使用磁性颗粒的亲和选择质谱法工作流程的制作方法

使用磁性颗粒的亲和选择质谱法工作流程
1.相关申请的交叉引用
2.本技术于2022年2月10日作为pct专利国际申请提交，并且要求于2021年2月10日提交的美国临时专利申请第63/147,827号的权益和优先权，该申请特此通过引用并入本文。
3.背景
4.亲和选择质谱法(affinity selection by mass spectrometry)(asms)涉及候选分子与固定化或可溶性受体的结合，并且已经被用于以时间和成本有效的方式筛选大型化合物库。常规asms工作流程基于溶液相温育，其中将结合靶标添加到药物分子的混合物中。在用药物分子的混合物温育结合靶标之后，可以从混合物中洗掉未结合的药物分子，仅留下对靶蛋白具有亲和力的那些化合物作为药物-蛋白质复合物。该亲和力选择之后可以是在制备后处理(workup)期间将结合的化合物从靶蛋白中洗脱，然后通过质谱法确定。
5.随后的色谱方法也已经被用于将洗脱的药物分子与靶蛋白和其他配体结合测定组分分离。超滤、旋转柱和尺寸排阻色谱法已经被常规地用于将结合至靶蛋白的苗头化合物(hit compound)与测定混合物内的未结合的化合物和其他组分分离。此类色谱法步骤通常已经被用作二维色谱方法的第一色谱法步骤，其中第二维包括在质谱分析之前将结合的苗头化合物与靶蛋白分离。
6.多维色谱法操作通常必须以串联方式进行。在高通量筛选方法的背景下，在给定的孔板内分析数百或数千个样品的情况下，耗时的制备和分析程序可以大大延长完成筛选所需的时间，或者可替代地限制可以被筛选的化合物的数量。期望能够在高通量筛选的制备和分析阶段期间避免此类瓶颈的方法。
7.概述
8.提供该概述来以简化形式介绍一系列构思，这些构思将在以下详细描述中被进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的必要或基本特征。本概述也不旨在被用于限制所要求保护的主题的范围。
9.本文所描述的技术涉及用于有效筛选大型化合物库内化合物的结合亲和力的系统和方法。在此类方法期间，可以基于对结合靶标的选择的亲和力将化合物从测定混合物中分离，并且随后通过质谱法鉴定。这些系统和方法可以是与化合物对结合靶标的亲和力的自动化高通量筛选相兼容的asms方法，并且可以不包括制备型和分析型色谱法操作两者。由于色谱法操作通常必须相对于多种测定混合物的分析以连续方式进行，诸如在高密度微量滴定板中，因此本文所公开的系统和方法为hts方法的能力提供了显著的益处。本文所公开的方法可以包括对由用于质谱法分析的单独筛选测定所产生的混合物进行直接取样。
10.本文公开了用于从多种药物候选物中确定对结合靶标具有选择的亲和力的苗头化合物组的方法。通常，本文所公开的方法可以包括在测定容器内形成测定混合物，测定混合物包含多种药物候选物和固定化到磁性颗粒上的结合靶标，制备用于质量分析的测定混合物的至少一部分，以及将含有苗头化合物组的样品转移到质谱仪的开放端口取样接口。
在某些方面，转移苗头化合物组可以在从结合靶标洗脱苗头化合物之前发生。可替代地，可以将苗头化合物组从结合靶标洗脱，然后转移到开放端口取样接口。本文所公开的方法可以特别适用于自动化和高通量应用，其中确定对特定结合靶标具有选择的亲和力的化合物可以在最小干预下大规模进行。本文公开的方法通常可以部分或完全地以任何顺序包括上述操作，如由本文所提供的若干实施方案和实施例所示的。
11.在某些方面，形成测定混合物可以包括通过从化合物库向测定容器连续添加各化合物将多种药物候选物引入测定容器中；将磁性颗粒引入测定容器中；以及任选地，在测定条件下温育多种药物候选物和磁性颗粒。磁性颗粒包括可操作以与一种或多种靶标化合物结合的结合位点。
12.在某些方面，制备测定混合物的至少一部分可以包括从苗头化合物组中分离测定混合物的一种或多种组分，即，将未结合的化合物与结合的化合物
–
磁性颗粒组分分离，以及将苗头化合物与磁性颗粒上的结合靶标分离。
13.在某些方面，在制备用于质量分析的测定混合物之前，可以部分地或完全地进行样品转移。
14.在某些方面，含有苗头化合物组的样品包括呈测定混合物内的结合的化合物
–
磁性颗粒组分的形式的磁性颗粒。
15.某些方面可以进一步包括通过选择性地激活磁力将磁性颗粒捕获在质谱仪的载体流内，以及随后通过选择性地使磁力失活将磁性颗粒释放至废物流中。此类方面可以包括在将载体流引导至离子源用于电离之前，将磁性颗粒捕获在开放端口采样接口内或开放端口采样接口的下游部件内。
16.在某些方面，磁性颗粒可以经由来自质谱仪的样品汽化室的排气被弃去，该质谱仪包括用于将磁性颗粒与质谱仪的入口隔离的捕集器。
17.在某些方面，转移含有苗头化合物组的样品可以包括将测定混合物的样品直接从测定容器转移到开放端口取样接口，在与开放端口取样接口流体连通的磁性捕集器中捕获结合的化合物
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磁性颗粒组分，以及将流经捕集器的捕获液体切换至溶剂，该溶剂可操作以从磁性颗粒上的结合位点释放结合的化合物。
18.制备测定混合物可以由以下组成：将磁体插入测定混合物中以将磁性颗粒保留在磁体附近；从测定混合物中去除磁体和保留的磁性颗粒；任选地用洗涤溶液洗涤邻近磁体的保留的磁性颗粒；以及使磁性颗粒与洗脱液接触，任选地同时将磁性颗粒保留在磁体附近，从而将苗头化合物与磁性颗粒上的一个或多个结合靶标分离，将所洗脱的苗头化合物转移到开放端口取样接口。
19.可替代地，制备测定混合物可以由以下组成：在测定容器附近施加磁力以将磁性颗粒保留在测定容器内；从测定容器中抽吸测定混合物的至少一部分；任选地洗涤测定容器内的磁性颗粒；向测定容器中添加洗脱液以从结合靶标洗脱苗头化合物，以及将苗头化合物从测定容器转移到开放端口取样接口中。在一些方面，转移可以包括将磁性颗粒和苗头化合物从测定容器转移到开放端口取样接口中。在这些方面，磁性捕集器被定位成在苗头化合物被电离并且被吸入质谱仪的入口之前捕获磁性颗粒并且将磁性颗粒与苗头化合物隔离。在其他方面，可以使用所施加的磁力使磁性颗粒在测定容器内被隔离，并且通过将苗头化合物从测定容器喷射到开放端口取样接口中来将苗头化合物与磁性颗粒分离。
20.在某些方面，将含有苗头化合物组的样品转移到开放端口取样接口可以包括声波喷射。
21.某些方面可以进一步包括通过质谱法分析苗头化合物组，而无需液相色谱法。
22.本文还公开了自动化、高通量筛选(hts)系统，并且通常与上面公开的方法一致。在某些实施方案中，本文所公开的hts系统可以包含：测定容器准备模块，其被配置成将多种化合物从化合物库引入测定容器中；测定模块，其被配置成进行结合测定，该结合测定包括将磁性颗粒引入测定容器中，所述磁性颗粒包括至少一个结合位点用于与至少一种靶标化合物结合；以及分析模块，其被配置成从测定容器转移样品用于分析。在其中测定容器包含微量滴定孔板的样品孔的实施方案中，分析模块可以是可操作的以将来自孔板的每个孔的样品转移到质谱仪的开放端口取样接口中并且对每个样品进行质量分析。
23.生成与每个测定容器相关联的样品制备信息以对应于引入该孔的化合物以及任何其他相关样品制备信息，诸如磁性颗粒结合靶标、样品制备方法、温育时间等。在一些方面，标识符(诸如条形码)可以与包括多个样品孔(测定容器)的样品孔板相关联。这些模块中的一些或所有可以包括条形码读取器以识别样品孔板，并且可操作以定位样品孔板内的每个样品孔，并且将该样品孔与和该样品孔相关联的对应样品制备信息相关联。
24.分析模块可以使用样品制备信息以将每个样品孔所生成的质量分析结果与和该样品孔相关联的样品信息相关联。相关性可以基于相关联的样品孔信息和该样品孔的样品信息，由质量分析结果确定哪些化合物出现在每个质谱中(即苗头化合物)。样品信息可以包括例如对应于引入该测定容器、与样品孔相关联的一种或多种化合物的识别信息。样品信息可以包括例如指示一种或多种化合物、试剂、或与样品孔的分析相关的其他信息中的每一种的一种或多种标识符。
25.因此，该系统可操作用于确定哪个化合物组被引入特定样品孔中，以及通过质量分析确定了哪种或哪些化合物，即结合的化合物。
