一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白G定量检测试纸及检测方法与流程

一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸及检测方法
技术领域
1.本发明涉及牛免疫球蛋白g定量检测技术领域，具体为一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸及检测方法。


背景技术：

2.免疫球蛋白（immunoglobulin，ig）是一类具有抗体活性的、化学结构与抗体相似的球蛋白，其能够与抗原结合中和毒性，与补体结合抵抗入侵的细菌、病毒等病原，增强机体的防御能力。牛的免疫球蛋白广泛存在于血清和乳汁中，尤其在初乳（指牛生产后72小时内乳腺的初始分泌物，属于生理异常乳）中含量最高，主要类型为igg、iga和igm，其中igg 占80%。检测牛血清或牛乳中牛igg含量，有助于牛场评价犊牛被动免疫效果，指导初乳饲喂，从而有效提高犊牛成活率、降低发病率；也可为生产奶粉、乳制品的乳品厂提供有力的产品质量监管手段；另外在生物制药（疫苗、保健品）、生物化妆品（美容面膜）、日用化学品（新型功能牙膏）等领域，检测牛igg含量对产品质量安全性评价也是至关重要的。由此可见，建立一种快速、准确、便捷的牛igg含量的检测方法必定会在畜牧兽医、乳制品、生物制药、化妆品、化学品和标准品生产等行业得到推广和应。
3.目前，牛igg含量的检测方法主要有紫外分光光度法、免疫分析法和亲和色谱法，其中免疫分析法以琼脂扩散法、免疫比浊法和酶联免疫法为主，这些方法各有利弊。紫外分光光度法虽然操作简单、成本较低，但其仅适用于标准物质、igg纯品以及动物血清样品中牛igg含量的分析；而免疫分析法和亲和色谱法虽然分析准确、重复性好，但都需要复杂仪器设备支撑，实施成本较高，操作繁琐，耗时较长，无法应用到基层。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供了一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸及检测方法，达到实现了集快速、简单、准确和成本低廉为一体的牛血清、牛乳或牛乳制品等样本中牛igg的定量检测，具有良好的应用前景的目的。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸，包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条分别为qd-lf-夹心法试纸条和 qd-lf-竞争法试纸条；所述免疫层析试纸条包括有粘性底衬、分析膜、结合垫、样品垫、吸水纸，所述分析膜贴于粘性底衬的中间，吸水垫贴于分析膜的一侧且与分析膜形成第一结合区，结合垫贴于分析膜的另一侧且与分析膜形成第二结合区，样品垫贴于结合垫的另一侧之上且与结合垫形成第三结合区，所述分析膜表面设置有检测线、质控线。
6.优选的，所述qd-lf-夹心法试纸条和qd-lf-竞争法试纸条的分析膜表面上的质控线均为2mg/ml 羊抗兔多克隆抗体，所述qd-lf-夹心法试纸条的分析膜表面上的检测线为3mg/ml兔抗牛igg多克隆抗体，所述qd-lf-竞争法试纸条的分析膜表面上的检测线为2mg/
ml牛igg。
7.优选的，所述qd-lf-夹心法试纸条的结合垫以qd标记的兔抗牛igg多克隆抗体为示踪物，所述qd-lf-竞争法试纸条的结合垫以qd标记的牛igg为示踪物。
8.一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测方法，所述方法包括以下步骤：步骤一、牛igg 的提取；步骤二、牛igg免疫及兔抗牛igg多克隆抗体效价测定；步骤三、用0.01 mol/l 的 pb（磷酸盐缓冲液）分别将羊抗兔抗体、兔抗牛igg多克隆抗体和牛igg稀释至喷膜使用浓度后进行层析膜喷膜，置于37℃烘干；步骤四、取 0.2 g/ml的量子点20μl加入到1.5ml 离心管中，加入标记缓冲液 500μl，置于恒温振荡器上，加入活化试剂 15μl，1400r/min 振荡1h，加入兔抗牛igg多克隆抗体或牛igg 0.05mg，置于25℃、1400r/min振荡2 h，再加入终浓度为1%的牛血清白蛋白，1400r/min震荡1h，加入0.01 mol/l pb（ph 值为 7.0）3.88 ml，混匀，使用毛细管快速浇至玻璃纤维上，置于 37 ℃烘干3h，干燥保存，备用；步骤五、取层析封闭液（含1%牛血清白蛋白的0.01 mol/l pb，ph 值为 7.0）2 ml，浇至裁切好的玻璃纤维上，置于37℃烘干2h，干燥保存，备用；步骤六、2种试纸条敏感性、线性、精密性评价以及现场评价；步骤七：数据的统计分析。
