抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、抗黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation associated gene 5，mda5)抗体是特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathy，iim)中临床无肌病皮肌炎(clinical amyopathic derma-tomyositis，cadm)亚型相对常见的肌炎特异性抗体(myositis specific antibody，msa)。mda5抗体是一种肌炎特异性自身抗体，可作为皮肌炎(dermatomyositis，dm)患者的生物学标志物。目前已证实该抗体与dm患者发生间质性肺疾病(interstitial lung disease，ild)密切相关。人体血清中抗mda5抗体的存在情况是诊断和预测特发性炎性肌病患者预后的重要生物标志物，抗mda5抗体与dm相关，可以作为cadm临床诊断的生物标志物，抗mda5抗体的存在也与dm-ild患者的整体生存预后不良有关。

2、作为一种新型罕见病及新型指标，目前尚无市售的商业化抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测试剂盒，而少数医疗单位自制的科研试剂盒其制备工艺复杂，难以控制，制备出的试剂盒灵敏度较低，无法满足现阶段抗黑色素瘤分化相关基因5抗体的检测需要。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测试剂盒及其应用，以解决现有技术存在的抗黑色素瘤分化相关基因5抗体体外检测试剂灵敏度较低的问题。本发明试剂盒采用黑色素瘤分化相关基因5多肽a1、黑色素瘤分化相关基因5多肽a2、黑色素瘤分化相关基因5多肽a3分别与磁微粒偶联，进一步提高了检测结果的灵敏度。

2、为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

3、在一个方面，本发明提供了一种抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测试剂盒，其包括：黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒工作液，所述黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒工作液包括黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒和磁珠缓冲液；示踪物标记的抗体工作液，所述示踪物标记的抗体工作液包括示踪物标记的第一抗体和稀释液；其中，所述黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒包括黑色素瘤分化相关基因5多肽a1偶联磁微粒、黑色素瘤分化相关基因5多肽a2偶联磁微粒和黑色素瘤分化相关基因5多肽a3偶联磁微粒。

4、本发明试剂盒中所述黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒包括黑色素瘤分化相关基因5多肽a1偶联磁微粒、黑色素瘤分化相关基因5多肽a2偶联磁微粒和黑色素瘤分化相关基因5多肽a3偶联磁微粒；如此设置，使得黑色素瘤分化相关基因5中各抗原位点暴露更加充分，经免疫血清学检测技术验证，与现有的黑色素瘤分化相关基因5抗体检测试剂盒相比，其抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测的灵敏度更强。

5、进一步的，所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a1具有如seq id no.1所示的氨基酸序列；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a2具有如seq id no.2所示的氨基酸序列；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a3具有如seq id no.3所示的氨基酸序列。

6、进一步的，所述磁微粒为甲苯磺酰基磁珠；优选的，所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a1偶联磁微粒中黑色素瘤分化相关基因5多肽a1与所述磁微粒的包被比例为5ug/mg；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a2偶联磁微粒中黑色素瘤分化相关基因5多肽a2与所述磁微粒的包被比例为2.5ug/mg；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a3偶联磁微粒中黑色素瘤分化相关基因5多肽a3与所述磁微粒的包被比例为3ug/mg。

7、本发明试剂盒中所述黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒包括黑色素瘤分化相关基因5多肽a1偶联磁微粒、黑色素瘤分化相关基因5多肽a2偶联磁微粒和黑色素瘤分化相关基因5多肽a3偶联磁微粒；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a1偶联磁微粒中黑色素瘤分化相关基因5多肽a1与所述磁微粒的包被比例为5ug/mg；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a2偶联磁微粒中黑色素瘤分化相关基因5多肽a2与所述磁微粒的包被比例为2.5ug/mg；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a3偶联磁微粒中黑色素瘤分化相关基因5多肽a3与所述磁微粒的包被比例为3ug/mg，使得黑色素瘤分化相关基因5中各抗原位点暴露更加充分，经免疫血清学检测技术验证，与现有的黑色素瘤分化相关基因5抗体检测试剂盒相比，其抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测的灵敏度更强。

8、因本发明申请中所使用的所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a1、黑色素瘤分化相关基因5多肽a2、黑色素瘤分化相关基因5多肽a3相比完整的黑色素瘤分化相关基因5抗原，可使得黑色素瘤分化相关基因5抗原表位充分暴露，提升了检测的灵敏度，同时三条多肽分子量相对较大，也使其可以直接包被于甲苯磺酰基磁珠上，而不受空间位阻的影响，在简化工艺、降低成本的同时，还可以避免在偶联工艺时需要对多肽使用偶联剂处理，进而避免了在处理后对多肽活性及结构产生的不利影响，提升了多肽的稳定性。

9、进一步的，所述黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒工作液中所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a1偶联磁微粒的终浓度为0.05mg/ml，所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a2偶联磁微粒的终浓度为0.03mg/ml，所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a3偶联磁微粒的终浓度为0.02mg/ml。

