通过泛素连接酶募集实现的受体消除

背景技术：

1、泛素(ub)是一种高度保守的76个氨基酸的多肽，其翻译后连接将多种真核蛋白质引向多种命运和功能。泛素化过程包括靶向26s蛋白酶体依赖性降解的蛋白质、内化和溶酶体靶向、蛋白质相互作用的调节、亚细胞分布的改变、转录的调控、dna修复和跨膜信号传导级联的调节。蛋白质泛素化与几乎每个细胞过程都有联系，涉及许多细胞疾病，并且涉及泛素系统的过程的失调具有有害的细胞后果。因此，e3与许多病理生理学状况有关，这使它们成为有吸引力的治疗靶标。

2、蛋白质泛素化通常涉及泛素与蛋白质底物的共价连接。根据泛素连接，无论是单泛素、寡泛素还是多泛素，蛋白质底物可能随后通过泛素-蛋白酶体途径(26s蛋白酶体)、溶酶体降解途径来降解，或者蛋白质功能以依赖于泛素但不依赖于降解的方式来调节，并且游离的泛素被再循环。

3、通过ub和ubl进行的蛋白质翻译后修饰调控生物学的几乎每个方面，并能够对蛋白质稳定性和活性进行复杂和可逆的调控。由于在细胞生物学中的广泛作用，ub途径酶的功能障碍导致多种人疾病。泛素与许多已知底物蛋白质的连接被认为发生在由三类蛋白质依次进行的一系列酶促反应中：泛素活化酶(e1)以atp依赖性方式活化泛素，以在ub的羧基末端gly和e1的cys残基之间形成硫酯键；然后，将活化的ub转移到泛素缀合酶(e2或ubc)，以形成另一个硫酯键；并且泛素连接酶(e3)以底物特异性方式催化或促进ub从e2转移到底物蛋白质的lys(k)残基，以形成异肽键。

4、已知e3酶在泛素化过程中提供底物特异性。人含有一种形式的e1酶、超过30种e2酶和超过350种e3酶。基于e3催化核心结构域的存在，e3酶通常分为三个家族：与e6ap羧基末端的同源性(hect)、基因(ring)指(rnf)和u-box蛋白质家族。从e3转移到底物的机制取决于所涉及的e3连接酶的具体类别。这些连接酶包括超过500种不同的蛋白质，并根据其e3功能活性的结构要素被分为多个类别。e3连接酶分为两大类：含有活性位点半胱氨酸的hect连接酶，其用于在底物转移前接受ub；以及ring e3连接酶，其含有充当支架的锌指样结构域，使ub直接从e2酶转移到底物。rbr(ring型)是e3 ub连接酶的亚类，被认为是ring/hect杂合体，其类似于ring连接酶，配位锌并结合e2，而且也含有类似于hect连接酶的活性位点半胱氨酸。具体地，hect和ring连接酶都将活化的ub从硫酯转移到底物上赖氨酸残基的8-氨基酸基团；然而，hect连接酶具有活性位点半胱氨酸，其与ub形成中间硫酯键，而ring连接酶充当支架以允许ub从e2直接转移到底物。跨膜e3连接酶家族是不同的ring e3ub连接酶的另一个亚类，至少由三个结构域，即胞外结构域(ecd)、跨膜结构域(tm)和ringh2指(rnf)结构域限定，并且由大约50个成员组成，包括若干个亚家族。人跨膜rnf e3泛素连接酶家族可进一步分组为结构相关的家族，包括含有ring结构域的蛋白质(25)、含有三联基序的蛋白质(trim；2)、pa-tm-ring(11)、ring(rbr；5)和膜相关ring-ch(march；9)家族之间的ring。pa-tm-ring家族包括以下11个成员：grail(rnf128)、goliath(rnf130)rnf133、rnf148、rnf149、rnf150、godzilla(rnf167)、rnf13、rnf43、znrf3和znrf4。在酵母、后生动物和植物的受体和肽酶中也发现了胞外结构域或腔内pa结构域。pa结构域被提出充当蛋白质-蛋白质相互作用模块。

5、本发明的组合物和方法解决了本领域中与这些天然存在的系统和方法相关的需求。

技术实现思路

1、本文提供了通过e3泛素连接酶募集实现的受体消除(receptor elimination bye3 ubiquitin ligase recruitment,reulr)构建体和相关组合物。此类构建体通常包含对e3泛素连接酶具有特异性的可变结构域重链抗体(vhh)和对靶蛋白特异具有特异性的vhh，其中e3泛素连接酶和靶蛋白是不同的蛋白质。

2、本文还提供了reulr构建体组合物，其中reulr构建体由下式定义：

3、a.(vhht)a-l-(vhhe3)b；或者

4、b.

