在烟草及烟草制品生产和加工的各个环节均存在霉变风险。因烟草中含有霉菌生长所需的各种营养物，一旦温湿度等环境条件适宜，易滋生各种霉菌，导致烟草变质，增加烟草成本。因此，目前逐渐认识到预防或控制烟草霉变的重要性，烟草霉变控制也正在受到越来越多的研究机构或烟草生产企业的关注。但行业对于霉变的研究起步较晚，研究深度较浅，主要研究方向集中在霉变发生的环境因方面，对致霉微生物的分离鉴定、致霉性等不够明确，霉变防控也缺乏系统和深入的研究，难以形成有效的霉变防控技术手段。
3.相比于传统卷烟，雪茄烟叶内含物质丰富，其中的致香成分和挥发性成分更多，使得影响霉变标志物确定的干扰因素比较多。雪茄烟由于其独特的加工工艺，高温高湿工艺条件多、转序待用的烟叶驻停时间长、工器具和环境卫生条件差和产品处于非密封体系等原因，使雪茄烟生产面临更大的霉变风险。而且由于雪茄烟叶内含物质丰富，使其在较高的温湿度条件和致霉微生物的作用下极易滋生霉菌，使得雪茄烟储存和加工过程中的霉变因素更多更复杂，难以尽早发现雪茄烟叶霉变，进而增加了雪茄烟霉变控制的难度。
4.然而，目前烟草及烟草制品霉变标志物筛选常用的检测方法有顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪(hs-spme-gc-ms)、气相色谱或液相色谱串联质谱法，这些方法不仅价格昂贵，实验过程耗时费力；而且只针对传统卷烟且只能识别一种霉变特征标志物，如hs-spme-gc-ms只针对1-辛烯-3-醇一种标志物，液相色谱串联质谱法只针对麦角甾醇，应用过程中存在一定误差。针对雪茄烟复杂多变的霉变因素以及雪茄烟叶内含物质更加丰富，干扰因素更多，使得采用现有的手段很大程度上增加了霉变标志物的偶然性与不确定性，严重影响检测结果的准确性。另外，现有技术也不能实现烟草样品霉变时期的预测。因此，利用现有技术难以有效尽早观测到雪茄烟叶的霉变及预测雪茄烟叶的霉变时期，进而难以有效的控制霉变。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明确有必要提供一种雪茄烟叶霉变早期监测方法及霉变标志物，能够有效、快速的监测与识别雪茄烟叶早期霉变，为中后期的霉变控制提供依据，从而有利于有效控制霉变的实现。
6.为此，本发明提供一种雪茄烟叶早期霉变监测方法，包括步骤：
7.自然霉变样品制备、从自然霉变雪茄烟叶中分离培养出致霉的至少一种优势菌种原种，将每一种优势菌种原种在培养基中进行培养，并采用顶空法制备对应的自然霉变样品；
8.自然霉变样品检测、对每一优势菌种自然霉变样品进行gc-ims检测，通过数据处理和谱图分析，确定自然霉变样品的潜在霉变标志物与霉变程度；
9.人工霉变样品制备、将每一种优势菌种原种接种至未霉变雪茄烟叶样品中进行培养，并采用顶空法制备对应的人工霉变样品；
10.人工霉变样品检测、对每一优势菌种人工霉变样品进行gc-ims检测，通过数据处理、视觉霉变观察和谱图分析，确定人工霉变样品的潜在霉变标志物与霉变程度；
11.霉变标志物确定、对比由自然霉变样品确定的潜在霉变标志物及霉变程度和由人工霉变样品确定的潜在霉变标志物及霉变程度，将两者重叠的霉变标志物确定为雪茄烟叶的早期霉变标志物；
12.在线监测霉变状态、先采用顶空法将被监测的雪茄烟叶制成待测样品，再采用gc-ims法检测所述待测样品中的早期霉变标志物的峰体积值，以判断待测样品是否发生霉变。