26.在一些实施方案中，提供了自动化高通量筛选系统。该系统包含：测定容器准备模块，其被配置成将多种化合物从化合物库引入测定容器中；测定模块，其被配置成进行结合测定，该结合测定包括该多种化合物和磁性颗粒，该磁性颗粒包括至少一个用于与测定容器中的至少一种靶标化合物结合的结合位点；以及分析模块，其被配置成将样品从测定容器转移到开放端口取样接口中，用于捕获和转移到对所转移的样品进行质量分析的质谱仪。在一些实施方案中，测定容器包含微量滴定孔板的样品孔，并且其中测定容器准备模块可操作以选择性地将化合物引入孔板的每个样品孔中。在这些实施方案中，通常可以为每个孔板提供样品标识符，并且基于孔板标识符和该样品孔在孔板上的位置、或坐标位置来识别每个样品孔。在一些实施方案中，测定容器可以包含等分试样管或小瓶，并且其中测定容器准备模块可操作以选择性地将化合物引入每个等分试样管或小瓶中。在这些实施方案中，样品标识符通常可以被设置在每个等分试样管或小瓶上。样品标识符可以呈例如与和该测定容器相关联的样品信息相关的容器标识符的形式。
27.在一些实施方案中，分析模块可以包括声波液滴喷射器，该声波液滴喷射器可操作以将样品与测定容器一起喷射到开放端口接口中，用于转移到电离源用于电离。声波液滴喷射器可以被配置成例如以约1hz的速率从多个测定容器转移样品。
28.在一些方面，测定容器准备模块被配置成将标识符与引入该测定容器的每种化合
物的身份相关联。在一些方面，测定容器准备模块接收待引入测定容器的一种或多种化合物的列表，并且关联该测定容器的标识符或接收待用于接收所列出的一种或多种化合物的对应测定容器的标识符。
29.在一些实施方案中，分析模块被配置成将由从测定容器转移的样品所生成的质量分析结果与和该样品孔相关联的样品信息相关联。
30.可以想到，系统的每个模块可以独立地被操作以实现特定的端点，但也可以与其他模块通信，使得各自可以普遍适用于与任何数量的其他模块一起使用。
31.在某些方面，测定容器准备模块可以包含自动化液体分配器。在某些方面，测定容器准备模块可以包含声波分配器。
32.在某些方面，磁性结合颗粒可以包含磁性珠粒，磁性珠粒包含具有蛋白质结合靶标的链霉亲和素-生物素复合物。
33.在某些方面，分析模块可以包含声波液滴喷射器。此类方面可以被配置成每秒将至少1个样品从孔板转移到开放端口取样接口。
34.本文还公开了用于质谱仪的开放端口取样接口。开放端口取样接口通常可以包含与质谱仪的电离室流体连接的内部通道和与溶剂源流体连接的外部通道，内部通道和外部通道限定从溶剂源到电离室的溶剂流动路径；开放端口，其定位在外部通道与内部通道之间的接合处附近；电磁捕集器，其定位在溶剂流动路径内和开放端口的下游，电磁捕集器被配置成将进入内部通道的磁性颗粒选择性地保留在处于可操作状态的开放端口处；以及溶剂流动路径分流器，其定位在电磁捕集器的下游并且被配置成在电磁捕集器处于非操作状态时将溶剂流动从分析流动路径选择性地分流至废物流动路径。
35.前述概述和以下详细描述两者都提供了示例，并且仅是解释性的。因此，前述概述和以下详细描述不应当被视为是限制性的。此外，还可以提供除了本文所阐述的那些之外的特征或变型。例如，某些方面和实施方案可以涉及详细描述中所描述的各种特征组合和子组合。
36.附图简述
37.图1示出了使用磁性颗粒来捕获具有蛋白质结合亲和力的药物分子的magmass方法。
38.图2是实施方案中所使用的开放端口取样接口(opi)的示意图。
39.图3描绘了用于基于所选择的亲和力确定和分离化合物的方法的实施方案。
40.图4描绘了根据实施方案的用于基于所选择的亲和力确定和分离化合物的方法。
41.图5描绘了用于实现图4的方法的可能系统。
42.图6描绘了根据另外的实施方案的用于基于所选择的亲和力确定和分离化合物的方法。
43.图7描绘了用于实现图6的方法的可能系统。
44.图8描绘了根据另外的实施方案的用于基于所选择的亲和力确定和分离化合物的方法。
45.图9描绘了用于实现图8的方法的可能系统。
46.图10描绘了图9的系统的可能变体。
47.图11描绘了用于基于所选择的亲和力确定和分离化合物的方法。
48.详述
49.如以上总体上所述的，本文所公开的方法可以包括在测定容器内形成测定混合物，其中测定容器包含多种药物候选物和磁性结合颗粒。可用于构成多种药物候选物的化合物通常可以是在结合测定的条件下可溶且稳定的任何化合物，并且不限于任何特定结构、类型、来源、或类别的化合物。
50.在某些方面，多种药物候选物可以来源于与亲和力测定相容的任何来源。在某些方面，多种药物候选物可以单独地且连续地选自化合物诸如小分子的大型合成库。小分子通常可以在有机溶剂(例如，二甲基亚砜(dmso))中作为高度浓缩的溶液储存，旨在用于在结合测定缓冲液中稀释。生物化合物诸如肽、核酸、脂质等也被考虑作为与适用于本文所公开的筛选方法的结合靶标的药物候选物。
51.化合物的物理特性，除了它们对结合靶标的潜在亲和力之外，并不一定限制任何特定化合物适用于所公开的方法。在某些方面，根据其与常见测定缓冲液和筛选测定条件的相容性，在水性溶液中具有一定溶解度的化合物可以证明是有利的。在此类方面，可以将引入化合物作为小体积的高度浓缩溶液添加到有机溶剂诸如dmso中。出于该目的，液体分配器(例如，分配器，可获得自spt labtech ltd.)是本领域中已知的，并且可以快速且精确地向测定容器提供纳升级量的化合物溶液以便稍后被测定缓冲液稀释。声波分配方法(例如，声波分配器，可获得自labcyte inc.)在本领域中也是已知的，以实现类似的结果。当然，化合物也可以通过本领域中已知的任何机制转移，并且适合于亲和力选择测定的目的。
52.在某些方面，药物候选物可以来源于天然或合成来源。实际上，可以选择药物候选物作为单一天然产物或其提取物的样品。例如，在溶剂的存在下浸渍天然存在的物质可以提供复杂的化合物混合物，该化合物混合物可以以微升量直接添加到测定容器中。此类方面还可以包括物理分离和还原以确保混合物中存在的足够量的痕量天然产物得到充分展现。
53.在某些方面，测定混合物可以包含范围从20至20,000、50至10,000、100至5,000、250至4,000、或400至2,500的多种化合物。在其他方面，测定混合物可以包含范围从10至1,000、25至800、50至500、或100至250的许多独特的化合物。本文还考虑适合于制备选择性测定混合物的替代方法、浓度、化合物组合和装置。
54.单独地，形成测定混合物可以包括将磁性颗粒引入测定容器。例如，如本文关于术语所使用的，如以上应用于“磁性颗粒”时，术语“一个/种(a/an)”和“该(the)”旨在包括多个替代性方案，例如，至少一个/种。例如，除非另有说明，否则“磁性颗粒”的公开意在包括一个磁性颗粒、或多于一个磁性颗粒的混合物或组合。本文所考虑到的磁性颗粒不受其尺寸、形状或组成的特别限制。因此，在某些方面，“磁性颗粒”可以包含任何量的纳米微粒铁磁性颗粒、包含磁性芯和聚合物涂层的磁性珠粒及其组合。
55.在某些方面，磁性颗粒可以各自包含固定化在可接近测定混合物中的化合物的颗粒表面上的一个或多个结合靶标。结合靶标可以共价地或非共价地固定化在磁性颗粒上。结合靶标可以是任何类型的材料或结构，其中期望确定对结合靶标的所选择的亲和力。在某些方面，结合靶标可以是蛋白质，诸如抗体或抗原、蛋白质片段、核酸、核酸片段、脂质、碳水化合物、聚合物、小分子、或其任何组合。类似地，本文所公开的方法不受结合靶标固定化
到固相颗粒上的方式以及任何方便且与测定混合物相容的技术的限制，同时在本文中通常考虑在很大程度上保留固定化结合靶标的结合特性。以该方式，可以通过在磁性珠粒上提供对应于靶标化合物的预期活性的结合靶标来从混合物中分离靶标化合物。在结合时，结合的化合物
–
磁性颗粒可以在磁场的影响下被物理操纵，并且结合的化合物可以在施加释放剂(release agent)时被选择性地释放。
56.例如，在某些方面，该方法可以包括通过用氨基硅烷试剂处理磁性颗粒表面上的si-oh并随后与戊二醛(ga)反应，或经由链霉亲和素-生物素相互作用或组氨酸标签，将蛋白质固定化到固相设备的表面，ga的游离端能够与赖氨酸的氨基反应以捕获蛋白质结合靶标。用于将结合靶标固定化到磁性颗粒上的其他机制是已知的，并且如本领域技术人员将理解的那样在本文中考虑。本文公开了依赖ms用于确定的hts方法期间的磁性颗粒及其处理和操作。其他亲和力探针与本文所公开的某些方面组合使用也如本领域技术人员将理解的那样被考虑在内。此类探针可以包括固相微萃取(spme)纤维；reed(如美国临时专利申请第62/692,274号中所述，其内容并入本文)；和磁性珠粒。