5、c.(vhht)a-l-(vhhe3)b-l-(vhht)a；

6、d.(vhhe3)a-l-(vhht)b-l-(vhhe3)a；或者

7、e.(r-l)z-(vhht)a-l-(vhhe3)b-(l-r)w

8、在定义示例性reulr构建体的这些式中，vhh是对靶蛋白或e3泛素连接酶具有特异性的可变结构域重链抗体；r是vhht或vhhe3；l是接头分子；t是靶蛋白，使得vhh对靶蛋白具有特异性；e3是e3泛素连接酶，使得vhh对e3泛素连接酶具有特异性；a为1或更大；b为1或更大；w是0或1或更大；x是0或1或更大；y是0或1或更大；并且z是0或1或更大。

9、本文还提供了接头分子，其适于以使得对e3泛素连接酶具有特异性的vhh和对靶蛋白具有特异性的vhh各自独立地可用并且能够分别与e3泛素连接酶和靶蛋白结合的方式将对e3泛素连接酶具有特异性的vhh连接至对靶蛋白具有特异性的vhh。

10、在通常包括的实施方案中，reulr构建体还包含对e3泛素连接酶具有特异性的一个或多个另外的vhh和/或对靶蛋白具有特异性的一个或多个另外的vhh。

11、在通常的实施方案中，e3泛素连接酶是ring型e3泛素连接酶。在某些实施方案中，e3泛素连接酶是grail、godzilla和/或goliath。通常，e3泛素连接酶是下列中的一种或多种：rnf133、rnf148、rnf128、rnf149、rnf130、rnf150、rnf122、rnf43、znrf3、znrf4、rnf13、rnf167、amfr、stvn1、rnf170、rnf121、rnf175、rnf139、rnf145、marchf5、vfpl1、rnft1、rnf180、rnf103、rnf182、rnf5、rnf185、rnf19a、rnf19b、rnf144a、rnf144b、rnf217、marchf1、marchf8、marchf2、marchf3、marchf11、marchf4、marchf9、marchf6、nr1h4、rnf126、dcst1、rnf152、rnf186、cgrrf1、mul1、trim13、trim59或rnf112。

12、在通常包括的实施方案中，在式(a)-(e)的reulr构建体中，a为2或更大，b为2或更大，或者其中a为2或更大并且b为2或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，w为1或更大，x为1或更大，y为1或更大，或者z为0或1或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，w为0或更大，x为2或更大，y为2或更大，或者z为0或1或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，w为1或更大，x为1或更大，y为1或更大，并且z为0或1或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，w是0，x是1或更大，y是1或更大，并且z是0或1或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，a为3或更大，b为3或更大，或者其中a为3或更大并且b为3或更大。

13、在通常的实施方案中，靶蛋白是细胞表面蛋白。而且，靶蛋白通常是受体。在通常包括的实施方案中，靶蛋白与细胞增殖性病症或疾病相关。而且，靶蛋白通常与癌症、神经病症、淋巴瘤、白血病、糖尿病、自身免疫病症、病毒感染、细菌感染或寄生虫感染、阿尔茨海默病或心脏病中的一种或多种相关。

14、在进一步包括的实施方案中，提供了编码本文设想的reulr构建体中的每种的分离的核酸。在进一步包括的实施方案中，提供了包含编码本文设想的reulr构建体中的每种的分离的核酸的载体，此类载体通常与表达控制序列可操作地连接。在进一步包括的实施方案中，提供了包含此类载体或编码本文设想的reulr构建体中的每种的分离的核酸的细胞。

