一种高灵敏度的数字化酶联免疫吸附分析样品的制备方法与流程

报告物酶分子m复合物，n和m分别表示一个非磁微粒上结合检测抗体和报告物酶分子的数量；
8.3)通过孵育将步骤1)制备的捕获抗体
x-磁性微珠复合物、步骤2)制备检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物和待测抗原标志物结合，形成“捕获抗体-标志物-检测抗体”结构的双抗体夹心复合物，在磁力架辅助下进行孵育洗涤，将未结合的非磁微粒洗去；
9.4)将步骤3)中的双抗体夹心复合物装载到微米坑阵列中，使得每个微米坑中只容纳一个双抗体夹心复合物，再加入底物，得到所述数字化酶联免疫吸附分析样品。
10.具体为：
11.1)捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物的制备：将磁性微珠和活化剂混合反应一段时间，待磁性微珠表面被活化后，用清洗缓冲液洗去磁珠上未发生反应的多余活化剂；向活化后的磁性微珠内加入一定量捕获抗体的样品，混合孵育完全后，用清洗缓冲液洗去多余未绑定捕获抗体，形成捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物，备用；
12.2)检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物的制备：用清洗缓冲液洗去非磁性微珠上未发生反应的多余试剂，加入活化剂，置于样品混合仪上旋转，加入一定量检测抗体，混合孵育，清洗缓冲液洗去多余未反应的检测抗体，再向非磁性微珠中加入报告物酶分子的样品，实现报告物酶分子的固定，清洗缓冲液洗去多余未绑定报告酶分子，形成检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物，备用；
13.3)捕获抗体-标志物-检测抗体双抗体夹心复合物的制备：分别容器中加入步骤1)中所制备的捕获抗体
x-磁性微珠复合物、标志物及步骤2)中所制备的检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物，混合孵育，得到“捕获抗体-标志物-检测抗体”结构的双抗体夹心复合物，在磁力架辅助下进行孵育洗涤，将未结合的非磁微粒洗去；
14.4)delisa检测芯片的样品制备：将单坑直径为的微米坑阵列固定到扫描仪镜头下的微流室中并密封，只留有1个进样口和1个出样口运行液体的流入和流出；将步骤3)中制备的含双抗夹心复合物的混合物通过进样口注入微米坑阵列中，其中，微米坑直径和“捕获抗体-标志物-检测抗体”结构的双抗体夹心复合物直径d的关系为：使得每个微米坑中只能容纳一个双抗体夹心复合物，在外加磁铁辅助下，将双抗体夹心复合物装载到微米坑阵列中，得到所述delisa样品；
15.在某些具体操作方式中，上述步骤可以通过以下方式进行操作：
16.步骤1)制备捕获抗体
x-磁性微珠复合物：
17.①
首先对磁性微珠进行清洗，用清洗缓冲液洗去磁性微珠上未发生反应的多余试剂；
18.②
对磁性微珠表面进行活化处理，使其携带能和捕获抗体发生特异性绑定的活性基团，充分孵育，然后用清洗缓冲液清洗并将其充分分散；
19.③
加入捕获抗体，充分孵育，使捕获抗体充分与磁性微珠表面的活性基团结合，用清洗缓冲液洗去磁性微珠上未结合的多余抗体，充分分散，形成捕获抗体
x-磁性微珠复合物；
20.④
在磁力架辅助下移除试管内多余液体，使试管内只剩捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物。
21.步骤2)制备检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物：
22.①
首先对非磁性微粒进行清洗，用清洗缓冲液洗去非磁性微粒上未发生反应的多余试剂；
23.②
对非磁性微粒表面进行活化处理，使其携带能和捕获抗体发生特异性绑定的活性基团，充分孵育，然后用清洗缓冲液清洗并将其充分分散；
24.③
加入抗体，充分孵育，使抗体充分与非磁性微粒表面的活性基团结合，用清洗缓冲液洗去非磁性微粒上未结合的多余抗体；
25.④
