一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于用于癌症检测的免疫测定，具体地，涉及一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、免疫组织化学(ihc)是利用抗体特异性识别对应抗原的特性，通过酶标抗体识别抗原，并催化底物显色，最终将抗原在组织上特异性的标记出来的技术。该技术作为基础的免疫学技术之一，一直在生命科学领域被广泛使用。尤其是在医疗诊断方面，临床病理诊断，尤其是肿瘤等疾病的诊断，ihc方法因其可直接在组织上原位标记，且方法经典，操作简便，结果灵敏可靠，成为金标准，发挥着重要作用。但随着疾病的个性化诊疗需求的增加，尤其是近年来，肿瘤领域中靶向药物越来越多的应用于临床，诊断指标以及药物临床入组需筛选指标越来越多，而单张样本切片只能检测一个指标的ihc技术愈发显示出其局限性，如无法显示不同指标共定位、在多指标检测时需较多切片、不同切片存在组织异质性等。在ihc方法的基础上，采用枝杈tsa染料取代传统ihc中的dab染料，通过多轮次染色，可对同一张组织切片上的多种不同抗原进行不同的荧光标记。

2、如中国专利申请公布号cn111830256a，发明名称为“一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法”，公开的试剂盒包括试剂a、试剂b、稀释液、fitc试剂、cy3试剂及cy5试剂，该试剂盒采用tsa信号放大技术，其原理与普通的免疫组化类似，一抗与抗原结合后，孵育hrp标记的二抗，hrp催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素，之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换第二种一抗进行第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记，并且每轮只孵育一种抗体，微波处理后洗去非共价结合的抗体，所以对所用抗体种属来源无限制。但是，该方案需采用分步染色，先催化biotin-tyramide链接上去，再用strepavidin-染料，操作复杂，耗时长，不利于临床使用。

3、中国专利申请公布号cn109541217a，发明名称为“一种霍奇金淋巴瘤的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用”，公开的试剂盒限定了单克隆抗体组包括cd3单克隆抗体、cd30单克隆抗体、cd68单克隆抗体、cd56单克隆抗体、lag3单克隆抗体、pd1单克隆抗体和pdl1单克隆抗体中的两种以上、不超过六种。该方案仅能标记不超过六种免疫检查点，且仅适用于霍奇金淋巴瘤。现有技术中亟需一种适用于多种癌症，且精确度高的多重荧光免疫组化检测试剂盒。

技术实现思路

1、1、要解决的问题

2、针对现有技术多重荧光免疫组化检测中，对同一张切片上的多种不同抗原同时标记时，干扰多，灵敏度低，批次间稳定性差技术问题，本技术提供一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，可对同一张组织切片上的多至8种不同抗原进行不同的荧光标记，同时结合全光谱荧光成像系统以及光谱拆分成像软件，对多至9色(含细胞核)的组织切片进行成像。本技术还提供了一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，适用于多种癌症，可采用自动化染色仪器操作，批次间稳定性更强，更节约人力成本，对科研及临床帮助更大。

3、2、技术方案

4、为达到上述目的，提供的技术方案为：

5、本发明的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：抗原染液、细胞核染液、信号放大稀释液、hrp酶标二抗聚合物、抗荧光淬灭封片剂、缓冲液；

6、所述抗原染液包括tsa480、tsa520、tsa540、tsa570、tsa620、tsa650、tsa700、tsa770。

7、进一步的，所述hrp酶标二抗聚合物为鼠兔通用聚合物hrp酶标二抗。

8、进一步的，所述细胞核染液为dapi染液；所述缓冲液为tbst缓冲液。

9、优选的，所述信号放大稀释液为0.3％h2o2，抗荧光淬灭封片剂为可选普通商用抗荧光淬灭封片剂。

10、进一步的，还包括二甲苯溶液、乙醇溶液和中性福尔马林溶液。

11、优选的，还包括抗原修复液，所述抗原修复液为ph值为6.0的0.01m柠檬酸钠修复液或ph值为9的tris-edta溶液(0.05m tris，0.001m edta)。