13.基于上述，所述自然霉变样品制备的步骤包括：
14.获取优势菌种原种、从处于自然霉变晚期的雪茄烟叶中分离出致霉的多种优势菌种母种，将每一种优势菌母种单独接种在所述培养基斜面上，形成多种优势菌种原种；
15.制备优势菌种样品、将所述每一种优势菌种原种分别接种至所述培养基中，在恒温恒湿条件下放大培养，以第0天为对照组，间隔固定时间取样，且每个样品单独置于顶空瓶中，获得每一优势菌种的多个自然霉变样品。
16.其中，所述优势菌种，也称为主导菌种，主要是通过先洗脱霉变烟叶，再平板培养，然后通过菌株的量以及属确定。所述优势菌种具有在正常的霉变环境中能一直存在，从早期、中期到晚期其量也逐渐增加的特点，其它的菌株难以具有这种特点，所以，上述步骤中选择处于晚期的霉变雪茄烟叶为对象分离优势菌种，确保了分离出的优势菌种的准确性。
17.基于上述，所述自然霉变样品检测的步骤包括：
18.检测自然霉变样品、采用gc-ims法同步检测每一种优势菌种的自然霉变样品，获得每一种优势菌种不同霉变时期的自然霉变样品的gc-ims峰体积数据、gc-ims三维信息谱图及galleryplot图；
19.自然霉变数据处理、对多个所述优势菌种的多个自然霉变样品的gc-ims峰体积数据进行定性与半定量分析，结合单因素方差分析法和邓肯极差法，以初次判断雪茄烟叶自然霉变样品可能的霉变标志物与霉变程度；
20.自然霉变谱图分析、对比分析每一种优势菌种的自然霉变样品的gc-ims三维信息谱图和galleryplot图，根据每一种优势菌种的不同自然霉变样品之间的差异性，以再次判断每一种优势菌种的自然霉变样品可能的霉变程度；
21.自然霉变pls-da分析、先根据所述自然霉变数据处理步骤和所述自然霉变谱图分析步骤的各次判断结果三次判断雪茄烟叶自然霉变样品可能的霉变时期；再利用pls-da分析法建立挥发性成分与自然霉变样品的霉变时期之间的关系pls-da模型以验证三次判断的所述自然霉变样品可能的霉变时期；若两者结果一致，则确定自然霉变样品的可能霉变程度，并利用所述pls-da模型筛选确定自然霉变样品的潜在霉变标志物。
22.基于上述，所述自然霉变数据处理的步骤包括：
23.结合单因素方差分析法和邓肯极差法对每一种优势菌种的自然霉变样品的gc-ims峰体积数据进行分析，初步预判每一种优势菌种的自然霉变样品的可能霉变标志物；将
多种优势菌种的自然霉变样品的可能霉变标志物中重叠的化合物初次判断为自然霉变样品可能的霉变标志物；
24.结合单因素方差分析法，根据每一种优势菌种的自然霉变样品的gc-ims峰体积数据的无显著性差异，初次判断每一种优势菌种自然霉变样品可能的霉变程度。
25.基于上述，所述人工霉变样品制备的步骤包括：先将每一种优势菌种原种制成对应的优势菌种孢子悬浮液，再将该每一优势菌种孢子悬浮液滴加到所述未霉变雪茄烟叶样品上直至所述孢子悬浮液覆盖所述未霉变雪茄烟叶样品的表面，然后采用与所述制备优势菌种样品步骤相同的条件和取样方法，获得每一优势菌种的多个人工霉变样品。
26.基于上述，所述人工霉变样品检测的步骤包括：
27.检测人工霉变样品、采用gc-ims法同步检测每一优势菌种的人工霉变样品，获得每一优势菌种的不同霉变时期的人工霉变样品的gc-ims峰体积数据、gc-ims三维信息谱图及galleryplot图；