加入报告物酶分子，充分孵育，使之与非磁性微粒上的活化位绑定，充分分散。由于非磁性微粒的表面积较小，直径约0.2μm非磁性微粒的表面积约为0.13μm2，不宜包被过多蛋白质，最多可包被2000个蛋白质，使包被液中检测抗体数与报告物酶分子数均为5.7
×
10
14
个，足以连接多个生物素化抗体和报告物酶分子。通过控制二者之间的摩尔比，能保证形成检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m；
26.⑤
通过离心或其他方式，移除容器中未和非磁性微粒结合报告物酶分子，使试管内只剩检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m。
27.步骤3)制备捕获抗体-标志物-检测抗体双抗体夹心复合物：
28.将标志物加入步骤1)中所制备的捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物中，充分孵育，使标志物与捕获抗体发生特异性结合，形成磁性微珠-捕获抗体-标志物免疫复合物。此步骤中要使捕获抗体
x-磁性微珠的数量大于标志物-捕获抗体结合物的数量，以保证每一个标志物都能结合一个捕获抗体
x-磁性微珠，形成磁性微珠-捕获抗体-标志物免疫复合物；将步骤2)中制备的检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物加入上述制备的磁性微珠-捕获抗体-标志物免疫复合物中，充分孵育，缓冲液清洗，使两种免疫复合物充分结合，形成捕获抗体-标志物-检测抗体双抗体夹心复合物；
29.步骤4)，将步骤3)中的双抗体夹心复合物装载到微米坑阵列中，使得每个微米坑中只容纳一个双抗体夹心复合物，再加入底物，得到所述数字化酶联免疫吸附分析样品。
30.其中，上述的孵育或充分孵育是为了使反应充分，没有指代的特定条件，可以是37℃下孵育2小时，也可以是25℃孵育10小时；适当的震荡也可以进一步缩短孵育时间。
31.作为优选，步骤1)中所述捕获抗体与磁性微珠数量的比值为10～10000，优选100。
32.作为优选，步骤2)中所述检测抗体与非磁微粒数量的比值为10～10000，所述报告物酶分子与非磁微粒数量的比值为10～10000。
33.作为优选，所述报告物酶分子为辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶中的一种；步骤2)中所述非磁微粒与报告物酶分子以及检测抗体采用a-c)中任一种顺序结合：
34.a)非磁微粒先与检测抗体结合再与报告酶分子结合；
35.b)非磁微粒先与报告酶分子结合再与检测抗体结合；
36.c)非磁微粒与报告酶分子、检测抗体共固结合。
37.步骤(2)中所述非磁微粒与报告酶分子及检测抗体的固定顺序，可以先将检测抗体固定到非磁微粒，然后，再将报告酶分子固定到非磁微粒。也可以将次序互换，先固定报告酶分子，再固定检测抗体。
38.作为优选，步骤3)中，磁性微珠与待测抗原标志物数量的比值≥5，优选≥10；非磁微粒与待测抗原标志物数量的比值≥5，优选≥10。
39.作为优选，所述步骤3)中双抗体夹心复合物的形成可采用a)-c)中任一种顺序结
合：
40.a)待测抗原标志物先和捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物孵育结合，再和检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物孵育结合；
41.b)待测抗原标志物先和检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物孵育结合，再和捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物孵育结合；
42.c)待测抗原标志物和捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物、检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物一起孵育结合。