57.由于测定混合物涉及用于本技术的方法和系统的测定组分的物理制备，因此形成测定混合物不受任何特定方法或机制的限制，并且通常可以是适合于根据需要提供和实施测定混合物以筛选一系列化合物的所选择的亲和力的任何方法或机制。因此，测定混合物的形成通常可以包括引入本文明确公开的组分(例如，磁性颗粒、多种药物候选物、结合靶标)以及进行亲和力测定所必需的任何数量的另外的测定组分。在某些方面，另外的测定组分可以包括测定溶剂、缓冲盐、稳定剂等。如本领域普通技术人员将理解的，本文还考虑结合测定中常见的替代性测定组分。
58.如本文所公开的测定容器可以是适合于保留测定组分并且允许在形成测定混合物和本文所公开的方法的任何另外的操作中从测定混合物中对测定组分取样测定组分或从测定混合物转移测定组分的任何容器。在某些方面，测定容器可以包含具有任何适当尺寸的孔板阵列的孔，例如24、48、96、384或1536孔板阵列。类似地，容器可以具有与上述孔板的常见尺寸相关的任何适当体积以容纳测定混合物，并且因此本文所考虑的容器可以具有约10μl至1ml的总体积。因此，应理解，在某些方面，如本文所公开的测定混合物的制备可以包括用于串行或并行分析的多种测定混合物的制备，如通常用于高通量亲和力筛选测定所进行的。
59.类似地，引入测定组分可以通过适用于测定、特别是高通量测定的任何方法进行。例如，将多种独特化合物引入测定混合物可以包括通过液体分配器从化合物库连续转移多种化合物中的每种。出于该目的，液体分配方法(例如，分配器)和声波分配器是已知的，并且可以从高度浓缩的来源以纳升级体积引入每种化合物。以该方式，可以准备在几分钟内将数千种独特化合物引入测定混合物中。然后，随之可以在数小时或数天内制备一系列数百种测定混合物，诸如用于384孔板的测定混合物，其中每个孔包括包含独特化合物的非简并组合。
60.将测定组分引入测定容器可以以任何顺序并且通过任何适合进行测定的手段发生。在某些方面，引入测定组分可以包括将多种独特化合物引入测定容器，用测定缓冲液稀释该多种化合物，以及将亲和力探针引入容器。
61.由于其涉及多种药物候选物，在某些方面，形成测定混合物可以包括通过将各化
合物从化合物库连续添加到空孔板中将多种药物候选物引入测定容器中。如本领域技术人员将理解的，从文库化合物贮库引入化合物的方法可以被自动化，使得可以通过选择化合物库来创建含有数百个孔的孔板，这些孔各自具有100-2500种独特化合物的组合。
62.形成测定混合物还可以包括将磁性颗粒引入测定容器中。在某些方面，可以将颗粒独立于其他测定组分并且在多种药物候选物或其他测定组分之前引入测定容器。可替代地，可以将磁性颗粒作为磁性颗粒在测定缓冲液内的均匀悬浮液引入测定容器中，并且完成测定混合物。磁性颗粒的均匀悬浮液可以通过机械搅拌或通过磁力搅拌来实现。至于将多种药物候选物引入测定容器中，引入磁性颗粒可以包括抽吸均匀悬浮液，或通过非接触式方法诸如声波转移。以该方式，可以通过在多种药物候选物的存在下立即提供测定条件来小心地控制测定条件，同时允许有足够的时间在单个测定板中制备具有数千或甚至数百万药物候选物的独特化合物板。
63.形成测定混合物还可以考虑μl数量级的各化合物的最终浓度。因为有机溶剂诸如dmso的浓度通常可以被限制在小百分比以确保测定相容性，因此形成如本文所考虑的测定混合物可以包括使用测定缓冲液稀释测定混合物。例如，在化合物作为在dmso中高度浓缩的溶液(例如，10mm至10m)储存在化合物库内的情况下，可以将每种化合物以纳升数量级的量转移，并且用水或测定缓冲液稀释以在每个孔内获得相对于添加到孔中的每种单个化合物在0.1μm至100μm的范围内的浓度。以该方式，测定混合物中dmso的总浓度可以被限制到小于5％、小于3％、小于2％或小于1％。
64.类似地，测定混合物可以并行或串行、或组合制备。例如，孔板的每个孔可以用每个孔内数百或数千种化合物的单一浓度制备。因此，如本文所考虑的测定混合物的形成可以包括在任何尺寸的孔板的孔内形成一系列测定混合物，如本领域普通技术人员将理解的。因此，在某些方面，可以制备包含24、48、96、384或1536个孔的板，使得每个孔含有如本文所公开的制备的测定混合物，每个孔具有待测定亲和力的数百或数千种化合物的组合。
65.一旦测定混合物的所有组分都存在，形成测定混合物可以进一步包括在适当的测定条件下温育多种药物候选物和磁性颗粒，所述测定条件允许在多种药物候选物内的苗头化合物组与结合靶标(例如，保留在磁性颗粒上的蛋白质片段)之间形成结合相互作用。通常，适当的条件，诸如达到结合平衡的温育时间、温度、盐浓度、药物候选物浓度等，依赖于特定测定，并且在本领域技术人员所理解的范围内。在某些方面，温育多种药物候选物和磁性颗粒可以包括在制备用于质谱和质量分析的样品之前将测定混合物加热至37℃持续至少15分钟。在某些方面，可以在某些方面采用机械搅拌以提供磁性颗粒在测定混合物内的均匀悬浮液，并且确保在测定混合物内在结合靶标与药物候选物之间实现结合平衡。机械搅拌可以包括适合于实现期望效果的任何方法，诸如使测定容器涡旋、将机械振动耦合至测定容器、机械或磁力搅拌，或通过在测定混合物内诱导振荡磁场，如以下详细描述的。一旦药物候选物与磁性颗粒之间的结合相互作用在测定混合物内达到平衡，就可以基于所示出的结合将苗头化合物组从测定组分中分离。因此，用于确定来自多种药物候选物的苗头化合物组的方法还可以包括形成测定混合物之后的制备后处理操作。在一般意义上，如本文所公开的用于质量分析的测定混合物的制备(例如，样品制备)可以包括分离一种或多种测定组分和结合至磁性颗粒的苗头化合物组。可以将测定混合物内未结合至磁性颗粒的药物候选物从测定混合物中分离，而苗头化合物-磁性颗粒复合物例如通过如以下所描述的
在测定混合物内诱导磁场而被保留。
66.在某些方面，用于质量分析的测定混合物的制备还可以包括破坏多种药物候选物内苗头化合物组之间的结合相互作用。
67.本文所考虑的磁性粒子通常可以包含适合于进行和辅助本文所考虑的结合和分离步骤的任何磁性材料、或磁性和非磁性材料的组合。在某些方面，磁性颗粒可以包含铁磁性颗粒，其能够保留磁性而无需有源地施加外部磁场，诸如通过如以上所提及的与测定混合物邻近的电磁体。铁磁性颗粒，包括铁和镍，可以有利地被应用于苗头化合物与磁性颗粒的物理分离，因为即使在不存在外部施加磁场的情况下，颗粒也将聚集成更大的颗粒组。此种聚集可以在破坏结合相互作用之后帮助保留磁性颗粒，同时将未结合的苗头化合物从样品中抽吸出或喷射出。适用于本文所考虑的磁性颗粒的铁磁性材料包括根据本领域普通技术人员已知的方法的铁和镍。可替代地、或另外地，本文所考虑的磁性颗粒可以包含顺磁性材料，该顺磁性材料在无外部施加磁场的情况下不保留磁性。顺磁性材料可以包括铂和锡。
68.在某些方面，磁性颗粒可以包含由非磁性材料涂覆的磁性芯，非磁性材料提供与结合靶标的附着。用于用聚合物表面涂覆磁性珠粒并且随后用结合靶标处理涂覆颗粒的表面的方法是本领域中已知的。结合靶标可以共价地或非共价地结合至磁性颗粒的表面。本文所考虑的磁性颗粒的尺寸不限于任何特定尺寸，并且可以是便于促进本文所描述的转移和结合步骤的任何尺寸。因此，本文考虑磁性颗粒为微粒、纳米颗粒或两者。磁性颗粒可以包含小于500μm、小于100μm、小于1μm、小于500nm、小于100nm、或小于10nm的颗粒。
69.在某些方面，破坏苗头化合物与结合靶标之间的结合相互作用可以包括通过将解结合溶剂引入测定混合物中来将苗头化合物与结合靶标分离。在某些方面，将苗头化合物与结合靶标分离可以包括在测定期间将磁性颗粒和结合至颗粒的化合物插入分离容器中的解结合溶剂中，以将该一种或多种化合物与颗粒解结合。在某些方面，分离容器中包含未结合的苗头化合物组、颗粒和解结合溶剂的所得混合物可以在开放端口取样接口的开放端处被注入流动溶剂中。
70.制备用于质量分析的测定混合物可以包括任何数量的操作，其可以以任何顺序进行，所述顺序适合以适当的方式提供用于质量分析的苗头化合物组。在某些方面，可以将苗头化合物-靶标复合物(即溶液内的结合的化合物
–