28.人工霉变数据处理、采用与所述自然霉变数据处理步骤相同的方法，初次判断人工霉变样品可能的霉变标志物与霉变程度；
29.人工霉变视觉观察、采用人工观察并记录每一种优势菌种的人工霉变样品不同霉变时期的形态图，从外观上再次判断每一种优势菌种的人工霉变样品的霉变程度；
30.人工霉变谱图分析、采用与所述自然霉变谱图分析步骤相同的方法，三次每一种优势菌种的人工霉变样品的霉变程度；
31.人工霉变pls-da分析、先根据所述人工霉变数据处理步骤、人工霉变视觉观察步骤和自然霉变谱图分析步骤的各次判断结果四次判断人工霉变样品的不同霉变时期，然后采用与所述自然霉变pls-da分析步骤相同的方法，依次确定人工霉变样品的可能霉变程度和潜在霉变标志物。
32.基于上述，所述霉变标志物确定的步骤在确定雪茄烟叶的早期霉变标志物之后，对每一优势菌种的不同霉变时期的人工霉变样品的gc-ims峰体积数据中的每一早期霉变标志物的峰体积数据进行聚类分析，确定每一早期霉变标志物的峰体积检测下限值；
33.所述在线监测霉变状态的步骤包括：先检测所述待测样品中的早期霉变标志物，获得每一霉变标志物的峰体积检测值；将该每一霉变标志物的峰体积检测值与其对应的早期霉变标志物处于不同霉变时期的峰体积检测下限值进行比较，以确定所述待测样品是否发生霉变及霉变程度。
34.具体地，当所述待测样品中检测出的所有早期霉变标志物中的任一霉变标志物的峰体积检测值高于所述对应的峰体积早期霉变检测下限值时，判断所述待测样品已发生霉变，并结合检出数据与霉变不同时期数据进行聚类分析，即可得出所述被监测的雪茄烟叶的具体霉变程度；当所述待测样品中检测出的所有早期霉变标志物中的峰体积检测值均低于所述对应的峰体积早期霉变检测下限值时，判断所述待测样品未发生霉变。
35.基于上述，所述优势菌株分别为产黄青霉和聚多曲霉，在所述霉变标志物确定的步骤中确定：所述雪茄烟叶的霉变程度为1～3天为早期霉变、4～5天为中期霉变、6～7天为晚期霉变，所述聚多曲霉的初步预判霉变程度为1～3天为早期霉变、4～5天为中期霉变、6～7天为晚期霉变；并最终确定的霉变标志物为1-辛烯-3-醇、1-戊醇、戊醛，且由每一霉变标志物的峰体积的检出霉变下线为100。
36.基于上述，在所述在线监测霉变状态的步骤中，当检测出的1-辛烯-3-醇、1-戊醇和戊醛中任一霉变标志物的峰体积值高于100，即判断所述被监测的雪茄烟叶处于霉变状态，此时将检出的霉变标志物的峰体积值与霉变不同时期数据进行聚类分析，即可得出所述被监测的雪茄烟叶的具体霉变程度；当检测出的1-辛烯-3-醇、1-戊醇和戊醛的峰体积值均低于100，即判断所述被监测的雪茄烟叶处于未霉变状态。
37.本发明还提供一种雪茄烟叶霉变标志物，包括1-辛烯-3-醇、1-戊醇和戊醛。
38.本发明提供的上述雪茄烟叶霉变早期监测方法，从自然霉变雪茄烟叶中分离的优势菌种为实际发生霉变的菌种，更加真实、准确，能够有效减少或避免后续霉变标志物的确定的偶然性和不确定性，减少干扰因素；将从自然霉变雪茄烟叶中分离的优势菌种接种到未霉变的雪茄烟叶上制作人工霉变样品，能够减少因环境因素引起的霉变的干扰，增加霉变标志物的确定性。本发明以自然霉变样品作为参照，通过自然霉变样品和人工霉变样品检测数据中重叠的挥发性化合物作为霉变标志物，可以避免或减少雪茄烟叶自身挥发性内含物对检测结果的影响，进一步提高了霉变标志物确定的必然性和确定性。本发明利用早期霉变标志物的峰体积值从霉变早期、中期到晚期其值呈逐渐增加的特点，结合霉变时期筛选早期霉变标志物，也进一步提高了确定的早期霉变标志物的准确性和确定性。本发明主要利用gc-ims检测技术检测霉变样品中的挥发性气体的峰体积值，检测方法简单、检测速度快、检测结果准确度高，而且够实现定量检测。