9.优选的，步骤一具体如下：取牛血清60ml加入到烧杯中，边搅拌边滴加醋酸钠溶液，调节ph值至4.5；再滴加正辛酸溶液5ml，于常温下搅拌均匀，置于4℃放置1h，转移至50 ml离心管中，12000r/min离心30min，取上清液用滤纸过滤后，在上清液中加入1/10体积的0.1mol/l的pbs（磷酸盐缓冲液），调节ph值至7.0，边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液至总体积的50%，4℃放置2 h，12000r/min离心30min，弃掉上清液；用0.01 mol/l的pbs重悬离心后的沉淀物，于4℃进行透析，每间隔2h更换透析液1次，直至完全去除氨离子；用微量紫外分光光度计检测牛igg的浓度，冻存，备用。
10.优选的，所述步骤二具体如下：用制备好的牛igg抗原分别免疫2只大耳白兔，免疫方式为单次皮下注射200mg，免疫周期为2周1次，进行4次免疫，在第4次免疫2周后，分别取2只大耳白兔的耳缘静脉血进行酶联免疫吸附试验以检测2份血清中兔抗牛igg多克隆抗体效价，当血清稀释倍数大于等10万且450nm的吸光度（odg）大于0.200时停止免疫，进行颈动脉采血，此血清稀释倍数即为兔抗牛igg多克隆抗体效价，将采集的2份兔血液经4℃、5000r/min离心15min后收集上层血清（血清编号 1#和2#）；参照牛igg提取方法进行血清中兔抗牛igg多克隆抗体的提取，测定兔抗牛igg多克隆抗体浓度及效价，冻存，备用。
11.优选的，所述步骤六具体如下：敏感性评价：用0.03 mol/l pb 将牛igg进行梯度稀释，获得0，0.1，0.3，0.5，0.7，1，3，5，7，10，30，50，70，100μg/ml系列浓度标准品，分别用 2 种试纸条进行检测，以 0.03 mol/l pb 作为空白对照，重复测试 3 次。夹心法试纸条以空白对照检测带信号（t）/质控
带信号（c）值的平均值+3 倍的标准 差为 cutoff 值，当样本的t/c 值≥cutoff 值时，该样本的 t/c 值所对应的牛 igg 的含量即为夹心法试纸条的检出限；竞争法试纸条以空白对照的 t/c 值的平均值-3倍的标准差为 cutoff 值，当样本的 t/c 值≤cutoff值时，该样本的 t/c 值所对应的牛 igg 的浓度即为竞争法试纸条的检出限；线性评价：夹心法试纸条以lg（t/c 值-cutoff 值）为横坐标，竞争法试纸条以 lg（t/c 值）为横坐标，两类试纸条均以lg（标准品浓度）为纵坐标绘制定量标准曲线；精密性评价：待测标准品的每个浓度重复测试3次，计算3次检测值的变异系数（cv），变异系数越小说明精密性越好；现场评价：选取检测性能更优的试纸条进行现场检测，样本为 50 份牛初乳（样本编号1~50）和2份巴氏乳（样本编号51和52），同时用折光仪进行测定，随机抽取 5 份牛初乳与 2 份巴氏乳进行液相色谱测定，对比3种方法检测的牛igg含量的相关性，以评价试纸条检测方法的准确性。
12.优选的，所述步骤七具体如下：采样excel软件进行验数据的统计学分析，分别绘制2种试纸检测牛igg标准品的定量标准曲线，绘制折光仪和最优试纸条检测52份乳样中牛igg含量的对比柱状图，绘制折光仪、最优试纸条和液相色谱检测7份乳样中牛igg 含量的对比柱状图，并用excel软件分析3种方法检测结果的相关性。
13.本发明提供了一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸及检测方法。具备以下有益效果：（1）、本发明通过设置量子点免疫层析试纸，包括粘性底衬、分析膜、结合垫、样品垫、吸水纸，所述分析膜贴于粘性底衬的中间，吸水垫贴于分析膜的一侧且与分析膜形成第一结合区，结合垫贴于分析膜的另一侧且与分析膜形成第二结合区，样品垫贴于结合垫的另一侧之上且与结合垫形成第三结合区，所述分析膜表面设置有检测线、质控线。经过实验后，发现其qd-lf-竞争法试纸条能够对复杂牛乳及初乳样本中牛 igg 的含量进行精准定量，这是紫外分光分光法所不能实现的；试纸条操作非常简单，仅需样本稀释、上样、上机读值三步，15min即可完成检测，输出结果，且不需要昂贵的设备和专业的操作场所。