磁性颗粒组分)与测定混合物分离，并且用水性缓冲液洗涤，然后分离在结合靶标处结合至磁性颗粒的苗头化合物。在另一方面，制备测定混合物可以包括将苗头化合物与测定容器内的磁性颗粒分离，并且然后使用不需要使用抽吸将样品抽吸出的方法将洗脱的化合物引入具有或不具有磁性颗粒的开放端口取样接口中。在其中磁性颗粒被保留在样品容器内的适当位置(并且不连同苗头化合物一起取样至开放端口接口)的方面，可以将测定混合物从测定容器中抽吸出，同时使用位于测定容器内部或邻近测定容器的磁力将磁性颗粒保留在测定容器内。可以将洗涤溶液添加到磁性颗粒中，并且随后去除。任选地，可以选择性地关闭磁力以允许将结合的化合物-磁性颗粒组分与洗涤溶液混合，然后重新打开磁力并且抽吸洗涤溶液。至于涉及磁性颗粒的其他操作，洗涤溶液的混合可以通过机械或磁性手段来实现，如本文对于均匀地悬浮来自其他混合物的磁性颗粒所公开的。用于制备测定混合物的工作流程的另外的实例在图3-10和以下的几个实施方案中进行了描述。
71.在某些方面，形成测定混合物和制备用于质量分析的测定混合物各自可以独立地
包括搅拌测定混合物。例如，搅拌可以帮助在形成测定混合物的同时混合测定组分，以确保完全溶解或均匀悬浮。类似地，在混合物的分离组分的制备中，可以在形成和进行结合测定之后将试剂添加到测定混合物中。例如，当可以将沉淀助剂添加到测定混合物中以便将某些组分从混合物中分离成固相时。在其中期望搅拌测定混合物的方面，搅拌可以通过测定混合物内的机械或磁力搅拌器、邻近或插入测定混合物内的超声处理探针，或通过向含有测定混合物的测定孔本身施加机械振动来实现。然而，这些方法具有相关缺点，包括对于搅拌方法而言，从一种测定混合物到另一种测定混合物的交叉污染，所述搅拌方法涉及将搅拌器或探针插入测定混合物中以及通过将外部振动施加至测定容器来溢出测定混合物的一部分。
72.可替代地，测定混合物的搅拌可以通过向测定混合物内的磁性颗粒施加振荡磁力来实现。振荡磁力引起磁性颗粒振动，并且从而搅拌测定混合物。图13a示出了被配置成将此种磁力施加至测定容器(例如，测试管1310)内的磁性颗粒的示例性实施方案。如图13a中所示，多个电磁体1320a-1320d可以被定位在测试管的外部附近。然后可以将交流电施加至多个电磁体以产生足够强的振荡磁场，以耦合至磁性颗粒1330并且诱导测定混合物的搅拌。在图13a的实例中，磁体的n-s轴位于x-y平面中并且垂直于样品孔的竖直轴。可以提供电磁体的替代性布置，诸如将磁体的n-s轴与样品孔的竖直轴平行对齐，诸如申请人的美国专利公开第2018/0369831号中所描述的实施方案，该专利通过引用并入本文。
73.磁场的强度可以根据需要进行调节以实现磁力与磁性颗粒的充分耦合和充分的搅拌。在某些方面，磁场的强度可以在从1mt至1t、10mt至500mt、或25mt至250mt的范围内。如本领域技术人员将理解的，实现适当磁场强度所需的电流和电压可以根据电磁体相对于测定混合物的特性和定位而变化。在某些方面，测定混合物的搅拌可以通过施加具有50hz或60hz、或在10至400hz或20至100hz的范围内的频率的交流电来实现。在某些方面，施加至电磁体的交流电的频率和幅度中的每个可以是独立地可变的。在某些方面，搅拌的持续时间可以是至少2秒、至少5秒、至少10秒、或至少30秒。
74.如以上所描述的设备还可以应用于通过在测定混合物内诱导恒定磁力来将磁性颗粒与来自测定混合物的其他组分隔离。图13b示出了向电磁体施加直流电和测定混合物内的恒定磁力的结果，该恒定磁力使磁性颗粒1320靠着测试管1310的边缘移动。测定的非磁性组分(例如，不与磁性颗粒结合的溶剂和药物候选物)作为上清液1340保留在测定容器的中心部分中，并且可以通过本文所描述的任何方法(例如，抽吸或声波液滴喷射)从测定容器中去除。在某些方面，分离的持续时间可以是小于10秒、小于5秒、小于3秒、或小于1秒。
75.进一步考虑，如以上所描述的和如图13a-13b中所示出的实施方案所例示的施加的电磁体允许经由搅拌使测定混合物均匀化，并且随后通过隔离测定混合物内的磁性颗粒来制备用于质量分析。磁力可以通过分别施加交流电或直流电来振荡或保持恒定，以实现测定混合物内的磁性颗粒的搅拌或隔离。此类方面可以特别有利地与如本文所描述的声波喷射转移方法组合，该方法可以以非接触方式从测定容器的中心对测定混合物的一部分进行取样。在该意义上，整个测定可以进行并且被转移到质谱仪的开放端口接口，而不将外来组分或机械引入测定混合物中，并且没有污染测定或后续样品的风险。
76.从测定混合物中隔离磁性颗粒可以在破坏苗头化合物组与附接至磁性颗粒的结合靶标之间存在的结合相互作用之前或之后进行。因此，可以将以上所描述的连续搅拌和
隔离的方法应用于将结合至磁性颗粒的苗头化合物与其他测定组分诸如溶剂、盐、缓冲液和存在于测定混合物中对结合靶标不具有亲和力的其他药物候选物分离。在此类方面，可以将保留的磁性颗粒用洗涤溶液在混合物中重构以洗涤所保留的颗粒。另外，可以添加分离剂以破坏结合相互作用并且允许苗头化合物组与磁性颗粒分离。然后可以通过施加恒定磁场来隔离磁性颗粒，并且可以在没有磁性颗粒的情况下从测定混合物中转移溶剂化的苗头化合物。
77.本文还考虑由图13所体现的设备的替代性方案。例如，将图13的电磁体以相对于单个测试管的壁和其中所容纳的测定混合物的平面布置定位。然而，本文所考虑的设备的某些方面可以包含定位在测定混合物的平面以上的电磁体。此类方面可以允许在各种形状和大小的测定容器(例如如以上所描述的孔板的测定孔)内诱导振荡和恒定磁场。用于处理流体的磁性和电磁性组件的替代性布置公开于美国公开第2020/360879号、美国公开第2018/0369831号和美国专利第10,656,147号中，其各自通过引用并入本文。
78.在某些方面，本文所公开的方法可以包括在一种或多种测定混合物制备操作之前转移样品。事实上，某些方面可以包括在将含有苗头化合物组的样品直接转移到质谱仪的开放端口取样接口之后，部分地或完全地制备用于质量分析的测定混合物。图8提供了此方面的实例，其中制备测定混合物是通过保留磁性颗粒并且使洗涤溶液和洗脱液流过磁性颗粒以将苗头化合物洗脱到质谱仪的载体流中，在开放端口取样接口内进行的。
79.可替代地，制备测定混合物可以在将苗头化合物的样品转移到质谱仪的开放端口取样接口之前完成。在此类方面，可以操作测定混合物以提供在洗脱液中并且以适用于质谱分析的浓度的化合物组。在此类方面，应理解，在质谱仪和取样接口内不需要特殊仪器，只要取样接口与在其中制备含有苗头化合物的样品的容器相容即可。因此，要谨慎以确保在制备测定混合物期间保持相容性。
80.制备测定混合物可以在测定容器内、在单独的样品容器内、在转移导管内、在质谱仪的开放端口取样接口内、或其任何组合内进行。在某些方面，可以根据在将离子引入ms中之前过滤出固相设备的方法将结合或未结合的苗头化合物引入opi中。在一个实施方案中，制备用于质量分析的测定混合物可以在将分离的苗头化合物和磁性颗粒喷射到opi中之前在测定容器中进行，其中使用基于溶剂的捕获流体将样品与磁性颗粒分离。然后可以在进入ms之前捕获磁性颗粒。某些方面可以包括外部磁场以在将样品输送至ms离子源之前捕获固相设备。在另一实施方案中，捕集器可以在电喷雾电离opi之前或与转移导管(in-line)串行提供。
81.在某些方面，可以将结合至磁性颗粒的苗头化合物从颗粒中洗脱，然后将苗头化合物的样品转移到ms。例如，含有苗头化合物的样品可以用有机洗脱液或具有高浓度有机溶剂诸如甲醇和乙腈或其组合和水性混合物的洗脱液处理。洗脱液可以与质谱仪内存在的载体溶剂或捕获溶剂相同或不同。一旦洗脱，含有苗头化合物组的样品可以通过任何适当的方法被直接取样至开放端口取样接口，包括声波液滴喷射、流动注射和用于引入纳升至微升量的样品用于质量分析的自动化实验室系统。声波液滴喷射转移具有非接触式的另外的优点，诸如在高通量自动化系统中避免从一个样品到另一个样品的污染。例如，在转移期间从样品孔抽吸样品可以允许一些样品被保留在抽吸设备上，并且最终被转移到后续样品。声波喷射消除了样品之间此种污染的可能性，因为转移方法经由开放端口接口在样品
孔与质谱仪的流体流动之间完全无接触。
82.在又另外的方面，制备用于质量分析的测定混合物可以部分地在opi和/或转移导管中进行，而在测定容器中进行的操作更少。例如，可以使用第一捕获流体来捕获样品和磁性颗粒，当磁性颗粒与样品一起被捕获时，这提供洗涤作用，并且然后可以使用第二分离流体(即溶剂)来将含有苗头化合物组的样品与所捕获的磁性颗粒分离。在实施方案中，第二分离流体可以以变化的浓度梯度流动，其中浓度根据预定义的斜升或浓度增加的顺序从0％-100％增加。另外，在实施方案中，可以使用ms信号来触发从第一捕获流体到第二分离流体的切换。在该实施方案中，第一捕获流体被引导至ms，这在洗涤组分与ms相容时是可用的。在另一实施方案中，捕获流体可以被引导至废物导管，并且可以使用定时器来触发从第一捕获流体到第二分离流体的切换，并且将分离流体引导至离子源，这在洗涤组分与ms不相容时是可用的。