39.因此，本发明提供的上述雪茄烟叶霉变早期监测方法，增强霉变标志物的确定性和准确性，提高检测结果的有效性，有利于实现雪茄烟叶霉变早期的监测与识别，该监测方法成本低、方便快捷、减少人工霉变识别的误差，弥补感官分析的缺陷；能够及时客观地判断仓储雪茄烟叶是否发生霉变，保证雪茄烟叶品质，降低雪茄烟的生产成本；同时也为雪茄烟叶的中后期的霉变控制提供依据。
附图说明
40.图1为本发明实施例提供的产黄青霉gc-ims三维信息谱图。
41.图2为本发明实施例提供的产黄青霉galleryplot图。
42.图3为本发明实施例提供的聚多曲霉gc-ims三维信息谱图。
43.图4为本发明实施例提供的聚多曲霉galleryplot图。
44.图5为本发明实施例提供的产黄青霉染培养基pls-da图(图a)、200次置换检验图(图b)、vip图(图c)。
45.图6为本发明实施例提供的聚多曲霉染培养基pls-da图(图a)、200次置换检验图(图b)、vip图(图c)。
46.图7为本发明实施例提供的产黄青霉染烟叶、聚多曲霉染烟叶人工霉变样品图。
47.图8为本发明实施例提供的产黄青霉染烟叶gc-ims三维信息谱图。
48.图9为本发明实施例提供的产黄青霉染烟叶galleryplot图。
49.图10为本发明实施例提供的聚多曲霉染烟叶gc-ims三维信息谱图。
50.图11为本发明实施例提供的聚多曲霉染烟叶galleryplot图。
51.图12为本发明实施例提供的产黄青霉染烟叶pls-da图(图a)、200次置换检验图(图b)、vip图(图c)。
52.图13为本发明实施例提供的聚多曲霉染烟叶pls-da图(图a)、200次置换检验图(图b)、vip图(图c)。
具体实施方式
53.下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。其中，本文中未详细描述的内容均为现有技术，例如，优势菌种的分离及保存方法等。
54.本发明实施例提供一种雪茄烟叶霉变早期监测方法，主要包括自然霉变样品制备、自然霉变样品检测、人工霉变样品制备、人工霉变样品检测、霉变标志物确定以及在线监测霉变状态等步骤。
55.s1、自然霉变样品制备：从自然霉变雪茄烟叶中分离培养出致霉的至少一种优势菌种原种，将每一种优势菌种原种在培养基中进行培养，并采用顶空法制备自然霉变样品。
56.s11、获取优势菌种原种：对德雪一号霉变雪茄烟叶进行洗脱及平板培养处理，之后通过平板上的菌株的量以及属确定出两种优势霉菌：产黄青霉和聚多曲霉；将产黄青霉和聚多曲霉分别从平板上分离出来，作为产黄青霉母种和聚多曲霉母种；将该两种霉菌的母种分别接种在马铃薯葡萄糖培养基斜面上(pda)，分别形成产黄青霉原种和聚多曲霉原种，并分别在4℃下保存，以便后续使用。
