阿替洛尔中阿替洛尔环氧化物的检测方法与流程

1.本发明属于化学检测领域，特别涉及阿替洛尔中阿替洛尔环氧化物的检测方法。


背景技术：

2.环氧化物具有警示结构，是已知的潜在基因毒性杂质，其结构种类繁多，是基因毒性杂质中较为常见的一类。目前对于含有环氧化合物类基因毒杂质药物常用的检测方法为(1)直接检测法，如，采用gc-fid法直接测定阿莫卡兰中的环氧乙烷的残留量，其lod为0.09μg/g，可达到较高的精密度和灵敏度。近年来，对环氧氯丙烷(ech)杂质检测方法报道也比较多，常用气相色谱法、气相色谱-质谱联用法直接进行检测；对于非挥发性环氧化物则采用液相色谱法进行检测；(2)衍生化法：环氧化合物化学性质不稳定，且有些环氧化物是中性分子，不容易在esi离子源中质子化和去质子化，因此无法通过ms检测器来直接检测。当样品不能直接进样分析时，为了满足分析方法的要求，通常会选择柱前衍生的方法，将其转化为容易质子化的化合物或具有强紫外吸收的化合物，从而提高环氧化合物的检测灵敏度。
3.阿替洛尔环氧化物是具有警示结构的致突变杂质，在阿替洛尔中的限度仅为7.5ppm，如果用高效液相色谱法(hplc)测定时难以达到其灵敏度，若用气相色谱法直接测定阿替洛尔环氧化物含量，会因为阿替洛尔沸点高，难以检测；故本发明采用三重四级杆液质联用仪对阿替洛尔环氧化物进行测定。