12、进一步的，所述乙醇溶液包含3个浓度梯度，质量分数分别为70％、95％和100％；所述中性福尔马林溶液的质量分数为10％。

13、一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，使用所述多重荧光免疫组化检测试剂盒；将所述多重荧光免疫组化检测试剂盒应用于癌症的检测中。

14、优选的，所述癌症为肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、黑色素瘤等。

15、进一步的，包括如下步骤：脱蜡水合；微波抗原修复；封闭；一抗孵育；二抗孵育；用所述抗原染液荧光染色；重复一抗孵育、二抗孵育和荧光染色，重复次数≤7次；细胞核染色；封片。

16、优选的，所述微波抗原修复步骤中，将脱蜡水合后的载玻片置于修复杯中，用抗原修复液浸没，将修复杯置于微波炉内高火煮沸，低火维持15min，注意补液，防止蒸发过度导致干片，取出室温自然冷却至室温。

17、优选的，所述封闭步骤中，去除载玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿，震荡10min。

18、进一步的，所述一抗孵育步骤中，用缓冲液浸洗载玻片，重复1次；所述二抗孵育步骤中，滴加所述hrp酶标二抗聚合物孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复1次；所述荧光染色步骤中，滴加所述抗原染液孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复3次，微波修复，灭菌水洗片1次，缓冲液浸片后封闭。

19、优选的，所述一抗孵育步骤中，去除载玻片上的封闭，用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域，室温保湿震荡孵育1h，需针对不同抗体做优化调整，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为3min。

20、优选的，所述二抗孵育步骤中，去除载玻片上残存的洗液，直接滴加hrp酶标二抗聚合物，浸没样本区域，室温保湿孵育10min，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为3min。

21、优选的，所述荧光染色步骤中，去除载玻片上残存的洗液，用移液器在载玻片上滴加抗原染液浸没样本区域，室温保湿震荡孵育10min，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为3min，微波修复，室温自然冷却至室温，灭菌水洗载玻片1次，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为2min，单染结束，封片观察或追加后续染色，从步骤3封闭开始后续染色，每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用缓冲液覆盖样品，防止干片。

22、进一步的，所述细胞核染色步骤中，滴加所述细胞核染液孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复3次。

23、优选的，所述细胞核染色步骤中，室温孵育5min，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为2min，然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。阅片：对染色后的载玻片在荧光显微镜下观察并分析。

24、进一步的，所述脱蜡水合步骤中，用所述二甲苯浸载玻片，重复3次；乙醇浸载玻片：梯度次序为100wt％、95wt％和70wt％；灭菌水洗载玻片，重复3次；10wt％中性福尔马林浸载玻片，灭菌水洗载玻片，重复3次。

25、脱蜡水合的目的是使组织恢复到固定后的状态，暴露抗原以便与一抗结合。本技术的脱蜡水合参数脱蜡水合彻底，完全脱去切片上的蜡，不会引起染色不均匀、不产生非特异性背景着色等问题。

26、优选的，二甲苯浸载玻片，每次的时间为10min；乙醇浸载玻片，每次的时间为2min；中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗载玻片每次的时间为1min。

27、3、有益效果

28、采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：

29、(1)本发明的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，包括抗原染液、细胞核染液、信号放大稀释液、hrp酶标二抗聚合物、抗荧光淬灭封片剂、缓冲液，所述抗原染液包括tsa480、tsa520、tsa540、tsa570、tsa620、tsa650、tsa700、tsa770。采用聚合物hrp二抗，以及枝杈tsa染料，信号放大作用更强，灵敏度更高，依托光谱拆分功能的成像系统，可更精准的对组织进行高通量成像，干扰少，成像精度高。

30、(2)本发明的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒素的应用，使用所述多重荧光免疫组化检测试剂盒，将所述多重荧光免疫组化检测试剂盒应用于癌症的检测中。可对同一张组织切片上的多至8种不同抗原进行不同的荧光标记，同时结合全光谱荧光成像系统以及光谱拆分成像软件，对多至9色(含细胞核)的组织切片进行成像，并以组织流式技术分析平台对染色后的病理组织进行包括阳性率、细胞间护作、空间定位、细胞亚群间相互作用等在内的多种维度精确分析，为包括肿瘤在内的多种临床疾病的精确诊断提供更多可能。