83.转移含有苗头化合物组的样品还可以包括物理转移和操作的任何特定布置。对于某些方面，含有苗头化合物组的样品还可以含有磁性颗粒。例如，可以将测定混合物直接取样至开放端口取样接口，使得苗头化合物在测定缓冲液内被转移并且结合至磁性颗粒上的结合靶标。可替代地，可以将苗头化合物从磁性颗粒中洗脱，但在将样品转移到开放端口接口之前保持在共同的悬浮液中而不分离。此外，还可以经由洗涤复合物将苗头化合物-磁性颗粒复合物与水性测定组分分离，并且然后可以将分离的复合物转移到开放端口接口。
84.在其中磁性颗粒存在于转移到含有苗头化合物组的开放端口接口的样品内的方面，有利的是，在电离之前将磁性颗粒与苗头化合物组可靠地分离并且从分析流中去除以便防止对质谱仪的损害。本文考虑的方法可以进一步包括将磁性颗粒捕获在质谱仪的载体流内，并且随后将磁性颗粒释放至废物流。以该方式，可以将伴随磁性颗粒的苗头化合物注入质谱仪的分析流中，同时保留磁性颗粒直到可以引导至废物流的时间。可替代地，可以使磁性颗粒与苗头化合物组一起经受电喷雾电离，并且从排气中收集。
85.本文所公开的方法可以利用电磁体用于将磁性颗粒保留在载体流内，直到苗头化合物可以被分离并且进入载体流用于分析。在某些方面，当将含有苗头化合物组和磁性颗粒的样品转移到开放端口时，磁性颗粒可以被选择性地保留在开放端口接口内(例如，通过处于可操作状态下的电磁体)。可以将测定组分从磁性颗粒-苗头化合物复合物洗涤至废物流，然后将苗头化合物从磁性颗粒分离到载体流中，同时继续保留磁性颗粒。然后，通过使磁性保留失活，可以允许磁性颗粒不受限制地通过开放端口朝向废物流移动。某些方面可以包括将质谱仪的流从载体流切换至废物流以适应以上所描述的实施方案。在电离之前，磁性颗粒也可以以类似的方式被选择性地保留在质谱仪的下游部件内。
86.单独地，可以允许结合或未结合于苗头化合物组(例如，在分离或不分离化合物的情况下)的磁性颗粒在载体流内行进，并且在样品汽化期间简单地离开被弃去的质量分析流。此类方面允许简化的方法，并且不需要另外的机制来实现期望的结果，尽管可能无法可靠地从质谱仪中去除磁性颗粒。
87.通过以上详细描述的这些方法，考虑可以从程序中移除常规色谱操作。如以上所描述的，可以采用液相色谱法来实现苗头化合物与结合靶标的分离。液相色谱法通常对样品连续进行并且需要15分钟至一个小时来完成运行。在诸如本文所描述的高度连续的方法中，移除该耗时的操作可以为整个筛选方法节省大量时间。
88.因此，可以快速连续地进行测定孔的连续分析，通常为约1至10秒而不是每10分钟或更长时间。因此，连续分析接近用于将样品转移到开放端口取样接口的声波液滴喷射方法的取样极限。
89.此外，通过消除色谱法步骤缩短操作时间可以允许减少每个测定孔的化合物数量。在某些方面，本文所公开的方法能够进行高通量亲和力筛选，其中每个测定孔内的多种药物候选物少于500种化合物、少于300种化合物、少于200种化合物、少于100种化合物、或少于50种化合物。
90.本文所公开的方法也可以不依赖于尺寸排阻色谱法，因为具有固定化结合靶标的大磁性颗粒能够在方法中的任何数量的操作下被选择性地从测定混合物中去除，而无需费时的色谱法。以下所描述的实施方案说明了以上描述和公开的构思。
91.本文所公开的方法的某些方面可以包括将多种药物候选物一起引入溶液中；插入包含可操作以基于所选择的亲和力与一种或多种化合物结合的表面处理的颗粒；将来自多种药物候选物的一种或多种化合物与颗粒结合；从溶液中去除颗粒和结合的一种或多种化合物；将该一种或多种化合物与颗粒分离；在开放端口取样接口的开放端处用流动溶剂捕获分离的一种或多种化合物；将溶剂和捕获的一种或多种化合物输送至电离设备；和将该一种或多种化合物电离。
92.在实施方案中，该方法可以进一步包括在质谱仪中分析电离的一种或多种化合物。在实施方案中，该方法可以进一步包括，在将该一种或多种化合物电离之后但在分析之前，基于由差示迁移率谱仪所提供的高场和低场离子迁移率的差异来分离电离的一种或多种化合物。
93.在实施方案中，将样品转移到开放端口接口可以包括注射或抽吸解结合溶剂和来自分离容器的未结合的一种或多种化合物，以及将所抽吸的解结合溶剂(即，洗脱液)和未结合的一种或多种化合物注射到被泵送至电离设备的溶剂流中。在实施方案中，注射可以包括将解结合溶剂的液滴和未结合的一种或多种化合物从分离容器中喷射到开放端口取样接口的开放端处的流动溶剂中。在实施方案中，转移样品可以包括声学地或气动地喷射样品的液滴。
94.在实施方案中，该方法可以进一步包括通过将所选择的药物候选物从测定容器声学地喷射到开放端口取样接口内的捕获流体中来对所选药物候选物进行取样。在实施方案中，该方法可以进一步包括在洗涤之后从测定容器中喷射所选择的药物候选物。
95.在实施方案中，该方法可以进一步包括，在将所选择的药物候选物从样品孔中喷射之前，将结合的药物候选物与磁性颗粒分离，将所选药物候选物与颗粒隔离，以及在没有固相设备的情况下将所选择的药物候选物喷射到开放端口取样接口的捕获流体中。可替代地，可以以与颗粒结合的状态喷射苗头化合物(即，所选择的药物候选物)。在某些方面，所选择的药物候选物可以由捕获流体从颗粒中洗脱(即未结合的)。可替代地，通过将洗涤溶液或洗脱液引入捕获流体中，可以将苗头化合物从捕获的固相设备释放。在某些方面，洗脱液可以与质谱仪内的载体溶剂相同或不同。
96.在一些实施方案中，将颗粒可以转移到opi，其中颗粒与苗头化合物分离，而在其他实施方案中，将颗粒和与苗头化合物结合作为苗头化合物-颗粒复合物的颗粒一起转移。
97.这些与随后将显而易见的其他方面和优点一起存在于下文更全面描述和要求保
护的构造和操作的细节中，并参考构成其一部分的附图，其中同样的数字通篇指的是同样的部件。通常，并且如以上所述，本文所公开的方法可以包括形成测定混合物，制备测定混合物，以及将含有苗头化合物组的样品转移到质谱仪的开放端口取样接口。由于这些操作可以含有以任何先后顺序的任何数量的另外的操作，因此本文公开了特定实施方案以说明本文所公开的方法的某些方面。本文所提供的实施方案不旨在限制本技术的范围。
98.出于以高度自动化的方式进行本文所公开的方法的目的，还考虑高通量亲和力筛选系统。通常，系统可以包含用于进行该方法的每个操作的单独模块。在某些方面，本文所考虑的系统可以包含测定容器准备模块，其被配置成将多种化合物从化合物库引入测定容器中。如以上，多种化合物可以是任何数量的化合物，并且在某些方面在10至10,000种化合物、500至5,000种化合物、或1,000至2,500种化合物的范围内。系统可以包含可变地耦合至化合物储存容器的声波分配器以将每种所选择的化合物的一部分从容器转移到测定容器。
99.本文所考虑的系统还可以包含测定模块，其被配置成在孔板内的任何数量的测定容器上进行结合测定。在某些方面，测定模块可以包含磁性或机械搅拌器、测定组分的储存器、温度控制器、自动化抽吸器等，用于制备用于质量分析的测定混合物。测定模块还可以包含附接至可移动臂的磁体(例如，电磁体)，并且可变地可定位在任何数量的测定容器内或附近，用于在测定期间的任何点处保留磁性颗粒。
100.系统还可以包含分析模块，其被配置成将来自孔板的每个孔的样品连续转移到质谱仪的开放端口取样接口中并且对每个样品进行质量分析。在某些方面，分析模块可以包含能够与孔板的任何孔耦合的声波液滴喷射器，以便促进从含有来自分析模块的样品的孔板连续转移样品用于分析。分析模块还可以包含磁体(例如，电磁体)用于在样品电离之前在模块内的任何点处选择性地保留磁体颗粒。分析模块可以包含质谱仪、样品汽化室、电离设备、质量碎片检测器、进行质谱分析所需的任何另外的部件。分析模块还可以被配置成自动将分析期间所检测到的质量碎片与来自样品内某些化合物的预期质量碎片相关联，以便确定样品中的化合物。