57.s12、制备优势菌种样品：将步骤s11保存的两种优势霉菌原种分别接种至pda培养基上，放入恒温恒湿培养箱(温度25℃，湿度70％)中进行培养。样品培养7天，以第0天为对照组，每隔24小时取一次样(每个样重复3次)，每个样品称0.3～1.5g于20ml顶空瓶中，标记后密封备用。
58.s2、自然霉变样品检测：对每一种自然霉变样品进行gc-ims检测，通过数据处理和谱图分析，初步确定自然霉变样品的潜在霉变标志物与霉变程度。具体包括以下步骤：
59.s21、检测自然霉变样品：采用gc-ims法同步检测步骤s12称量标记后密封备用的产黄青霉侵染pda制备的产黄青霉侵染自然霉变样品和聚多曲霉侵染pda制备的聚多曲霉侵染自然霉变样品，并分别获得产黄青霉侵染自然霉变样品和聚多曲霉侵染自然霉变样品在不同霉变时期的如表1和表2所示的gc-ims峰体积数据、如图1和图3所示的gc-ims三维信息谱图、如图2和图4所示的galleryplot图；其中，表1和表2各表中同行数字后带有不同字母者表示差异达到显著水平(p＜0.05)。以上数据为对应挥发性成分的峰体积。
60.s22、自然霉变数据处理
61.(1)产黄青霉侵染自然霉变样品的数据处理
62.对表1所示的产黄青霉侵染自然霉变样品在不同时期的峰体积gc-ims数据进行定性与半定量分析，采用spss 23.0进行单因素方差分析(analysis of variance，anova)，并用邓肯极差法(duncan’s)进行组间显著性差异分析，显著性水平为p＜0.05。
63.从表1可以看出：1-辛烯-3-醇、1-戊醇单体、己醇单体、1-己醇二聚体、丙醛单体、戊醛、异丁醛、乙酸异丁酯、2-丁酮单体、2-丁酮二聚体、β-月桂烯、4、8与对照组无显著性差异(p＜0.05)，与产黄青霉-4、产黄青霉-5、产黄青霉-6、产黄青霉-7有显著性差异，初步预判为产黄青霉早期特征标志物。
64.根据单因素方差分析，初步判定：产黄青霉-1、产黄青霉-2、产黄青霉-3处于霉变早期；产黄青霉-4、产黄青霉-5处于霉变中期，产黄青霉-6、产黄青霉-7处于霉变晚期。
65.(2)聚多曲霉侵染自然霉变样品的数据处理
66.采用与产黄青霉侵染自然霉变样品相同的分析方法对表2所示的聚多曲霉侵染自然霉变样品在不同时期的峰体积gc-ims数据进行定性与半定量分析。从表2可以看出：1-戊醇单体、1-戊醇二聚体、1-辛烯-3-醇单体、1-辛烯-3-醇二聚体、己醇、戊醛、庚醛、乙酸异丁酯、2-庚酮、4-异丙基甲苯单体、4-异丙基甲苯二聚体、3、4、10、13、15、16与对照组无显著性差异(p＜0.05)，与聚多曲霉-4、聚多曲霉-5、聚多曲霉-6、聚多曲霉-7有显著性差异，初步预判为聚多曲霉早期特征标志物。
67.根据单因素方差分析，初步判定：聚多曲霉-1、聚多曲霉-2、聚多曲霉-3处于霉变早期；聚多曲霉-4、聚多曲霉-5处于霉变中期；聚多曲霉-6、聚多曲霉-7处于霉变晚期。
68.因此，将上述初步预判的产黄青霉早期特征标志物和聚多曲霉早期特征标志物中重叠的挥发性化合物作为雪茄烟叶的初步预判的霉变标志物，所以，该步骤初次确定的潜在早期霉变标志物为：1-辛烯-3-醇、1-戊醇、己醇、戊醛、乙酸异丁酯、4，所述雪茄烟叶的初次确定可能的霉变程度为：1～3天为早期霉变、4～5天为中期霉变、6～7天为晚期霉变。
69.s23、自然霉变谱图分析
