用于CART细胞的抗原特异性激活和扩增的人工靶标的制作方法

过继细胞疗法，如嵌合抗原受体(car)t细胞(其中t细胞效应子功能，如细胞毒性被重新定向针对癌症细胞)，是迅速发展的免疫治疗领域中有前途的新治疗选择。car t细胞的功能能力评估是在该疗法的研发和商业化期间进行的，例如用于选择car结合物或car构建体，用于car t细胞产品的质量控制，以及用于对被治疗的患者中持续存在的car t细胞的离体分析。进行这种评估的一种方法是将car t细胞与表达car靶标的靶细胞共培养，并在这些细胞存在的情况下测量car-t细胞的激活。

背景技术：

1、使用活的靶细胞进行体外功能测定存在几个主要的缺点。它们包括由所使用的靶细胞源引入的高变异性、逐批遗传漂变，以及在储存和细胞培养期间的处理变化。这些代表了用于car t细胞功能表征的生物测定标准化的主要障碍。因此，用能够诱导car t细胞激活的合成人工试剂代替活的靶细胞将对标准化和一致性具有重大好处。

2、wu等人(cellular&molecular immunology 2020，17:600-612)以及lindner等人(sci.adv.2020；6:eaaz3223)在其综述中描述了car t细胞与靶细胞相互作用时car信号传导中的重要因素：从受体与抗原的接触和近端信号传导到免疫突触的形成以及晚期信号传导结果。这些论文中需要并提到了几个信号。对于本发明，论文中所列的信号被减少为所需的两个信号：足够数量的受体和抗原之间的接触以及与共刺激信号(如cd28)的信号传导。此外，这两篇论文还描述了为了有效激活car t细胞，需要聚集大量的car。

3、还已知颗粒(例如，二氧化硅、聚苯乙烯、水凝胶、pmma等)可以与抗体偶联，并用于各种生物应用(例如，nano res(2008)1:99 115)。为此，以二氧化硅颗粒为例，抗体偶联颗粒(https://www.cd-bioparticles.com/product/silica-particles-list-168.html)已经可商购获得。例如，作为用于抗体偶联表面的微孔板和载玻片也是如此，其可从schott和polyan获得，作为用于固定各种生物分子的官能化微孔板和载玻片(例如，https://www.schott.com/nexterion/english/products/functional-coatings/3d-polymer-coating.html和https://www.poly-an.de/microplates-cell-culture-consumables/microplate-surfaces)。但是，这些材料均从未被用于选择性靶向和激活car t细胞或其他car细胞(例如，car nk细胞、car巨噬细胞)。

4、dirar等人(plos one 15(9):e0238819)证明了car t细胞可以通过用其抗独特型抗体官能化的微米结构化的表面来激活。然而，尽管可以通过显微镜观察到早期激活事件和脱粒，但所达到的激活水平从未被证明达到了生物学相关的水平。此外，他们没有使用抗cd28作为共刺激信号。他们使用微接触印刷法来生成具有微米大小的抗独特型抗体岛的表面。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的是提供一种用于激活car t细胞的更可靠的、生物学相关的方法。该目的可以通过以下方法来实现，该方法用于激活样品中具有至少一种嵌合抗原结合受体的car细胞，通过将样品与至少一种底物一起孵育，所述底物在其表面上被提供有至少一种抗car独特型抗体和/或选自由cd19、cd20、cd22、bcma、cd33、msln、cd123、her2、gd2、egfr、psma、muc1、cd318、tspan8、cd66c、cea、cla、cd276、folr1、clec12a、cll-1和cd371组成的组的至少一种抗原以及选自由cd28、cd2、cd6、cd26、cd53和lfa-1组成的组的至少一种共刺激分子，其特征在于，所述样品在悬浮液中与所述至少一种底物一起孵育，从而激活car t细胞以表达选自由mrna、效应分子或细胞表面激活标记物组成的组的标记物。

2、进一步地，本发明涉及通过组合以下特征能够以抗原依赖性方式激活并优选扩增car细胞的人工材料(底物)：

3、(1)用于结合空间可用的抗原(例如抗独特型抗体或car抗原)，所述抗原以高密度共价结合在颗粒表面或表面上。该抗原可以直接或以间接的方式(例如，通过抗生物素和生物素化的抗原，或通过抗硫胺素和硫胺化剂)与表面结合。

4、(2)共刺激分子结合实体(例如抗cd28抗体)，与抗原一起结合在颗粒或表面上，或者以可溶性形式添加。

5、本发明的另一个目的是提供一种用于激活car细胞的底物，其特征在于，至少一种所述底物在其表面被提供有至少一种抗car独特型抗体和/或选自由cd19、cd20、cd22、bcma、cd33、msln、cd123、her2、gd2、egfr、psma、muc1、cd318、tspan8、cd66c、cea、cla、cd276、folr1、clec12a、cll-1和cd371组成的组的至少一种抗原以及选自由cd28、cd2、cd6、cd26、cd53和lfa-1组成的组的至少一种共刺激分子。