15、还提供了包含本文所述的reulr构建体的药物组合物，其通常包含药学上可接受的载剂。

16、本文还设想了包含本公开的reulr构建体的试剂盒。此类试剂盒还可包括包含reulr构建体的药物组合物、载体或宿主细胞。

17、本文还提供了调节在细胞上表达的靶蛋白的方法，其包括使表达靶蛋白的细胞与reulr构建体接触并调节靶蛋白的表达，所述reulr构建体包含对e3泛素连接酶具有特异性的可变结构域重链抗体(vhh)和对靶蛋白具有特异性的vhh。通常，调节包括降解蛋白质的表达或将蛋白质转化为泛素底物募集结构域。本文还提供了用于治疗受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含示例性reulr构建体的药物组合物。

18、在此类方法中，reulr构建体通常由以下式定义：

19、a.(vhht)a-l-(vhhe3)b；或者

20、b.

21、c.(vhht)a-l-(vhhe3)b-l-(vhht)a；

22、d.(vhhe3)a-l-(vhht)b-l-(vhhe3)a；或者

23、e.(r-l)z-(vhht)a-l-(vhhe3)b-(l-r)w.

24、在定义示例性reulr构建体的这些式中，vhh是对靶蛋白或e3泛素连接酶具有特异性的可变结构域重链抗体；r是vhht或vhhe3；l是接头分子；t是靶蛋白，使得vhh对靶蛋白具有特异性；e3是e3泛素连接酶，使得vhh对e3泛素连接酶具有特异性；a为1或更大；b为1或更大；w是0或1或更大；x是0或1或更大；y是0或1或更大；并且z是0或1或更大。

25、本文还提供了接头分子，其适于以使得对e3泛素连接酶具有特异性的vhh和对靶蛋白具有特异性的vhh各自独立地可用并且能够分别与e3泛素连接酶和靶蛋白结合的方式将对e3泛素连接酶具有特异性的vhh连接至对靶蛋白具有特异性的vhh。

26、在通常包括的实施方案中，reulr构建体还包含对e3泛素连接酶具有特异性的一个或多个另外的vhh和/或对靶蛋白具有特异性的一个或多个另外的vhh。

27、在通常的实施方案中，e3泛素连接酶是ring型e3泛素连接酶。在某些实施方案中，e3泛素连接酶是grail、godzilla和/或goliath。通常，其中e3泛素连接酶是下列中的一种或多种：rnf133、rnf148、rnf128、rnf149、rnf130、rnf150、rnf122、rnf43、znrf3、znrf4、rnf13、rnf167、amfr、stvn1、rnf170、rnf121、rnf175、rnf139、rnf145、marchf5、vfpl1、rnft1、rnf180、rnf103、rnf182、rnf5、rnf185、rnf19a、rnf19b、rnf144a、rnf144b、rnf217、marchf1、marchf8、marchf2、marchf3、marchf11、marchf4、marchf9、marchf6、nr1h4、rnf126、dcst1、rnf152、rnf186、cgrrf1、mul1、trim13、trim59或rnf112。

28、在通常包括的实施方案中，在式(a)-(e)的reulr构建体中，a为2或更大，b为2或更大，或者其中a为2或更大并且b为2或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，w为1或更大，x为1或更大，y为1或更大，或者z为0或1或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，w为0或更大，x为2或更大，y为2或更大，或者z为0或1或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，w为1或更大，x为1或更大，y为1或更大，并且z为0或1或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，w是0，x是1或更大，y是1或更大，并且z是0或1或更大。而且通常，在式(a)-(e)的reulr构建体中，a为3或更大，b为3或更大，或者其中a为3或更大并且b为3或更大。

29、在通常的实施方案中，靶蛋白是细胞表面蛋白。而且，靶蛋白通常是受体。在通常包括的实施方案中，靶蛋白与细胞增殖性病症或疾病相关。而且，靶蛋白通常与癌症、神经病症、淋巴瘤、白血病、糖尿病、自身免疫病症、病毒感染、细菌感染或寄生虫感染、阿尔茨海默病或心脏病中的一种或多种相关。

30、基于本公开的教导，本文还设想了产生或制造本公开的reulr构建体的方法，其通过使用本领域已知的方法制备所述的reulr构建体和包含此类reulr构建体的组合物来进行。

31、本文(包括上文和下文)提及的所有专利、专利申请和出版物均以引入的方式整体并入本文。