43.根据泊松分布理论(如下面的公式所示)，当磁性微珠与待测抗原标志物数量的比值为10时，每个磁性微珠结合待测抗原标志物的平均数(λ)为0.1，所以一个磁珠结合2个(即k＝2)待测抗原标志物的概率p(k＝2)为0.00452，即可近似认为每个磁性微珠只结合一个待测抗原标志物。磁性微珠与待测抗原标志物的结合的计算与此一致。
44.p(k)＝λk/k！+e-λ
(k＝0,1,2
…
)
45.本发明还提供了一种上述任一方法制备得到的数字化酶联免疫吸附分析样品。
46.本发明另一方面还提供了一种使用上述样品进行elisa检测的方法，包括以下步骤：
47.制备若干组标志物浓度不同的数字化酶联免疫吸附分析样品，以及标志物浓度未知的待测数字化酶联免疫吸附分析样品；待所述数字化酶联免疫吸附分析样品酶催化后，记录亮光微米坑数量，根据标志物浓度与亮光微米坑数量建立标准曲线；根据待测数字化酶联免疫吸附分析样品的亮光微米坑数量确定其标志物浓度。
48.所述亮光微米坑特指阳性的微米坑数量，包括颜色、荧光或自动发光的微米坑。根据标志物浓度与阳性微米坑数量建立标准曲线；根据待测delisa样品的阳性微米坑数量确定其标志物分子数或浓度。
49.优选地，所述双抗体夹心复合物的探测，采用光学系统。所述报告酶分子，hrp、β-gal、alp或其他酶类，可以有效地将底物催化生成另一种与底物颜色不同的产物，或受激发可发射与底物波长不同荧光的产物，或自动发光的产物。
50.利用光学设备对上述数字化酶联免疫吸附分析样品进行检测时，可检测到光信号的微米坑记录为1，未检测到光信号的记录为0。
51.作为优选，上述方法适用于肿瘤、传染病等疾病以及食品、环境检测。
52.需要指出，由于分子间的反应动力学影响，活性基团对之间的反应效率低于100％，每次更换溶液步骤的死体积效应，以及溶液清洗和溶液转移以及洗脱反应等步骤的不彻底，都会造成一定程度的分子和/或磁性微珠的丢失，需要建立标准曲线予以校正。
53.具体的检测方法为：
54.delisa检测：明场下，扫描仪扫描并记载芯片中双抗体夹心复合物数量；暗场下，将报告物酶分子的底物经进样口加入芯片后油封，充分酶促反应后，利用光学扫描系统收集检测芯片中各微米坑中酶促产物的发射波长并记录；
55.标准曲线的建立与检测结果的转换：将浓度已知标准品稀释，配制成从1皮摩尔(1
×
10-12
摩尔)到埃摩尔(1
×
10-18
摩尔)10倍递减稀释的溶液，重复步骤(1)-(6)，绘制标准曲线。根据标准曲线，将待测样品的检测结果转换为实际标志物浓度。
56.在某些具体操作方式中，上述步骤可以通过以下方式进行具体操作。
57.将上述得到的双抗体夹心复合物进行光学检测用于定量。将容器内的双抗体夹心复合物装载到预先制备好的微米坑阵列中。具体做法：从内含微米坑阵列的微流室的样品入口，加入双抗体夹心复合物，利用磁铁在微米坑基底下方来回穿梭数次，通过磁力将双抗体夹心复合物装载载到微米坑中。微米坑的直径只能容纳1个双抗体夹心复合物，微米坑的数目远大于双抗体夹心复合物，因此，基本保证全部双抗体夹心复合物都能装载到微米坑中。注入酶底物后油封，酶催化一定时间后，在光学显微镜下检测和记录。每个有亮光的微米坑即为一个阳性分子。理论上，所有阳性亮点的总和接近待测的抗原标志物数量。
58.配置不少于7个从pm至am浓度梯度的已知抗原标志物标准样本，通过上述样品制备方法得到样品，再通过上述光学检测测量不同浓度梯度的抗原标志物待测样本的最终信号响应值。此处信号响应值即为阳性微米坑数量的总和。每个样本至少重复3次，计算每个样本最终信号响应的平均值及标准偏差(sd)。以样本浓度为横坐标，样本最终信号响应的平均值为纵坐标，绘制散点图，对散点图进行线性拟合以建立标准曲线，并计算拟合度r2。根据惯例，将背景信号加上背景信号的3倍sd确定未检出限(lod)。
59.一种高灵敏度的delisa样品制备方法，将抗原标志物(bm)转换成附载有报告酶分子(ez)的微珠，通过对酶催化底物产生光学可检测产物的探测，实现对待测bm的精确定量，与传统方法相比，本方法具备了增加了单个微珠连接的酶分子数量的优点，传统方法使亲和素标记的ez和生物素标记的检测抗体(ab2)结合，ab2与bm、捕获抗体(ab1)形成免疫复合体，ab2只结合一个ez分子。本方法的步骤2)将ez直接结合在非磁微粒表面，在优选条件下结合的ez数量可提高1000倍以上，这可以进一步将delisa方法的灵敏度提高。