6、这些材料的应用可以用作靶标，以定性或定量地评估由car的激活触发的任何生物学事件，例如在制造的car t细胞批次的质量控制中、效力测定、激活用相关标记物的研究、分选被激活的细胞或用于分析或治疗应用的car t细胞的抗原特异性扩增。

7、car抗原优选地选自由液体肿瘤抗原和实体肿瘤抗原组成的组。本发明的方法和本发明的底物适用于所有种类的car细胞，但特别适用于car t细胞、car nk细胞和/或car巨噬细胞。

技术特征：

1.一种用于激活样品中具有至少一种嵌合抗原结合受体的car细胞的方法，所述方法通过将样品与至少一种底物一起孵育，所述底物在其表面上被提供有至少一种抗car独特型抗体和/或选自由cd19、cd20、cd22、bcma、cd33、msln、cd123、her2、gd2、egfr、psma、muc1、cd318、tspan8、cd66c、cea、cla、cd276、folr1、clec12a、cll-1和cd371组成的组的至少一种抗原，以及被提供有选自由cd28、cd2、cd6、cd26、cd53和lfa-1组成的组的至少一种共刺激分子，其特征在于，所述样品在悬浮液中与所述至少一种底物一起孵育，从而激活car t细胞以表达选自由mrna、效应分子或细胞表面激活标记物组成的组的标记物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提供所述底物作为悬浮液中的颗粒，其中所述颗粒的平均直径为至少0.4μm。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品与悬浮液中的颗粒一起孵育，从而激活car细胞以分泌蛋白质并检测所分泌的蛋白质。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，通过成像、流式细胞术或rt-pcr/rnaseq来检测car细胞的激活。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗car独特型抗体和/或选自由cd19、cd20、cd22、bcma、cd33、msln、cd123、her2、gd2、egfr、psma、muc1、cd318、tspan8、cd66c、cea、cla、cd276、folr1、clec12a、cll-1和cd371组成的组的至少一种抗原以及选自由cd28、cd2、cd6、cd26、cd53和lfa-1组成的组的至少一种共刺激分子被提供在至少两种不同底物的表面上。

6.一种用于激活car细胞的底物，其特征在于，至少一种所述底物在其表面被提供有至少一种抗car独特型抗体和/或选自由cd19、cd20、cd22、bcma、cd33、msln、cd123、her2、gd2、egfr、psma、muc1、cd318、tspan8、cd66c、cea、cla、cd276、folr1、clec12a、cll-1和cd371组成的组的至少一种抗原以及被提供有选自由cd28、cd2、cd6、cd26、cd53和lfa-1组成的组的至少一种共刺激分子。

7.根据权利要求6所述的底物，其特征在于，提供所述底物作为平均直径为至少0.4μm的颗粒。

8.根据权利要求6或7所述的底物，其特征在于，所述颗粒包括二氧化硅、聚苯乙烯、聚烯烃、多糖、聚酯、聚丙烯酸酯、聚乳酸和/或氧化铁。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的底物，其特征在于，所述至少一种抗car独特型抗体和/或所述至少一种抗原和/或所述至少一种共刺激分子通过抗生物素抗体、抗硫胺素抗体或通过链霉亲和素与所述底物结合。

10.根据权利要求6至8中任一项所述的底物，其特征在于，至少一种抗car独特型抗体或至少一种抗原和至少一种共刺激分子通过引物分子与所述底物结合。

11.根据权利要求9所述的底物，其特征在于，所述引物分子为smcc(反式-4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)。

12.根据权利要求6至8中任一项所述的底物，其特征在于，所述至少一种抗car独特型抗体和/或选自由cd19、cd20、cd22、bcma、cd33、msln、cd123、her2、gd2、egfr、psma、muc1、cd318、tspan8、cd66c、cea、cla、cd276、folr1、clec12a、cll-1和cd371组成的组的至少一种抗原以及选自由cd28、cd2、cd6、cd26、cd53和lfa-1组成的组的至少一种共刺激分子被提供在至少两种不同底物的表面上。

技术总结
本发明涉及一种用于激活样品中具有至少一种嵌合抗原结合受体的CAR细胞的方法，该方法通过将样品与至少一种底物一起孵育，所述底物在其表面上被提供有至少一种抗CAR独特型抗体和/或选自由CD19、CD20、CD22、BCMA、CD33、MSLN、CD123、HER2、GD2、EGFR、PSMA、MUC1、CD318、TSPAN8、CD66c、CEA、CLA、CD276、FolR1、CLEC12A、CLL‑1和CD371组成的组的至少一种抗原，以及具有选自由CD28、CD2、CD6、CD26、CD53和LFA‑1组成的组的至少一种共刺激分子，其特征在于，所述样品在悬浮液中与至少一种底物一起孵育，从而激活CAR T细胞以表达选自由mRNA、效应分子或细胞表面激活标记物组成的组的标记物。

技术研发人员：M·罗斯坎普,C·埃瓦里斯托,C·朗格尔,A·杜达,A·里希特,J·福尔巴赫
受保护的技术使用者：美天施生物科技有限两合公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16