70.研究分析图1～2所示的产黄青霉侵染的自然霉变样品的gc-ims三维信息谱图和galleryplot图再次判断：产黄青霉-1、产黄青霉-2、产黄青霉-3处于霉变早期；产黄青霉-4、产黄青霉-5处于霉变中期；产黄青霉-6、产黄青霉-7处于霉变晚期。
71.研究分析图3～4所示的聚多曲霉侵染的自然霉变样品的gc-ims三维信息谱图和galleryplot图再次判断：聚多曲霉-1、聚多曲霉-2、聚多曲霉-3处于霉变早期；聚多曲霉-4、聚多曲霉-5处于霉变中期；聚多曲霉-6、聚多曲霉-7处于霉变晚期。
72.如此，该步骤的分析结果与步骤s22的一致。
73.s24、自然霉变样品pls-da分析
74.采用pls-da模型验证步骤s22和s23初步判定的霉变时期，结果如图5(a)、图6(a)所示，图5(a)和图6(a)的显示结果验证了步骤s22和s23的预测。
75.为了保证数据不被过度拟合，在simca-p中进行200次的置换检验(permutation test)。检验结果如图5(b)、图6(b)所示，结果表明不存在过拟合现象。
76.以霉变初期、霉变中期、霉变后期数据建立pls-da模型，以vip＞1，来筛选霉菌培养基霉变早期有显著差异的挥发性成分，结果分别如图5(c)和图6(c)所示。从图5(c)中可以看出：产黄青霉霉变早期的特征标志物有：1-辛烯-3-醇、1-戊醇单体、丙醛单体、戊醛、异丁醛、乙酸异丁酯、2-丁酮单体、2-丁酮二聚体、β-月桂烯、4、8。从图6(c)中可以看出：聚多曲霉霉变早期的特征标志物有：1-戊醇单体、1-戊醇二聚体、1-辛烯-3-醇单体、1-辛烯-3-醇二聚体、戊醛、庚醛、乙酸异丁酯、2-庚酮、4-异丙基甲苯二聚体、3、15、16。如此，步骤s2可以确认自然霉变样品的早期霉变标志物为：1-辛烯-3-醇、1-戊醇、戊醛、乙酸异丁酯。
77.因此，综合步骤s22至s24，确定雪茄烟叶自然霉变样品的潜在早期霉变标志物为：1-辛烯-3-醇、1-戊醇、戊醛、乙酸异丁酯；霉变程度为：1～3天为早期霉变、4～5天为中期霉变、6～7天为晚期霉变。
78.s3、人工霉变样品制备：将每一种优势菌种原种接种至未霉变雪茄烟叶样品中进行培养，并采用顶空法制备人工霉变样品；
79.s31、产黄青霉侵染人工霉变样品制备：在超净工作台中称取未霉变雪茄烟叶样品
0.6～1.0g，并将其置于一次性培养皿中展平；将步骤s11培养的产黄青霉原种在超净工作台中采用磷酸缓冲液洗脱，制成浓度约为107～108cfu ml
–1的产黄青霉孢子悬浮液。吸取0.5ml的产黄青霉孢子悬浮液滴加于展平的烟叶上，尽量覆盖全面；并采用与步骤s12相同的培养条件于恒温恒湿培养箱中进行培养，培养7天，以第0天为对照组，每隔24小时取一次样(每个样重复3次)，每个样品称0.6g于20ml顶空瓶中制备产黄青霉侵染人工霉变样品，标记后密封备用。
80.s32、聚多曲霉侵染人工霉变样品制备：采用与步骤s31相同的方法制备聚多曲霉侵染人工霉变样品，标记后密封备用。
81.s4、人工霉变样品检测：对每一人工霉变样品进行gc-ims检测，通过数据处理、视觉霉变观察和谱图分析，确定人工霉变样品的潜在霉变标志物与霉变程度；