14.（2）、本发明通过所获得的量子点免疫层析试纸条 (竞争法) 真正实现了集快速、简单、准确和成本低廉为一体的牛血清、牛乳或牛乳制品等样本中牛igg的定量检测，具有良好的应用前景。
附图说明
15.图1为本发明免疫层析试纸条结构立体视图；图2为本发明免疫层析试纸条结构视图；图3为本发明兔抗牛igg多克隆抗体效价检测结果图；图4为本发明2种试纸条检测不同浓度牛igg标准品的t/c值的平均值及 cv的结果图；图5为本发明2种试纸条检测不同浓度牛igg标准品的直线回归方程图；图6为本发明1~52号乳样的折光仪和qd-lf 竞争法试纸条现场检测结果图；图7为本发明qd-lf竞争法试纸条、折光仪和液相色谱检测7份牛乳样中牛igg含量的相关性结果图。
16.图中：1粘性底衬、2分析膜、3结合垫、4样品垫、5吸水纸、6检测线、7质控线。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
19.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
20.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
21.如图1-7所示，本发明提供一种技术方案：一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸，免疫层析试纸分别分别为qd-lf-夹心法试纸条和 qd-lf-竞争法试纸条；量子点免疫层析试纸包括粘性底衬、分析膜、结合垫、样品垫、吸水纸，所述分析膜贴于粘性底衬的中间，吸水垫贴于分析膜的一侧且与分析膜形成第一结合区，结合垫贴于分析膜的另一侧且与分析膜形成第二结合区，样品垫贴于结合垫的另一侧之上且与结合垫形成第三结合区，所述分析膜表面设置有检测线、质控线。
22.qd-lf-夹心法试纸条和qd-lf-竞争法试纸条的分析膜2表面上的质控线7均为2 mg/ml 羊抗兔多克隆抗体，qd-lf-夹心法试纸条的分析膜2表面上的检测线为 3 mg/ml兔抗牛igg多克隆抗体，qd-lf-竞争法试纸条的分析膜2表面上的检测线6为2 mg/ml牛igg。
23.qd-lf-夹心法试纸条的结合垫3以qd标记的兔抗牛igg多克隆抗体为示踪物，qd-lf-竞争法试纸条的结合垫3以qd标记的牛igg为示踪物。
24.一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测方法，方法包括以下步骤：步骤一、牛igg的提取：取牛血清60ml加入到烧杯中，边搅拌边滴加醋酸钠溶液，调节ph值至4.5；再滴加正辛酸溶液5ml，于常温下搅拌均匀，置于4℃放置1h，转移至50 ml离心管中，12000r/min离心30min，取上清液用滤纸过滤后，在上清液中加入1/10体积的0.1mol/l的pbs（磷酸盐缓冲液），调节ph值至7.0，边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液至总体积的50%，4℃放置2 h，12000r/min离心30min，弃掉上清液；
用0.01 mol/l的pbs重悬离心后的沉淀物，于4℃进行透析，每间隔2h更换透析液1次，直至完全去除氨离子；用微量紫外分光光度计检测牛igg的浓度，冻存，备用；步骤二、牛igg免疫及兔抗牛igg多克隆抗体效价测定：用制备好的牛igg抗原分别免疫2只大耳白兔，免疫方式为单次皮下注射200mg，免疫周期为2周1次，进行4次免疫，在第4次免疫2周后，分别取2只大耳白兔的耳缘静脉血进行酶联免疫吸附试验以检测2份血清中兔抗牛igg多克隆抗体效价，当血清稀释倍数大于等10万且450nm的吸光度（odg）大于0.200时停止免疫，进行颈动脉采血，此血清稀释倍数即为兔抗牛igg多克隆抗体效价，将采集的2份兔血液经4℃、5000r/min离心15min后收集上层血清（血清编号 1#和2#）；参照牛igg提取方法进行血清中兔抗牛igg多克隆抗体的提取，测定兔抗牛igg多克隆抗体浓度及效价，冻存，备用；兔抗牛igg多克隆抗体浓度分别为 34 mg/ml 和 70 mg/ml，用酶联免疫吸附试验检测2份兔抗牛igg多克隆抗体效价均为1 :102 400，结果见图3。