101.如图1中所示，本发明人发现现有技术的magmass方法使用磁性颗粒来捕获具有蛋白质结合亲和力的药物分子。首先，将磁性珠粒(b)引入含有在溶液中的药物分子候选物(u和d)的样品容器100。然后具有亲和力的药物分子候选物(d)与磁性珠粒结合。然后在洗涤容器110中去除未结合的药物分子(u)，同时经由来自磁体115的磁场将珠粒(b)和结合的药物分子候选物(d)保留在容器中。将洗涤的珠粒从洗涤容器中取出并且引入分离容器120中，在此处使用溶剂将药物分子候选物(d)与珠粒分离。然后将分离的药物分子候选物(d)从分离容器120抽吸出，同时经由来自磁体125的磁场将磁性珠粒保持在适当位置。然后将抽吸出的药物分子候选物随时间洗脱到lc-ms/ms130中用于分析。然后可以将磁性珠粒从分离容器120中磁性地去除。
102.如以上所讨论的，本文所公开的方面可以包括用于转移候选物分子的改进的方法和装置，其使用具有磁性珠粒作为固相设备的opi，以及用于以精确且受控的方式将样品非接触式引入opi的声波液滴喷射技术。
103.参照图2，示出了opi 200，其包含作为第一圆柱形构件的内部通道205和开放端口215，该第一圆柱形构件设置在外部通道210内，该外部通道210作为第二圆柱形构件与内部通道205同轴布置。以下参考各种实施方案提供了opi 200的另外的细节。
104.图3公开了用于基于所选择的亲和力确定和分离药物候选物的实施方案。在300处，将多种药物候选物作为溶液引入测定容器内。在310处，将颗粒插入溶液中，其中颗粒包括可操作以基于所选择的亲和力与一种或多种化合物结合的表面处理。然后，在320处，所述化合物中的一种或多种与颗粒结合。在实施方案中，底物表面可以包含固相微萃取(spme)纤维，其可以含有具有结合亲和力的包埋蛋白质。底物表面可以是被配置成保持蛋白质的任何材料，并且可以包括各种实例，诸如网状材料或叶片状表面或reed。在其他实施方案中，如以下所讨论的，表面处理可以包括磁性材料，诸如珠粒。
105.然后在330处，将具有结合的一种或多种化合物的颗粒从溶液中取出。在340处，将该一种或多种化合物与颗粒分离。在350处，用流动的有机溶剂在opi 200的开放端口215处捕获分离的一种或多种化合物。在360处，将溶剂和在opi 200的开放端口215处捕获的一种或多种化合物输送至电离设备，诸如ms/ms130。然后，如本领域中已知的，在370处，将该一种或多种化合物在ms/ms130内电离。在其他方面，可以在ms/ms分析之前排除色谱法，使得在制备测定混合物后立即通过ms分析苗头化合物组。
106.在实施方案中，提供了用于基于所选择的亲和力确定和分离化合物的方法，如参照图5中所示出的系统在图4中所述的。在400处，例如使用珠粒磁性地附接至其上的电磁取样设备或探针，将溶液中的多种药物分子候选物(u和d)和磁性珠粒(b)引入样品容器100，使得具有亲和力的药物分子候选物(d)与磁性珠粒结合。在410处，例如使用电磁取样设备或探针，将珠粒(b)和结合的药物分子候选物(d)从样品容器100转移到洗涤容器110，由此经由洗涤去除未结合的药物分子(u)，同时珠粒(b)和结合的药物分子候选物(d)经由来自磁体115的磁场被保留在容器中。在420处，例如使用电磁取样设备或探针，将具有结合的药物分子候选物的洗涤珠粒从洗涤容器中取出并且引入分离容器120中，在此处使用有机溶剂将药物分子候选物(d)从珠粒释放。在430处，将药物分子候选物(d)经由磁体125与磁性珠粒(b)分离。在440处，将药物分子候选物(d)从分离容器120声波喷射到opi 200中。在opi 200内，捕获流体通过这两个圆柱形构件之间的环形空间220朝向尖端215行进，并且然后通过内部圆柱体远离尖端行进，如图中界定流体路径的箭头所描绘的。捕获流体有效地消除了清洁样品的需要。在450处，溶剂和所喷射的药物候选物(d)从尖端215流向ms电离源530。任选地，或者如果需要的话，可以使用差示迁移率谱仪(dms)或ms技术(例如ms-ms中的裂解模式等)将药物分子候选物(d)与未结合的药物分子(u)分离。
107.在另外的实施方案中，提供了用于基于所选择的亲和力确定和分离化合物的方法，如参照图7中所示出的系统在图6中所述的。在600处，例如使用珠粒磁性地附接至其上的电磁取样设备或探针，将溶液中的多种药物分子候选物(u和d)和磁性珠粒(b)引入样品容器100，使得具有亲和力的药物分子候选物(d)与磁性珠粒结合。在610处，例如使用电磁取样设备或探针，将珠粒(b)和结合的药物分子候选物(d)从样品容器100转移到洗涤容器110，由此经由洗涤去除未结合的药物分子(u)，同时珠粒(b)和结合的药物分子候选物(d)经由来自磁体115的磁场被保留在容器中。在620处，例如使用电磁取样设备或探针，将具有结合的药物分子候选物的洗涤珠粒从洗涤容器中取出并且引入分离容器120中，在此处使用有机溶剂将药物分子候选物(d)从珠粒释放。在630处，将药物分子候选物(d)和珠粒(b)从分离容器120声波喷射到opi 200中。在opi 200内，捕获流体通过这两个圆柱形构件之间的环形空间220朝向尖端215行进，并且然后通过内部圆柱体远离尖端行进，如图中界定流
体路径的箭头所描绘的。捕获流体有效地消除了清洁样品的需要。在640处，溶剂、珠粒(b)和药物候选物(d)从尖端215流向串行(in-line)捕集器730，在此处珠粒(b)被捕获(640)。在650处，溶剂和所喷射的药物候选物(d)从捕集器730流向ms电离源530。可替代地，不将药物分子候选物(d)与分离容器120中的珠粒分离，而是可以将药物分子候选物(d)与opi 200内的珠粒分离，在此处捕获流体是可操作以释放药物分子候选物(d)与珠粒之间的键的溶剂。
108.对于630处的声波喷射，优选的是，例如通过在分配之前机械搅拌分离容器120或通过将电磁混合器集成在声波分配系统内，将药物分子候选物(d)均匀地悬浮在分离容器120内的样品溶液中。
109.在另外的实施方案中，提供了用于基于所选择的亲和力确定和分离化合物的方法，如参照图9中所示出的系统在图8中所述的。在800处，例如使用珠粒磁性地附接至其的电磁取样设备或探针，将溶液中的多种药物分子候选物(u和d)和磁性珠粒(b)引入样品容器100，使得具有亲和力的药物分子候选物(d)与磁性珠粒结合。在810处，将未被洗涤的药物分子候选物(d)和珠粒(b)从样品容器100声波喷射到opi 200中。在opi 200内，捕获流体通过这两个圆柱形构件之间的环形空间220朝向尖端215行进，并且然后通过内部圆柱体远离尖端行进，如图中界定流体路径的箭头所描绘的。捕获流体(例如水)有效地消除了清洁样品的需要。在820处，溶剂、珠粒(b)和未被洗涤的药物候选物(d)从尖端215流向串行捕集器730，在此处珠粒(b)被捕获(640)并且洗涤药物候选物(d)以去除未结合的药物分子(u)。在830处，将捕获流体(水)流经由阀900切换至有机溶剂流，以将药物分子候选物(d)与珠粒(b)分离。在840处，溶剂和所选择的药物候选物(d)经由输送管线910从捕集器730流向ms电离源530。
110.考虑捕集器730的不同实施方案，包括过滤器或尺寸捕集器，或可以时常更换的永磁体，或可以被通电以捕获磁性珠粒(b)并且然后例如在清洁循环期间断电以释放任何捕获的磁性珠粒的电磁体。如图10中所示，当电磁体被断电以释放捕获的珠粒时，转移管线900可以包括一个或多个阀920以将捕获流体流重新引导至废物容器，并且从而避免在清洁循环期间将磁性珠粒释放到电离源530中。
111.在图7的系统中，捕集器730可以是在opi 200的尖端215处的磁性捕集器(即围绕第一圆柱形构件205和/或第二圆柱形构件210中的一者或两者的电磁体)，并且其中可以用基于溶剂的捕获流体进行清除循环以在经洗涤的药物候选物已经被传送至ms电离源530之后从捕集器中释放珠粒。
112.在另一实施方案中，可以将捕集器730设置在电离源530处，其中珠粒轨迹由于珠粒比离子重得多而在ms电离源530的入口处与离子分离，用于与图5和图9中所示出的系统一起使用。
113.在另外的实施方案中，捕集器730可以是在图9中所示出的系统的输送管线900上的串行磁性捕集器。所考虑的是，串行磁性捕集器可以是输送管线900的可更换部分，其具有足够的磁场以捕获输送管线内的磁性珠粒(b)。
114.还可以考虑，在采用与珠粒(b)分离的药物分子候选物(d)的声波喷射的图5的系统中，可以包括永磁体防护阱以保护电离源530，并且ms形成磁性珠粒从容器120的无意喷射。