82.s41、检测人工霉变样品：采用gc-ims法同步检测步骤s31称量标记后密封备用的产黄青霉侵染人工霉变样品和聚多曲霉侵染人工霉变样品，并分别获得产黄青霉侵染人工霉变样品和聚多曲霉侵染人工霉变样品在不同霉变时期的如表3和表4所示的gc-ims峰体积数据、如图8和图10所示的gc-ims三维信息谱图、如图9和图11所示的galleryplot图；其中，表3和表4各表中同行数字后带有不同字母者表示差异达到显著水平(p＜0.05)。以上数据为对应挥发性成分的峰体积。
83.s42、人工霉变样品数据处理
84.采用与步骤s22相同的分析方法，分别对表3所示的产黄青霉侵染人工霉变样品的gc-ims数据和表4所示的聚多曲霉侵染人工霉变样品的gc-ims数据进行定性与半定量分析。
85.从表3可以看出：1-辛烯-3-醇、1-戊醇、己醇、戊醛、乙酸异丁酯、1-丁酮与对照组无显著性差异(p＜0.05)，与产黄青霉染烟叶-4、产黄青霉染烟叶-5、产黄青霉染烟叶-6、产黄青霉染烟叶-7有显著性差异，初步判定为产黄青霉染烟叶早期特征标志物。根据单因素方差分析，初步判定：产黄青霉染烟叶-1、产黄青霉染烟叶-2、产黄青霉染烟叶-3处于霉变早期；产黄青霉染烟叶-4、产黄青霉染烟叶-5处于霉变中期；产黄青霉染烟叶-6、产黄青霉染烟叶-7处于霉变晚期。
86.从表4可以看出：1-戊醇单体、1-辛烯-3-醇单体、己醇、戊醛、2-庚酮与对照组无显著性差异(p＜0.05)，与聚多曲霉染烟叶-4、聚多曲霉染烟叶-5、聚多曲霉染烟叶-6、聚多曲霉染烟叶-7有显著性差异，初步判定为聚多曲霉染烟叶早期特征标志物。根据单因素方差分析，初步判定：聚多曲霉染烟叶-1、聚多曲霉染烟叶-2、聚多曲霉染烟叶-3处于霉变早期；聚多曲霉染烟叶-4、聚多曲霉染烟叶-5处于霉变中期；聚多曲霉染烟叶-6、聚多曲霉染烟叶-7处于霉变晚期。
87.因此，将该步骤初步预判的产黄青霉早期特征标志物和聚多曲霉早期特征标志物中重叠的挥发性化合物作为雪茄烟叶的初次确定的霉变标志物，所以，该步骤初次确定的人工霉变可能的早期霉变标志物为：1-辛烯-3-醇、1-戊醇、己醇、戊醛，所述雪茄烟叶的初次预判霉变程度为：1～3天为早期霉变、4～5天为中期霉变、6～7天为晚期霉变。
88.s43、人工霉变视觉观察：采用人工分别观察并记录产黄青霉侵染人工霉变样品和聚多曲霉人工霉变样品在不同霉变时期的外观形态图，从外观上再次判定人工霉变样品的霉变程度，结果如图7所示；相比对照样本(第0天的样本)，1～3天样本视觉霉变无明显差
异，4～5天肉眼可见白色菌斑，6～7样本已完全霉变。
89.s44、人工霉变样品谱图分析
90.采用与步骤s23相同的分析方法，分别对图8～11所示的产黄青霉侵染人工霉变样品和聚多曲霉侵染人工霉变样品的的gc-ims三维信息谱图及galleryplot图进行分析。
91.从图8和图9中可以判定：产黄青霉染烟叶-1、产黄青霉染烟叶-2、产黄青霉染烟叶-3处于霉变早期；产黄青霉染烟叶-4、产黄青霉染烟叶-5、产黄青霉染烟叶-6、产黄青霉染烟叶-7为霉变中期到晚期。
92.从图10和图11中可以判定：聚多曲霉染烟叶-1、聚多曲霉染烟叶-2、聚多曲霉染烟叶-3处于霉变早期；聚多曲霉染烟叶-4、聚多曲霉染烟叶-5、聚多曲霉染烟叶-6、聚多曲霉染烟叶-7处于霉变中期到霉变晚期。
93.s45、人工霉变样品pls-da分析
94.采用pls-da模型验证步骤s42、s43、s44初步判定的人工霉变样品的霉变时期，结果如图12(a)、图13(a)所示，图12(a)和图13(a)的显示结果验证了步骤s42、s43、s44的预测。