附图说明
60.图1是本发明的具体操作流程图；
61.图2是本发明中双抗体夹心复合物的制备、检测方案图示。
具体实施方式
62.以下将通过实施例来详细说明本技术的实施方式，借此对本技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
63.本技术中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本技术中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
64.本技术还存在其它多种可实施的技术方案，在此不做一一列举，本技术权利要求中要求保护的技术方案都是可以实施的。
[0065]“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由
……
组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本技术的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由
……
组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本技术的范围内。
[0066]
下面结合附图对本发明做进一步说明。
[0067]
其中实施例分别是使用不同的体系，制备得到了能够大幅度提高检测效率的
delisa样品，并对其进行了检测，以验证本方法具有普适性。
[0068]
实施例1
[0069]
本实施例提供一种人cd40抗原标志物转换至β-半乳糖苷酶(β-gal)报告物的方法，具体如下。
[0070]
其具体的操作流程图如图1所示，图2为双抗体夹心复合物的制备、检测方案。
[0071]
步骤一，制备捕获抗体
x
(ab1)-磁性微珠(mms)的免疫复合物：
[0072]
(1)磁珠表面的活化处理：取100μl含约600000个磁性微珠(mms)的溶液，用100μlpbst(含0.1％吐温20的0.01m的磷酸盐缓冲液)溶液清洗磁性微珠(mms)两次；将25％戊二醛溶液用pbs(磷酸盐缓冲液)稀释为8％(v/v)的戊二醛溶液，向容器内加入350μl 8％的戊二醛溶液，室温下振荡5h，用pbst重复清洗磁性微珠表面两次。
[0073]
(2)在磁性微珠表面固定ab1(人cd40捕获抗体)：向容器内加入350μl 8％的戊二醛溶液，使抗体室温下平衡至少15分钟，将1.75μg的ab1加入容器，室温下振荡反应过夜，使ab1固定在磁性微珠表面，再用pbst溶液重复清洗磁性微珠表面两次，得到ab1
x-mms复合物，即得到所述的捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物，此时x的数值约为10000左右。
[0074]
步骤二，非磁性微粒(np)表面固定检测抗体(ab2)和报告物酶分子(ez)：
[0075]
(1)非磁性微粒(np)的分散及活化：取适量100μl约含400000个直径为0.2μm的非磁性微粒放置于一支新的试管中，在室温下放置10min，漩涡震荡20s使非磁性微粒充分扩散；室温下8000g离心5min，去上清；用pbst清洗非磁性微粒两次，去上清；将25％戊二醛溶液用pbs稀释为8％(v/v)的戊二醛溶液，向非磁性微粒中加入350μl 8％的戊二醛溶液，室温下振荡混合5h，8000g室温下离心5min，去上清；用pbst重复清洗np两次，弃去上清。
[0076]
(2)向容器中加入10μl浓度为1.5μg/ml的β-半乳糖苷酶(ez)，非磁性微粒(np)表面包被ez，用pbst重复清洗非磁性微粒三次，用pbst清洗，去上清液。
[0077]
(3)向试管中加入10μl浓度为2.0μg/mlab2(人cd40检测抗体)，室温下振荡反应5h，充分孵育，使ab2与np上的自由位点绑定。一个np上可以连接多个ab2和ez，得到ab2
n-np-ezm复合物，，此时，n和m的数值均约为10000左右，即得到所述的检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物。
[0078]