10、本技术中采用了先将三种不同的黑色素瘤分化相关基因5多肽分别与甲苯磺酰基磁珠偶联，形成不同的黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒，再将不同的黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒以特定终磁珠浓度混合形式。较同时将不同的黑色素瘤分化相关基因5多肽在同一液体内与磁珠微粒偶联，磁珠微粒上偶联的黑色素瘤分化相关基因5多肽更加均匀，避免了在同一磁珠微粒上偶联多种黑色素瘤分化相关基因5多肽时出现空间位阻较大、均匀性较差的情况，进一步提升了试剂盒检测结果的灵敏度。

11、进一步的，所述磁珠缓冲液为0.01mg/ml牛血清白蛋白、0.9mg/ml氯化钠、0.1ml/ltriton-x1000、0.01ml/ml procline-300、ph为7.4、浓度为0.01m的磷酸盐缓冲液。

12、进一步的，所述示踪物为碱性磷酸酶。

13、进一步的，所述第一抗体为抗人igg抗体。

14、进一步的，所述稀释液为0.1mg/ml牛血清白蛋白、0.1mg/ml氯化钠、0.1mg/ml蔗糖、0.01ml/ml proclin300、ph为6.0、浓度为0.1mol/l的mes缓冲液。

15、进一步的，所述试剂盒还包括样本稀释液，所述样本稀释液为0.01mg/ml牛血清白蛋白、0.001ml/ml procline-300、0.001ml/ml triton x-100的0.01m ph7.4磷酸盐缓冲液。

16、在另一个方面，本发明提供了所述试剂盒在用于非疾病诊断目的的体外抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测中的应用。

17、进一步的，本发明的试剂盒用于检测的样本包括全血、血清或血浆。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

19、自身免疫性肌炎、皮肌炎患者血液中产生的抗黑色素瘤分化相关基因5抗体为具有针对于不同抗原表位的抗体混合物(可理解为多克隆抗体)。不同个体产生的抗体种类及抗体占比不同。人工合成的黑色素瘤分化相关基因5抗原为基因工程表达的抗原，仅有部分抗原决定簇充分暴露，使用单一抗原进行免疫学检验时极易造成漏检，导致灵敏度低。通过黑色素瘤分化相关基因5多肽a1、黑色素瘤分化相关基因5多肽a2、黑色素瘤分化相关基因5多肽a3联合使用，尽可能多的涵盖了特异有效的抗原表位。

20、本技术选用的黑色素瘤分化相关基因5多肽a1、黑色素瘤分化相关基因5多肽a2、黑色素瘤分化相关基因5多肽a3均含有不同的抗原决定簇，三个抗原的抗原决定簇与其对应抗体的结合速率常数恒定且各不相同，单个抗原的浓度水平信号值与信号值水平呈正相关，免疫检测方法学通过信号值与预先设定的临界值的比对来判断检测结果的阴阳性。三个抗原对在人群中抗体的检测存在互补关系。三个抗原在同时混合使用时的终磁珠浓度尤为重要，只有在将混合后的抗原检测结果调至信号值水平接近时，三个抗原阳性判定值接近，此时灵敏度、特异性最高。某个抗原浓度相对较低时，会导致仅有该抗原能检出的样本信号值低于临界点，误判为阴性，导致漏检，灵敏度下降。同理当某个抗原浓度相对较高，导致整体样本整体信号值拉高，临界点上移，误判为阳性，结果是错检，特异性下降。

21、本发明中提供的抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测试剂盒中所述黑色素瘤分化相关基因5偶联磁微粒包括黑色素瘤分化相关基因5多肽a1偶联磁微粒、黑色素瘤分化相关基因5多肽a2偶联磁微粒和黑色素瘤分化相关基因5多肽a3偶联磁微粒；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a1偶联磁微粒中黑色素瘤分化相关基因5多肽a1与所述磁微粒的包被比例为5ug/mg；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a2偶联磁微粒中黑色素瘤分化相关基因5多肽a2与所述磁微粒的包被比例为2.5ug/mg；所述黑色素瘤分化相关基因5多肽a3偶联磁微粒中黑色素瘤分化相关基因5多肽a3与所述磁微粒的包被比例为3ug/mg。如此设置，对抗黑色素瘤分化相关基因5抗体的检测灵敏度为98.00％，特异性为100.00％，假阳性为0.00％，假阴性为2.00％。现有的以黑色素瘤分化相关基因5单抗原制备的试剂盒，灵敏度为90.00％、特异性为98.00％、假阳性为2.00％，假阴性为10.00％，本发明中提供的抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测试剂盒较其假阴降低了80％，效果显著。进一步提高了对不同患者血清的抗黑色素瘤分化相关基因5抗体检测的灵敏度，有助于临床正确诊断及治疗。