95.为了保证数据不被过度拟合，在simca-p中进行200次的置换检验(permutation test)。检验结果如图12(b)、图13(b)所示，结果表明不存在过拟合现象。
96.以霉变初期、霉变中期、霉变后期数据建立pls-da模型，以vip＞1，来筛选霉菌培养基霉变早期有显著差异的挥发性成分，结果如图12(c)、图13(c)所示。图12(c)表明：产黄青霉染烟叶霉变早期的特征标志物有：1-辛烯-3-醇、1-戊醇、戊醛。图13(c)表明：聚多曲霉染烟叶霉变早期的特征标志物有：1-戊醇单体、1-辛烯-3-醇单体、己醇、戊醛、2-庚酮。如此，再次判断人工霉变样品的潜在早期霉变标志物为：1-辛烯-3-醇、1-戊醇、戊醛。
97.因此，结合上述步骤s42至s45，该步骤s7确定雪茄烟叶人工霉变样品的潜在早期霉变标志物为：1-辛烯-3-醇、1-戊醇、戊醛；雪茄烟叶的人工霉变样品的霉变程度为：1～3天为早期霉变、4～7天为中期至晚期霉变。
98.s5、霉变标志物确定：对比步骤s2和步骤s4确定的潜在早期霉变标志物，将两者重叠的标志物确定为雪茄烟叶的早期霉变标志物；最终雪茄烟叶霉变早期的特征标志物有1-辛烯-3-醇、1-戊醇、戊醛。对最终确定的早期霉变标志物在表3和表4所示的人工霉变样品的霉变不同时期的峰体积数据进行聚类分析，确定霉变时期判断的检测峰体积下限值。本实施例中，确定早期霉变标志物的峰体积值的检测下限均为100。
99.s6、在线监测霉变状态：针对仓储雪茄烟叶中疑似霉变的样本外观无异常的情况，对雪茄烟叶库存样本进行gc-ims检测。
100.具体地，先采用顶空法将被监测的雪茄烟叶制成待测样品，再采用gc-ims法检测所述待测样品中的挥发性成分中是否有任一早期霉变标志物：1-辛烯-3-醇、1-戊醇或戊醛，并检测出对应的早期霉变标志物的半定量数据。
101.若未检出1-辛烯-3-醇、1-戊醇、戊醛，或者检测出的三者的峰体积均低于100则说明待测雪茄烟叶未发生霉变。若检测出任一早期霉变标志物的峰体积高于100，则表明待测雪茄烟叶已经发生霉变，并此时将检出的峰体积数据与步骤s5确定的霉变时期判断的检测峰体积下限值进行比较，即可确定该待测雪茄烟叶样品的具体霉变时期。具体确定方法与确定是否发生霉变的方法相同。
102.本实施例中，对位于四川中烟工业有限责任公司长城雪茄烟厂仓储的雪茄烟叶进行霉变检测。由于2020年10月发现其仓库储存雪茄烟叶的条件已经发现变化，该仓库中的雪茄烟叶中疑似霉变，但外观无异常；故采用gc-ims检测上述仓库中的雪茄烟叶样本，经检测：挥发性气体中包含1-戊醇50.75、戊醛182.33，戊醇的峰体积虽小于100，但戊醛的峰体积大于100，由此可以判断上述仓库中雪茄烟叶已经发生早期霉变，应采取防控措施。
103.在另一实施例中，对四川中烟工业有限责任公司长城雪茄烟厂仓储的雪茄烟叶进行霉变检测。由于2022年8月持续出现高温高湿天气，仓库中的雪茄烟叶的外观虽无异常，但有疑似霉变的征兆；故采用gc-ims检测上述仓库中的雪茄烟叶样本，经检测：挥发性气体中未检出1-辛烯-3-醇、1-戊醇、戊醛，由此可以判断上述仓库中雪茄烟叶未发生霉变。
104.最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
105.106.107.108.