(4)用pbst重复清洗三次，弃去上清，容器中只剩下ab2
n-np-ezm复合物。
[0079]
步骤三，制备捕获抗体-标志物-检测抗体”双抗体夹心复合物：
[0080]
向容器内加入100μl浓度为10fg/ml的bm(人cd40抗原)，室温下振荡反应5h，与约600000个ab1
x-mms复合物特异性结合形成mms-ab1-bm，bm的量要小于ab1的量(1＜bm的分子数＜ab1的分子数)，确保bm全部和ab1
x-mms复合物结合。
[0081]
将步骤二制备的约400000个ab2
n-np-ezm复合物加入的容器内，室温下振荡混合，充分孵育，使ab2与bm发生特异性结合，形成双抗体夹心复合物，。
[0082]
步骤四：双抗体夹心复合物的光学探测：
[0083]
(1)将步骤三中产生的磁性颗粒混合物(含有双抗体夹心复合物和ab1
x-mms复合物)进行荧光检测用于定量。将容器内的磁性颗粒混合物装载到预先制备好的微米坑阵列中。具体做法：从内含微米坑阵列的微流室的样品入口，加入磁性颗粒混合物，利用磁铁在微米坑基底下方来回穿梭数次，通过磁力将磁性颗粒混合物装载载到微米坑中。微米坑的直径只能容纳1个磁性颗粒混合物，微米坑的数目远大于磁性颗粒混合物数，因此，基本保
证全部磁性颗粒混合物都能装载到微米坑中。
[0084]
(2)滴加底物(试卤灵-β-d-吡喃半乳糖苷)，酶催化一定时间后，在荧光显微镜下观察荧光反应并记录(激发波长558nm；发射波长577nm)。每个有亮光即为一个阳性分子。理论上，所有亮点的总和约等于待测的bm数量。
[0085]
步骤五，建立标准曲线：
[0086]
配置浓度梯度为0、1、5、10、100、1000fg/ml的的bm(人cd40抗原)待测样本，分别通过步骤一至步骤五测量不同浓度梯度的bm待测样本的最终信号响应值，每个样本至少重复3次，计算每个样本最终信号响应的平均值及标准偏差(sd)。以样本浓度为横坐标，样本最终信号响应的平均值为纵坐标，绘制散点图，对散点图进行线性拟合以建立标准曲线，并计算拟合度r2。通过外推法计算检测限(lod)，lod等于背景信号加上背景信号的3倍sd。
[0087]
实施例2
[0088]
本实施例提供一种新冠抗原标志物转换至辣根过氧化物酶(hrp)报告物的方法，具体如下：
[0089]
步骤一，制备捕获抗体(ab1，重组小鼠抗sars-cov-2n单克隆抗体)与磁性微珠(mms)的复合物(ab1
x-mms)：
[0090]
(1)磁珠表面的活化处理：取100μl含约600000个磁性微珠(mms)的溶液，用100μlpbst(含0.1％吐温20的0.01m的磷酸盐缓冲液)溶液清洗磁性微珠两次；将25％戊二醛溶液用pbs(磷酸盐缓冲液)稀释为8％(v/v)的戊二醛溶液，向容器内加入350μl 8％的戊二醛溶液，室温下振荡5h，用pbst重复清洗磁性微珠表面两次。
[0091]
(2)在mms表面固定ab1(重组小鼠抗sars-cov-2n单克隆抗体)：向容器内加入350μl 8％的戊二醛溶液，使抗体室温下平衡至少15分钟，将1.75μg的ab1加入容器，室温下振荡反应过夜，使ab1固定在磁性微珠表面，再用pbst溶液重复清洗磁性微珠表面两次，得到ab1
x-mms复合物，即得到所述的捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物，此时x的数值约为10000左右。
[0092]
步骤二，非磁性微粒(np)表面固定检测抗体(ab2，兔抗sars-cov-2n多克隆抗体)和报告物酶分子(ez)：
[0093]
(1)np的分散及活化：取100μl约含400000个直径为0.2μm的np放置于一支新的试管中，在室温下放置10min，漩涡震荡20s使np充分扩散；室温下8000g离心5min，去上清；用pbst清洗np两次，去上清；将25％戊二醛溶液用pbs稀释为8％(v/v)的戊二醛溶液，向np中加入350μl 8％的戊二醛溶液，室温下振荡混合5h，8000g室温下离心5min，去上清；用pbst重复清洗np两次，弃去上清。
[0094]
(2)向容器中加入10μl浓度为1.5μg/ml的辣根过氧化物酶(ez)，np表面包被ez，用pbst重复清洗np三次，去上清液。