25.步骤三、用0.01 mol/l 的 pb（磷酸盐缓冲液）分别将羊抗兔抗体、兔抗牛igg多克隆抗体和牛igg稀释至喷膜使用浓度后进行层析膜喷膜，置于37℃烘干；步骤四、取 0.2 g/ml的量子点 20μl加入到1.5ml 离心管中，加入标记缓冲液 500μl，置于恒温振荡器上，加入活化试剂 15μl，1400r/min 振荡1h，加入兔抗牛igg多克隆抗体或牛igg 0.05mg，置于25℃、1400 r/min 振荡2 h，再加入终浓度为 1%的牛血清白蛋白，1400 r/min 震荡1 h，加入 0.01 mol/l pb（ph 值为 7.0） 3.88 ml，混匀，使用毛细管快速浇至玻璃纤维上，置于 37 ℃烘干3h，干燥保存，备用；步骤五、取层析封闭液（含1%牛血清白蛋白的0.01 mol/l pb，ph 值为 7.0）2 ml，浇至裁切好的玻璃纤维上，置于37℃烘干2h，干燥保存，备用；步骤六、2种试纸条敏感性、线性、精密性评价以及现场评价敏感性评价：用0.03 mol/l pb 将牛igg进行梯度稀释，获得0，0.1，0.3，0.5，0.7，1，3，5，7，10，30，50，70，100μg/ml系列浓度标准品，分别用 4 种试纸条进行检测，以 0.03 mol/l pb 作为空白对照，重复测试 3 次。夹心法试纸条以空白对照检测带信号（t）/质控带信号（c）值的平均值+3 倍的标准 差为 cutoff 值，当样本的t/c 值≥cutoff 值时，该样本的 t/c 值所对应的牛 igg 的含量即为夹心法试纸条的检出限；竞争法试纸条以空白对照的 t/c 值的平均值-3倍的标准差为 cutoff 值，当样本的 t/c 值≤cutoff值时，该样本的 t/c 值所对应的牛 igg 的浓度即为竞争法试纸条的检出限；线性评价：夹心法试纸条以lg（t/c 值-cutoff 值）为横坐标，竞争法试纸条以 lg（t/c 值）为横坐标，两类试纸条均以lg（标准品浓度）为纵坐标绘制定量标准曲线；精密性评价：待测标准品的每个浓度重复测试3次，计算3次检测值的变异系数（cv），变异系数越小说明精密性越好；qd-lf-夹心法和 qd-lf-竞争法试纸条敏感性、线性、精密性结果：2种试纸条的 cutoff值分别为0.635，2.864，检出限分别为0.1μg/ml、0.5 μg/ml。各浓度的标准品t/c值的cv，见图4。夹心法试纸条检测标准品的t/c值-cutoff值与标准品浓度呈正相关，竞争法试纸条检测标准品的t/c值与标准品浓度呈负相关，见图5。其中qd-lf-竞争法试纸条精密性更好，灵敏度较高，线性范围更宽，为性能更优的试纸条。
26.现场评价：选取检测性能更优的竞争法试纸条进行现场检测，样本为 50 份牛初乳（样本编号1~50）和2份巴氏乳（样本编号51和52），同时用折光仪进行测定，随机抽取 5 份牛初乳与2份巴氏乳进行液相色谱测定，对比3种方法检测的牛igg含量的相关性，以评价试纸条检测方法的准确性；现场用折光仪和 qd-lf-竞争法试纸条检测了50份牛初乳和2份巴氏乳，50份牛初乳的检测结果显示，折光仪检测结果集中在20~80mg/ml 之间，qd-lf-竞争法的检测结果在50~230mg/ml 之间，结果见图6，抽取5份牛初乳和2份巴氏乳样本进行了液相色谱测定，将7份样本的3种方法的检测数据进行分析，发现 qd-lf-竞争法试纸条和液相色谱检测值的相关性高达0.9759，而折光仪与液相色谱检测结果相关性仅为0.8274，见图7。
27.步骤七：数据的统计分析采样excel软件进行验数据的统计学分析，分别绘制2种试纸检测牛igg标准品的定量标准曲线，绘制折光仪和最优试纸条检测52份乳样中牛igg含量的对比柱状图，绘制折光仪、最优试纸条和液相色谱检测7份乳样中牛igg 含量的对比柱状图，并用excel软件分析3种方法检测结果的相关性。
28.综上可得，本试验所获得的量子点免疫层析试纸条 (竞争法) 真正实现了集快速、简单、准确和成本低廉为一体的牛血清、牛乳或牛乳制品等样本中牛igg的定量检测，具有良好的应用前景。
29.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
30.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。