115.尽管图5和图7中所描绘的系统讨论了单独的样品、洗涤和分离容器100、110和120的使用，但考虑样品制备可以在单个容器或多个容器中进行。
116.在图4
–
10中阐述的每个实施方案中，作为将具有亲和力的化合物药物分子引导至磁性颗粒(b)的固相表面的替代方案，考虑可以在蛋白质-药物在游离溶液中整合之后(例如在400、600、800之后)添加颗粒(b)，并且所述颗粒(b)用于剔除蛋白质-药物复合物而不是预先固定化在磁性颗粒(b)上的蛋白质。
117.图11作为类似于图3的一般实施方案而提供。图11的实施方案提供了一种方法，其中顺序操作以一般方式被分组在一起，并且每个操作可以表示以任何顺序进行的一个或多个操作。特别地，制备测定混合物和转移样品被示出为单个操作，其中将苗头化合物组与某些测定组分分离并且以几种不同布置中的任一种转移到质谱仪。因此，图11中示出在亲和力测定之后和质量分析之前，可以在许多不同的顺序布置和位置中进行在测定中被确定的苗头化合物组的制备和转移，如本文所公开的。因此，由图11所示出的实施方案可以包括由图3-10所公开的每个实施方案。
118.结合测定可以通过将一种或多种所选择的化合物和磁性珠粒引入样品孔中来创建。磁性珠粒包括指示期望的结合活性的靶标化合物的结合位点。测定容器准备模块可操作以用于将所选择的一种或多种化合物引入样品板的每个样品孔中。测定模块可以引入磁性珠粒，这些磁性珠粒包括与暴露于磁性珠粒的化合物的期望结合活性对应的结合位点。在一些实施方案中，测定容器准备模块和测定模块可以包含单独的机制。在一些实施方案中，测定容器准备模块和测定模块可以包含统一的系统。
119.对应于引入该样品孔的该一种或多种化合物的样品信息与样品孔相关。样品信息可以包括例如指示一种或多种化合物、试剂、或与样品孔的分析相关的其他信息中的每一种的一种或多种标识符。关联可以由与测定容器准备模块和/或测定模块通信的控制器生成，或者可以源自测定容器准备模块和/或测定模块，并且被存储在由系统的其他模块可访问的存储器位置。
120.可以对每个样品孔中的溶液进行操作以将任何结合的化合物
–
磁性珠粒组分与溶液中的剩余未结合的化合物分离。例如，测定模块可以施加磁力以隔离和保留样品孔内的结合的化合物
–
磁性珠粒组分，并且将溶液中的任何未结合的组分转移出。转移可以例如通过抽吸或其他液体转移操作诸如重力流、抽吸、呼出(expiration)、或其他已知手段发生。可替代地，例如，测定模块可以施加磁力以从含有任何未结合的组分的溶液中捕获和取出结合的化合物-磁性珠粒组分。在该情况下，转移可以例如通过将探针引入溶液中发生，这可操作以施加磁力以捕获磁性珠粒并且将所捕获的磁性珠粒保留至探针，同时将探针从样品孔中的溶液中取出。
121.在任一情况下，使分离的结合的化合物
–
珠粒组分经受洗涤步骤，该洗涤步骤释放并处理任何未结合的组分以产生在结合的化合物从珠粒化合物被释放并且经受分析之前不含任何未结合的组分的经洗涤的结合的化合物
–
磁性珠粒组分。
122.作为实例，可以应用许多不同的洗涤步骤，包括如以上所描述的步骤。如果珠粒在样品孔内被隔离，则测定模块可以引入并提取洗涤溶液以去除任何剩余的未结合的组分。如果从样品孔中取出珠粒，则测定模块可以将结合的化合物
–
磁性珠粒组分转移到洗涤步骤，该洗涤步骤在将经洗涤的结合的化合物
–
磁性珠粒组分引入清洁的样品孔之前洗去任
何未结合的组分。可以将经洗涤的结合的化合物
–
磁性珠粒组分在引入开放端口接口之前在样品孔内分离，或者可以从样品孔喷射到开放端口接口中，用于通过流经开放端口接口的捕获流体进行分离。
123.无论以上所描述的释放机制如何，结合的化合物都被从质谱仪的开放端口接口转移到离子源，用于电离和随后通过质谱仪进行质量分析。以该方式，可以通过测定容器准备模块和/或测定模块制备微量滴定样品孔板，并且可以选择性地将引入样品孔的与磁性珠粒的结合位点结合的化合物引入质谱仪中用于质量分析，以产生与该样品孔相关的质量分析结果。
124.所描述的系统进一步提供了通过分析模块来确定与磁性珠粒的结合位点结合的化合物，该分析模块将来自每个样品孔的质量分析结果与和该样品孔相关的样品信息相关联。相关性可以基于相关联的样品孔信息和该样品孔的样品信息，由质量分析结果确定出哪些化合物出现在每个质谱中。因此，该系统可操作用于确定哪些化合物组被引入特定样品孔中，以及通过质量分析确定了哪种或哪些化合物，即结合的化合物。
125.图12a中示出了本发明的代表性系统。正如本文所参照的所有图，其中同样的部分由同样的数字标记，图12a不是按比例绘制的，并且某些尺寸被夸大用于清楚呈现。在图12a中，声波液滴喷射(ade)设备总体上以11示出，将液滴49朝向总体上以51示出的连续流取样探针(本文中称为开放端口接口(opi))喷射并且进入其取样尖端53。
126.声波液滴喷射设备11包括至少一个贮存器，其中第一贮存器以13示出，以及任选的第二贮存器31。在一些实施方案中，可以提供另外的多个贮存器。每个贮存器被配置成容纳具有流体表面的流体样品，例如，具有分别以17和19示出的流体表面的第一流体样品14和第二流体样品16。当使用多于一个的贮存器时，如图12a中所示，贮存器优选地基本上相同且在声学上基本上不可区分，尽管相同的构造不是必须的。
127.ade包含声波喷射器33，其包括声辐射发生器35和用于使在流体样品内、流体表面附近的焦点47处所产生的声辐射聚焦的聚焦装置37。如图12a中所示，聚焦装置37可以包含具有用于使声辐射聚焦的凹表面39的单个固体件，但是聚焦装置可以以如以下所描述的其他方式构造。因此，声波喷射器33被适配成产生并聚焦声辐射，以便当声学耦合至贮存器13和15并且因此分别耦合至流体14和16时，从流体表面17和19中的每个喷射流体的液滴。根据设备的期望性能，声辐射发生器35和聚焦装置37可以充当由单个控制器控制的单个单元，或者它们可以被独立地控制。
128.声波液滴喷射器33可以与每个贮存器的外表面直接接触或间接接触。在直接接触的情况下，为了将喷射器声学耦合至贮存器，优选的是直接接触是完全共形的以确保有效的声能传递。即，喷射器和贮存器应当具有适配用于配合接触的相应表面。因此，如果通过聚焦装置在喷射器与贮存器之间实现声学耦合，则期望贮存器具有与聚焦装置的表面轮廓相对应的外表面。在无共形接触的情况下，声能传输的效率和准确性可能受到损害。另外，由于许多聚焦装置具有曲面，因此直接接触方法可能需要使用具有专门形成的反向表面的贮存器。
129.最优地，通过间接接触在喷射器与每个贮存器之间实现声学耦合，如图12a中所示。在图中，声学耦合介质41被置于喷射器33与贮存器13的基部25之间，其中喷射器和贮存器彼此位于预定距离处。声学耦合介质可以是声学耦合流体，优选地与声学聚焦装置37和
贮存器的底面两者共形接触的声学上均匀的材料。另外，重要的是确保流体介质基本上不含具有与流体介质本身不同的声学特性的材料。如所示的，第一贮存器13在声学上耦合至声学聚焦装置37，使得由声辐射发生器所产生的声波被聚焦装置37引导到声学耦合介质41中，然后其将声辐射传输到贮存器13中。
130.在操作中，设备的贮存器13和任选的贮存器15分别填充有第一和第二流体样品14和16，如图12a中所示。声波喷射器33被定位在贮存器13的正下方，其中借助于声学耦合介质41在喷射器与贮存器之间提供声学耦合。最初，声学喷射器被直接定位在opi 51的取样尖端53的下方，使得取样尖端面向贮存器13中的流体样品14的表面17。一旦喷射器33和贮存器13在取样尖端53下方正确对准，声辐射发生器35就被激活以产生声辐射，该声辐射被聚焦装置37引导至第一贮存器的流体表面17附近的焦点47。因此，将液滴49从流体表面17朝向opi 51的取样尖端53处的液体边界50喷射并且进入液体边界50，在此处其与流动探针53中的溶剂合并。
131.取样尖端53处的液体边界50的轮廓可以从延伸超出取样尖端53至向内突出到opi 51中变化，如以下关于图2更详细地描述的。在多贮存器系统中，贮存器单元(未示出)，例如多孔板或管架，随后可以相对于声波喷射器被重新定位，使得另一贮存器与喷射器对齐，并且可以喷射下一个流体样品的液滴。流动探针中的溶剂连续循环通过探针，使液滴喷射事件之间的“残留”最小化或甚至消除。流体样品14和16是期望转移到分析仪器的任何流体的样品，其中术语“流体”如本文之前所定义。