[0095]
(3)向试管中加入10μl浓度为2.0μg/ml ab2(兔抗sars-cov-2n多克隆抗体)，室温下振荡反应5h，充分孵育，使ab2与np表面上的自由位点绑定。一个np上可以连接多个ab2和ez，得到ab2
n-np-ezm复合物，此时，n和m的数值均约为10000左右，即得到所述的检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物。
[0096]
(4)用pbst重复清洗三次，弃去上清，容器中只剩下ab2
n-np-ezm复合物复合物。
[0097]
步骤三，制备捕获抗体-标志物-检测抗体”双抗体夹心复合物：
[0098]
向容器内加入100μl浓度为10fg/ml的bm(新冠病毒n重组蛋白)，室温下振荡反应5h，与与约600000个ab1
x-mms复合物特异性结合形成mms-ab1 x-bm，bm的量要小于ab1的量(1＜bm的分子数＜ab1的分子数)，确保bm全部和ab1
x-mms复合物结合。
[0099]
将步骤二制备的约400000个ab2
n-np-ezm复合物加入到容器内，室温下振荡混合，充分孵育，使生物素化ab2与bm发生特异性结合，形成双抗体夹心复合物。
[0100]
步骤四：双抗体夹心复合物的光学探测：
[0101]
(1)将步骤三中产生的磁性颗粒混合物(含有双抗体夹心复合物和ab1
x-mms复合物)进行荧光检测用于定量。将容器内的磁性颗粒混合物装载到预先制备好的微米坑阵列中。具体做法：从内含微米坑阵列的微流室的样品入口，加入磁性颗粒混合物，利用磁铁在微米坑基底下方来回穿梭数次，通过磁力将磁性颗粒混合物装载载到微米坑中。微米坑的直径只能容纳1个磁性颗粒混合物，微米坑的数目远大于磁性颗粒混合物数，因此，基本保证全部磁性颗粒混合物都能装载到微米坑中。
[0102]
(2)滴加底物(鲁米诺)，酶催化一定时间后，在荧光显微镜下观察荧光反应并记录(激发波长558nm；发射波长577nm)。每个有亮光即为一个阳性分子。理论上，所有亮点的总和约等于待测的bm数量。
[0103]
步骤六，建立标准曲线：
[0104]
配置浓度梯度为0、1、5、10、100、1000fg/ml的的bm(新冠病毒n重组蛋白)待测样本，分别通过步骤一至步骤五测量不同浓度梯度的bm待测样本的最终信号响应值，每个样本至少重复3次，计算每个样本最终信号响应的平均值及标准偏差(sd)。以样本浓度为横坐标，样本最终信号响应的平均值为纵坐标，绘制散点图，对散点图进行线性拟合以建立标准曲线，并计算拟合度r2。通过外推法计算检测限(lod)，lod等于背景信号加上背景信号的3倍sd。
[0105]
实施例3
[0106]
本实施例提供一种人前列腺特异性抗原(psa)转换至辣根过氧化物酶(hrp)报告物的方法，具体如下：
[0107]
步骤一，制备捕获抗体(ab1，psa单克隆抗体，来源于小鼠)与磁性微珠(mms)复合物(ab1
x-mms)：
[0108]
(1)磁珠表面的活化处理：取100μl含约600000个磁性微珠(mms)的溶液，用100μlpbst(含0.1％吐温20的0.01m的磷酸盐缓冲液)溶液清洗磁性微珠两次；将25％戊二醛溶液用pbs(磷酸盐缓冲液)稀释为8％(v/v)的戊二醛溶液，向容器内加入350μl 8％的戊二醛溶液，室温下振荡5h，用pbst重复清洗磁性微珠表面两次。
[0109]
(2)在mms表面固定ab1(psa单克隆抗体，来源于小鼠)：向容器内加入350μl 8％的戊二醛溶液，使抗体室温下平衡至少15分钟，将1.75μg的ab1加入容器，室温下振荡反应过夜，使ab1固定在mms表面，再用pbst溶液重复清洗磁性微珠表面两次，得到ab1
x-mms复合物，即得到所述的捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物，此时x的数值约为10000左右。
[0110]
步骤二，非磁性微粒(np)表面固定检测抗体(psa多克隆抗体，来源于兔)和报告物酶分子(ez)：
[0111]
(1)np的分散及活化：取100μl约含400000个直径为0.2μm的np放置于一支新的试管中，在室温下放置10min，漩涡震荡20s使np充分扩散；室温下8000g离心5min，去上清；用