技术实现要素：

4.为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种阿替洛尔中阿替洛尔环氧化物的检测方法，该方法灵敏度高，样品处理简单，能准确测定其含量。
5.本发明所提供的阿替洛尔中阿替洛尔环氧化物的检测方法，采用三重四级杆液质联用仪对阿替洛尔环氧化物进行测定；所述的阿替洛尔环氧化物在阿替洛尔中的限度为7.5ppm。
6.优选的，上述检测方法的质谱参数中，检测离子质荷比(m/z)为208.1/178.1。
7.优选的，上述联用仪采用的离子源为esi源，正离子源模式；is电压5500v、气帘气35psi、雾化气20psi、辅助气20psi、源温度500℃、碰撞气9psi。
8.优选的，该检测方法的色谱条件如下：
9.(1)色谱柱为waters xbridge c18，柱长150mm，内径4.6mm，液膜厚度3.5μm；
10.(2)流动相：a相：0.08～0.15％甲酸水溶液，b相：乙腈；
11.(3)流速0.45～0.55ml/min，柱温39～45℃；
12.(4)进样量20μl。
13.优选的，上述(2)中，a相为0.1％甲酸水溶液。
14.优选的，上述(3)中，流速0.5ml/min，柱温40℃。
15.优选的，上述检测方法的质谱参数中，dp为80～93、ep为10、ce为12～22、cxp为14。
16.优选的，质谱参数中，dp为84、ep为10、ce为14、cxp为14。
17.优选的，检测时所用溶液的配制方法如下：
18.(1)对照品贮备液：取阿替洛尔环氧化物对照品，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含阿替洛尔环氧化物100μg的溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，量取1ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
19.(2)对照品溶液：量取对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
20.(3)阿替洛尔原料药供试品溶液：取阿替洛尔原料药26mg，称定，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，量取1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
21.(4)阿替洛尔原料药加标供试品溶液：取阿替洛尔原料药26mg，称定，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，量取1ml，置10ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
22.(5)线性系列溶液：量取对照品贮备液0.1ml、0.3ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml，分置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
23.(6)定量限、检定量限溶液：
24.定量限溶液：量取对照品贮备液0.1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
25.检测量溶液：量取定量限溶液5ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
26.其中，上述所述溶剂为45～50％甲醇水，由水与甲醇按体积比45～50：50～65配制获得。
27.本发明的有益效果在于：
28.(1)本发明色谱和质谱条件下的空白溶剂和供试品溶液不干扰阿替洛尔环氧化物检测，方法的灵敏度满足检测要求；
29.(2)阿替洛尔环氧化物在0.09548ng/ml～1.910ng/ml范围内，相当于阿替洛尔环氧化物限度浓度百分比10％～200％范围，峰面积与浓度呈现良好的线性关系；
30.(3)阿替洛尔环氧化物定量限为0.0019ng，相当于供试品浓度的0.000073％(0.73ppm)，相当于限度浓度的9.79％；最低检测限为0.0010ng，相当于供试品浓度的0.000037％(0.37ppm)，相当于限度浓度的4.90％；定量限重复测定6次rsd为7.36％，小于中国药典指导原则及gmp定的限度15％，符合验证要求；
31.(4)本发明阿替洛尔环氧化物在室温条件下放置9h，对照品溶液与加标供试品溶液稳定；且阿替洛尔环氧化物回收率为99.26-108.01％，符合中国药典及gmp标准，本方法测定准确度符合验证要求。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
33.图1是优化6的空白溶剂图谱；
34.图2是优化6的阿替洛尔环氧化物对照品溶液图谱；
35.图3是优化6的供试品溶液图谱；
36.图4是优化6的加标供试品溶液图谱；
37.图5是优化6的阿替洛尔环氧化物线性图谱；
38.图6是不同质谱参数下阿替洛尔环氧化物的图谱，(a-f依次对应优化1中6个质荷比(m/z)的图谱)；
39.图7是优化1下的对照品溶液图谱(左图)和优化1下的供试品溶液图谱(右图)；
40.图8是优化2下的对照品溶液图谱(左图)和优化2下的供试品溶液图谱(右图)。
具体实施方式
41.为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
42.实施例1
43.表1色谱条件及质谱参数的优化1
44.[0045][0046][0047]
结论：(1)通过进样测定结果(图6(a)-(f))得出检测离子(m/z)为208.1/178.1时
(图6(a))，阿替洛尔环氧化物灵敏度高，峰型较好，选用检测离子质荷比(m/z)为208.1/178.1的质谱参数进行测定；(2)由于供试品干扰杂质的出峰(图7)，色谱条件需要继续优化。
[0048]
表2色谱条件优化2
[0049]
[0050][0051]
结论：更换色谱柱及梯度洗脱程序，供试品溶液仍干扰杂质的出峰(见图8)，色谱条件仍需优化。
[0052]
表3色谱条件优化3
[0053]
[0054][0055]
结论：更换色谱柱及梯度洗脱程序，对照品未出峰，色谱条件仍需优化。
[0056]
表4色谱条件优化4
[0057]
[0058][0059]
结论：更换色谱柱及梯度洗脱程序，仍未找到对照品的峰，色谱条件仍需优化。
[0060]
表5色谱条件优化5
[0061]
[0062][0063]
结论：更换色谱柱及梯度洗脱程序，供试品溶液仍干扰杂质的出峰，色谱条件仍需优化。
[0064]
表6色谱条件优化6
[0065]
[0066][0067]
注：与优化1-5相比，优化6方法降低了对照品溶液的浓度，此时对照品溶液浓度为1ng/ml(优化1-5中对照品溶液浓度为15ng/ml)，此方法下对照品溶液的灵敏度完全满足测定要求，因此供试品溶液的浓度相应降低。
[0068]
根据优化6的检测结果，最终确定将优化6作为最终检测方法，具体检测结果见实
施例2。
[0069]
实施例2
[0070]
(1)专属性测定
[0071]
表7阿替洛尔环氧化物专属性试验结果
[0072][0073]
结论：上表结果结合图1～4，可以获知空白溶剂和供试品溶液不干扰阿替洛尔环氧化物检测，该方法专属性符合验证要求。
[0074]
(2)线性关系试验
[0075]
表8阿替洛尔环氧化物线性关系试验
[0076][0077]
结论：阿替洛尔环氧化物线性浓度在0.09548ng/ml～1.910ng/ml范围内，相当于阿替洛尔环氧化物限度浓度百分比10％～200％范围，峰面积与浓度呈现良好的线性关系。
[0078]
(3)检测限与定量限试验
[0079]
优化6中供试品浓度约为1000ppm；
[0080]
表9阿替洛尔环氧化物检测限试验结果
[0081][0082]
表10阿替洛尔环氧化物定量限试验结果
[0083][0084]
结论：阿替洛尔环氧化物定量限为0.0019ng，相当于供试品浓度的0.000073％(0.73ppm)，相当于限度浓度的9.79％；最低检测限为0.0010ng，相当于供试品浓度的0.000037％(0.37ppm)，相当于限度浓度的4.90％；定量限重复测定6次rsd为7.36％，小于中国药典指导原则及gmp定的限度15％，符合验证要求。
[0085]
(4)稳定性试验
[0086]
表11阿替洛尔环氧化物溶液稳定性试验结果
[0087]
时间对照品溶液峰面积加标供试品溶液峰面积0h19480196802h20490206204h19360190406h19050193809h1812018200平均值1930019384rsd％4.424.57
[0088]
结论：对照品溶液与加标供试品溶液在室温条件下放置9h，峰面积仍稳定，rsd分别为4.42％、4.57％。
[0089]
(5)准确度试验
[0090]
表12阿替洛尔环氧化物准确度试验结果
[0091][0092]
结论：本发明阿替洛尔环氧化物回收率为99.26-108.01％，符合中国药典及gmp标准合理定的准确度范围70％～130％，本方法测定准确度符合验证要求。
[0093]
综上所述，阿替洛尔环氧化物在0.09548ng/ml～1.910ng/ml范围内，相当于阿替洛尔环氧化物限度浓度百分比10％～200％范围，峰面积与浓度呈现良好的线性关系，线性图见图5；经三重四级杆液质联用检测，图谱如图1～4所示，空白溶剂和供试品溶液不干扰杂质检测，方法的灵敏度满足检测要求，加标回收较好，这证明本方法灵敏度高、专属性强、稳定性好，适用于阿替洛尔环氧化物的测定。