132.opi 51的结构也示出于图12a中。可以按原样或以修改形式使用任何数量的可商购连续流取样探针，如本领域中熟知的那样，所有这些探针都根据基本上相同的原理操作。如图12a中可以看到的，opi51的取样尖端53与贮存器13中的流体表面17间隔开，其间具有间隙55。间隙55可以是空气间隙或惰性气体的间隙，或者其可以包含一些其他气态材料；没有液桥将取样尖端53连接至贮存器13中的流体14。opi 51包括用于从溶剂源接收溶剂的溶剂入口57和用于将溶剂流从溶剂入口57输送至取样尖端53的溶剂输送毛细管59，在取样尖端53处含分析物的流体样品14的喷射液滴49与溶剂合并以形成分析物-溶剂稀释物。溶剂泵(未示出)被可操作地连接至溶剂入口57并且与之流体连通，以便控制溶剂流进入溶剂输送毛细管的速率并且因此也控制溶剂输送毛细管59内的溶剂流的速率。
133.opi 51内的流体流通过由内部毛细管73所提供的样品输送毛细管61向样品出口63运载分析物-溶剂稀释物，用于随后转移到分析仪器。可以提供取样泵(未示出)，其被可操作地连接至样品输送毛细管61并且与之流体连通，以控制来自出口63的输出速率。在优选实施方案中，使用正排量泵作为溶剂泵，例如，蠕动泵，并且使用吸入式雾化系统代替取样泵，使得分析物-溶剂稀释物通过文丘里效应被从样品出口63抽出，该文丘里效应由经由气体入口67从雾化气体源65引入的雾化气体的流动(在图12a中以简化形式示出，就吸入式雾化器的特征而言，本领域中是公知的)引起，因为其在样品出口63的外部流动。然后，分析物-溶剂稀释物流被雾化气体通过样品出口63并且与离开样品输送毛细管61的流体合并时所产生的压降向上抽吸通过样品输送毛细管61。使用气体压力调节器来控制经由气体入口67进入系统中的气体流的速率。以优选的方式，雾化气体以鞘流型方式在样品出口63处或附近流过样品输送毛细管61的外部，当分析物-溶剂稀释物流过样品出口63并在与雾化器气体混合时在样品出口处引起抽吸时，该鞘流型方式使分析物-溶剂稀释物通过样品输送
毛细管61。
134.溶剂输送毛细管59和样品输送毛细管61由基本上同轴设置在其中的外部毛细管71和内部毛细管73提供，其中内部毛细管73界定样品输送毛细管，并且内部毛细管73与外部毛细管71之间的环形空间界定溶剂输送毛细管59。
135.系统还可以包括耦合至外部毛细管71和内部毛细管73的调节器75。调节器75可以被适配用于相对于彼此纵向移动外部毛细管尖端77和内部毛细管尖端79。调节器75可以是能够相对于内部毛细管73移动外部毛细管71的任何设备。示例性调节器75可以是马达，包括但不限于电动马达(例如，ac马达、dc马达、静电马达、伺服马达等)、液压马达、气动马达、平移载台(translational stage)及其组合。如本文所使用的，“纵向”是指贯穿探针51的长度的轴线，并且内部和外部毛细管73、71可以围绕探针51的纵向轴线同轴地布置，如图1中所示。
136.另外，如图12a中所示，为了稳定性和易于操作，通常可以使opi 51固定在近似圆柱形的支架81内。
137.图12b示意性地描绘了根据申请人关于电离和质量分析在取样探针51的开放端内接收的分析物的教导的各方面的示例性系统110的实施方案，系统110包括声波液滴注射设备11，其被配置成将液滴49从贮存器注入取样探针51的开放端中。如图12b中所示，示例性系统110通常包括与雾化器辅助离子源160流体连通的取样探针51(例如，开放端口探针)，用于将含有一种或多种样品分析物的液体(例如，经由电喷雾电极164)排放到电离室112中，以及与电离室112流体连通的质量分析仪170，用于下游处理和/或检测由离子源160所产生的离子。流体处理系统140(例如，包括一个或多个泵143和一个或多个导管)提供液体从溶剂贮存器150至取样探针51以及从取样探针51至离子源160的流动。例如，如图12b中所示，溶剂贮存器150(例如，含有液体、解吸溶剂)可以经由供应导管被流体耦合至取样探针51，可以将液体经过该供应导管由泵143(例如，往复泵，正排量泵诸如旋转泵、齿轮泵、柱塞泵、活塞泵、蠕动泵、隔膜泵，或其他泵诸如重力泵、脉冲泵、气动泵、电动泵和离心泵)以选定的容积速率递送，所有这些都作为非限制性实例。如以下详细讨论的，液体流入和流出取样探针51发生在开放端处可接近的样品空间内，使得一个或多个液滴可以在样品尖端53处被引入液体边界50中，并且随后被递送至离子源160。如所示出的，系统110包括声波液滴注射设备11，其被配置成产生声能，该声能被施加至被贮存器(如图12a中所描绘的)所容纳的液体，这导致一个或多个液滴49从贮存器被喷射到取样探针51的开放端。可以将控制器180可操作地耦合至声波液滴注射设备11，并且可以被配置成操作声波液滴注射设备11的任何方面(例如，聚焦装置、声辐射发生器、用于将一个或多个贮存器定位成与声辐射发生器对准的自动化装置等)，以便将液滴基本上连续地注入取样探针51中或以其他方式在本文中讨论，或通过非限制性实例的方式用于实验方案的选定部分。
138.如图12b中所示，示例性离子源160可以包括加压气体(例如氮气、空气、或稀有气体)源65，其供应围绕电喷雾电极164的出口端的高速雾化气体流并且与从其排出的流体相互作用，以例如经由高速雾化流和液体样品(例如，分析物-溶剂稀释物)射流的相互作用来增强样品羽流的形成和羽流内的离子释放，用于通过114b和116b进行取样。雾化器气体可以以多种流速(例如，在约0.1l/min至约20l/min的范围内)供应，这也可以在控制器180的影响下(例如，经由打开和/或关闭阀163)进行控制。根据本教导的各种方面，应理解，雾化
器气体的流速可以被调节(例如，在控制器180的影响下)，使得取样探针51内的液体流速可以例如基于由雾化器气体和分析物-溶剂稀释物(当其正在被从电喷雾电极164排出(例如，由于文丘里效应))的相互作用所产生的抽吸(suction/aspiration)力来调节。
139.在所描绘的实施方案中，可以将电离室112维持在大气压力下，尽管在一些实施方案中，可以将电离室112抽空至低于大气压力的压力。电离室112(当分析物-溶剂稀释物被从电喷雾电极164排出时，分析物可以在其内被电离)通过具有幕板孔114b的板114a与气幕室114分隔开。如所示出的，容纳质量分析仪170的真空室116通过具有真空室取样孔口116b的板116a与幕室114分开。可以通过经过一个或多个真空泵端口118抽空来将幕室114和真空室116维持在一个或多个所选择的压力(例如，相同或不同的亚大气压，低于电离室的压力)下。
140.本领域技术人员根据本文的教导还应理解，质量分析仪170可以具有多种配置。通常，质量分析仪170被配置成处理(例如，过滤、分类、解离、检测等)由离子源160所产生的样品离子。作为非限制性实例，质量分析仪170可以是三重四极杆质谱仪、或本领域中已知并根据本文教导进行修改的任何其他质量分析仪。可以根据本文所公开的系统、设备和方法的各种方面进行修改的其他非限制性示例性质谱仪系统可以见于例如由james w.hager和j.c.yves le blanc撰写并且发表在rapid communications in mass spectrometry(2003；17:1056-1064)中的标题为“product ion scanning using a q-q-q
linear ion trap(q)mass spectrometer”的文章和标题为“collision cell for mass spectrometer”的美国专利第7,923,681号中，其特此通过引用以其整体并入。其他配置，包括但不限于本文所描述的配置和本领域技术人员已知的其他配置，也可以与本文所公开的系统、设备和方法结合利用。例如，其他合适的质谱仪包括单四极杆、三重四极杆、tof、阱和混合分析仪。还应进一步理解，系统110中可以包括任何数量的另外的元件，包括例如离子迁移率谱仪(例如，差示迁移率谱仪)，该离子迁移率谱仪被设置在电离室112与质量分析仪170之间，并且被配置成基于它们通过高场和低场中的漂移气体的迁移率而不是它们的质荷比来分离离子。另外，应理解，质量分析仪170可以包含检测器，该检测器可以检测穿过分析仪170的离子并且可以例如供应指示每秒所检测到的离子数量的信号。