pbst清洗np两次，去上清；将25％戊二醛溶液用pbs稀释为8％(v/v)的戊二醛溶液，向np中加入350μl 8％的戊二醛溶液，室温下振荡混合5h，8000g室温下离心5min，去上清；用pbst重复清洗np两次，弃去上清。
[0112]
(2)向容器中加入10μl浓度为1.5μg/ml的辣根过氧化物酶(ez)，np表面包被ez，用pbst重复清洗np三次，去上清液。
[0113]
(3)向试管中加入10μl浓度为2.0μg/mlab2(psa多克隆抗体，来源于兔)，室温下振荡反应5h，充分孵育，使ab2与np表面上的自由位点绑定。一个np上可以连接多个ab2和ez，得到ab2
n-np-ezm复合物，此时，n和m的数值均约为10000左右，即得到所述的检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物。
[0114]
(4)用pbst重复清洗三次，弃去上清，容器中只剩下ab2
n-np-ezm复合物。
[0115]
步骤三，制备捕获抗体-标志物-检测抗体”双抗体夹心复合物：
[0116]
向容器内加入100μl浓度为10fg/ml的bm(psa)，室温下振荡反应5h，与ab1特异性结合形成mms-ab1-bm，bm的量要小于ab1的量(1＜bm的分子数＜ab1的分子数)，确保bm全部和ab1
x-mms复合物结合。
[0117]
将步骤二制备的约400000个ab2
n-np-ezm复合物加入到容器内，室温下振荡混合，充分孵育，使生物素化ab2与bm发生特异性结合，形成双抗体夹心复合物。
[0118]
步骤四：双抗体夹心复合物的光学探测：
[0119]
(1)将步骤三中产生的磁性颗粒混合物(含有双抗体夹心复合物和ab1
x-mms复合物)进行荧光检测用于定量。将容器内的磁性颗粒混合物装载到预先制备好的微米坑阵列中。具体做法：从内含微米坑阵列的微流室的样品入口，加入磁性颗粒混合物，利用磁铁在微米坑基底下方来回穿梭数次，通过磁力将磁性颗粒混合物装载载到微米坑中。微米坑的直径只能容纳1个磁性颗粒混合物，微米坑的数目远大于磁性颗粒混合物数，因此，基本保证全部磁性颗粒混合物都能装载到微米坑中。
[0120]
(2)滴加底物(鲁米诺)，酶催化一定时间后，在荧光显微镜下观察荧光反应并记录(激发波长558nm；发射波长577nm)。每个有亮光即为一个阳性分子。理论上，所有亮点的总和约等于待测的bm数量。
[0121]
步骤六，建立标准曲线：
[0122]
配置浓度梯度为0、1、5、10、100、1000fg/ml的bm(psa)待测样本，分别通过步骤一至步骤五测量不同浓度梯度的bm待测样本的最终信号响应值，每个样本至少重复3次，计算每个样本最终信号响应的平均值及标准偏差(sd)。以样本浓度为横坐标，样本最终信号响应的平均值为纵坐标，绘制散点图，对散点图进行线性拟合以建立标准曲线，并计算拟合度r2。通过外推法计算检测限(lod)，lod等于背景信号加上背景信号的3倍sd。
[0123]
实施例4
[0124]
本实施例提供一种新冠的sars-cov-2spike蛋白igm抗体标志物转换至碱性磷酸酶(alp)报告物的方法，具体如下：
[0125]
步骤一，制备捕获抗体(ab1，sars-cov-2spike蛋白)-磁性微珠(mms)的复合物(ab1
x-mms)：
[0126]
(1)磁珠表面的活化处理：取100μl含约600000个磁性微珠(mms)的溶液，用100μlpbst(含0.1％吐温20的0.01m的磷酸盐缓冲液)溶液清洗磁性微珠两次；将25％戊二醛溶
液用pbs(磷酸盐缓冲液)稀释为8％(v/v)的戊二醛溶液，向容器内加入350μl 8％的戊二醛溶液，室温下振荡5h，用pbst重复清洗磁性微珠表面两次。
[0127]
(2)在mms表面固定ab1(sars-cov-2spike蛋白)：向容器内加入350μl 8％的戊二醛溶液，使抗体室温下平衡至少15分钟，将1.75μg的ab1加入容器，室温下振荡反应过夜，使ab1固定在磁性微珠表面，再用pbst溶液重复清洗磁性微珠表面两次，得到ab1
x-mms复合物，即得到所述的捕获抗体
x-磁性微珠免疫复合物，此时x的数值约为10000左右。
[0128]
步骤二，非磁性微粒(np)表面固定检测抗体(ab2，抗igm抗体)和报告物酶分子(ez)：
[0129]
(1)np的分散及活化：取100μl约含400000个直径为0.2μm的np放置于一支新的试管中，在室温下放置10min，漩涡震荡20s使np充分扩散；室温下8000g离心5min，去上清；用pbst清洗np两次，去上清；将25％戊二醛溶液用pbs稀释为8％(v/v)的戊二醛溶液，向np中加入350μl 8％的戊二醛溶液，室温下振荡混合5h，8000g室温下离心5min，去上清；用pbst重复清洗np两次，弃去上清。
[0130]
(2)向容器中加入10μl浓度为1.5μg/ml的辣根过氧化物酶(ez)，np表面包被ez，用pbst重复清洗np三次，去上清液。
[0131]
(3)向试管中加入10μl浓度为2.0μg/ml ab2(抗igm抗体)，室温下振荡反应5h，充分孵育，使ab2与np表面上的自由位点绑定。一个np上可以连接多个ab2和ez，得到ab2
n-np-ezm复合物，此时，n和m的数值均约为10000左右，即得到所述的检测抗体
n-非磁微粒-报告物酶分子m复合物。
[0132]
(4)用pbst重复清洗三次，弃去上清，容器中只剩下ab2
n-np-ezm复合物。
[0133]
步骤三，制备捕获抗体-标志物-检测抗体”双抗体夹心复合物：
[0134]
向容器内加入100μl浓度为10fg/ml的bm(sars-cov-2spike蛋白igm抗体)，室温下振荡反应5h，与约600000个ab1
x-mms复合物特异性结合形成mms-ab1 x-bm，bm的量要小于ab1的量(1＜bm的分子数＜ab1的分子数)，确保bm全部和ab1
x-mms复合物结合。
[0135]
将步骤二制备的约400000个ab2-np-ez复合物加入到步骤三的试管内，室温下振荡混合，充分孵育，使ab2与bm发生特异性结合，形成双抗体夹心复合物。
[0136]
步骤四：双抗体夹心复合物的光学探测：
[0137]
(1)将步骤三中产生的磁性颗粒混合物(含有双抗体夹心复合物和ab1
x-mms复合物)进行荧光检测用于定量。将容器内的磁性颗粒混合物装载到预先制备好的微米坑阵列中。具体做法：从内含微米坑阵列的微流室的样品入口，加入磁性颗粒混合物，利用磁铁在微米坑基底下方来回穿梭数次，通过磁力将磁性颗粒混合物装载载到微米坑中。微米坑的直径只能容纳1个磁性颗粒混合物，微米坑的数目远大于磁性颗粒混合物数，因此，基本保证全部磁性颗粒混合物都能装载到微米坑中。
[0138]
(2)滴加底物(cdp-star)，酶催化一定时间后，在荧光显微镜下观察荧光反应并记录(激发波长558nm；发射波长577nm)。每个有亮光即为一个阳性分子。理论上，所有亮点的总和约等于待测的bm数量。
[0139]
步骤六，建立标准曲线：
[0140]
配置浓度梯度为0、1、5、10、100、1000fg/ml的的bm(sars-cov-2spike蛋白igm抗体)待测样本，分别通过步骤一至步骤五测量不同浓度梯度的bm待测样本的最终信号响应
值，每个样本至少重复3次，计算每个样本最终信号响应的平均值及标准偏差(sd)。以样本浓度为横坐标，样本最终信号响应的平均值为纵坐标，绘制散点图，对散点图进行线性拟合以建立标准曲线，并计算拟合度r2。通过外推法计算检测限(lod)，lod等于背景信号加上背景信号的3倍sd。
[0141]
本技术说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。
[0142]
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。
[0143]
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
[0144]
上述说明示出并描述了本技术的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本技术并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本技术的精神和范围，则都应在本技术所附权利要求的保护范围。