Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

本发明属于生物细胞，具体的说是leptin/sirt5对bmp9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。

背景技术：

1、bmp9是骨形态发生蛋白(bmp)家族的一员，在间充质干细胞(mscs)中bmp9比bmp7或bmp2具有更大的成骨诱导潜能。bmp9可通过经典bmp/smad通路和非经典bmp/smad通路促进mscs成骨分化，如wnt/β-catenin和pi3k/akt信号通路。其中，wnt/β-catenin信号对成骨至关重要可在干细胞分化的早期被激活，但在成骨细胞成熟阶段被抑制[4]。wnt/β-catenin活性可受多种因素调控，如wnt配体、wnt抑制因子1(wif1)、dickkopf 1(dkk1)、骨硬化蛋白(sost)等。此外，β-catenin还可以通过翻译后修饰进行调节，如β-catenin的磷酸化和乙酰化。在诱导前体细胞向成骨细胞分化时，bmp9可激活wnt/β-catenin信号通路。但bmp9如何激活wnt/β-catenin信号尚未完全阐明。

2、瘦素(leptin)是由167个氨基酸组成的多肽，主要表达于白色脂肪组织、骨髓等组织。这种多肽最初是在遗传肥胖的大鼠身上发现的，leptin在血浆中与其受体结合调节摄食和能量平衡，在调节体内能量代谢中发挥关键作用[8,9]。先前的研究表明，高水平的葡萄糖或leptin通过促进丙二酰辅酶a的分泌来抑制糖酵解过程，丙二酰辅酶a是葡萄糖代谢的负反馈调节因子，通过促进糖酵解途径的关键调节因子丙二酰化来实现。在骨重建过程中，瘦素可以通过抑制成骨细胞增殖或通过增加nf-κb受体活化因子配体的表达来促进破骨细胞的吸收，从而调节骨形成与骨吸收之间的平衡。瘦素还通过下调c-myc和cyclin d1[14]的表达抑制成骨细胞增殖。然而，其机制尚不明确。糖酵解是成骨分化过程中的主要能量来源，同时研究发现成骨关键通路wnt/β-catenin可通过肝癌相关巨噬细胞激活糖酵解，促进上皮-间充质转化。瘦素可以通过促进丙二酰辅酶a的分泌来调节糖酵解过程。因此，瘦素可能通过修饰某些关键的成骨调节因子参与调控bmp9的成骨潜能。

3、sirt5是一种nad+依赖性蛋白脱酰基酶，定位于细胞质和线粒体，参与调节多种代谢途径。sirt5可以通过去除靶点赖氨酸残基上的丙二酰化来调节糖酵解途径。丙二酰辅酶a是丙二酰化化合物的供体，可由丙二酰辅酶a脱羧酶代谢。丙二酰辅酶a通过促进关键靶点的丙二酰化来发挥代谢的负反馈调节作用。相反，sirt5通过去甲基化恢复这些靶点的活性，从而正向调节代谢。sirt5作为赖氨酸丙二酰化的全局调节因子，通过与丙二酰辅酶a维持内环境稳态在多种疾病中发挥重要作用。然而，sirt5在成骨分化中的作用尚不清楚。

4、为了证明了瘦素对bmp9诱导的mscs成骨分化的影响，并探讨wnt/β-catenin和sirt5是否参与这一过程，为此，本发明提供leptin/sirt5对bmp9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，解决上述至少一个问题，本发明提出的leptin/sirt5对bmp9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明所述的leptin/sirt5对bmp9诱导间充质干细胞成骨分化的影响,该方法步骤如下所示：

3、s1：选用细胞培养，并对细胞进行重组腺病毒；

4、s2：建立大鼠去卵巢(ovx)模型，并通过elisa法测量大鼠血清；

5、s3：提取选用细胞的 rna，同时对cdna制备，并对pcr、蛋白和westernblot检测，同时对碱性磷酸酶(alp)活性测定；

6、s4：小鼠颅骨缺损模型建立；

7、s5：液相色谱-串联质谱分析；

8、s6：共聚焦分析和免疫沉淀法，并记录统计数据。

9、优选的，所述s1的具体方法步骤如下所示：

10、选用细胞为贴壁培养的细胞hek293、c3h10t1/2、3t3-l1和mc3t3-e1，同时将细胞在含有10％fbs、100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔贝科dmem(high glucose)培养基中培养，并置于37℃、5％ co2孵育箱中培养；并通过用adeasy系统表达leptin或leptinsirna寡核苷酸的重组病毒，将重组腺病毒在hek293细胞中包装，这些细胞被命名为adbmp9、adleptin和adsileptin；用绿色荧光蛋白(gfp)标记adbmp9和adleptin，用红色荧光蛋白(rfp)标记adsileptin；只表达单体rfp (adrfp)或gfp (adgfp)的腺病毒作为载体对照。

11、优选的，所述s2的具体方法步骤如下所示：

12、a1：选取雌性10只sd大鼠，随机分为ova组和sham组，将ova组采用水合氯醛(4mg /kg)腹腔麻醉，俯卧位固定在手术台上，进行消毒，皮肤被放置在左大腿根部的上边缘，在背部中线处0.5 cm处开0.5 cm切口，用镊子沿腰大肌提起脂肪团的表面肌层，沿外侧边缘被切去约0.5 cm以找到左侧卵巢，摘除卵巢后，用5-0丝线结扎输卵管，右侧卵巢也通过同样的程序被切除；

13、a2：采用elisa法测定ovx大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶(tracp)、骨钙素(ocn)和leptin水平，用分光光度计(varioskan 3020, thermo scientific)在450 nm处测量吸光度。

14、优选的，所述s3中提取选用细胞的 rna，同时对cdna制备的步骤如下所示：

15、b1：选用细胞经不同因素处理后，于24h、48后结束培养，弃培养基，用预冷的pbs清洗细胞两次，放置于冰上加入400μl trizol裂解10min，用无酶枪头反复吹打，收集细胞裂解液于1.5mlep管中，然后在ep管中加入200μl氯仿，缓慢颠倒混匀20秒，置于冰上等待5min, 4℃低温超速离心12000g,10min；

16、b2：取出ep管，用无酶枪头小心吸取上层液体大约400μl于另一ep管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后静止10min,低温超速离心12000g，10min；

17、b3：弃上清液，加入75％乙醇(depc水配置)500μl,轻轻颠倒混匀3次，4℃低温离心7500g，5min，重复一次；

18、b4：缓慢匀速的将乙醇倒出，随后将空离20s，弃上清液，加入20μl depc水，测rna浓度；

19、b5：逆转录，取5μl总rna，2μl reaction buffer(5x), 0.5μl oligo(dt) primer,0.5μl primer script rt enzyme mix ⅰ，2μl random hexamer primer(100μm),总共10μl的体系，pcr反应程序：先在 37℃下，加热15min，在缓慢将温度升至85 37℃,，保持5s，倒入ddh2o定容至100μl，放置于-20℃保存。

20、优选的，所述s3中对pcr、蛋白和western blot检测，同时对碱性磷酸酶(alp)活性测定的方法步骤如下所示：

21、c1：取出3μl的cdna与6μl sybr green和引物的混合物混匀, 配成9μl的pcr体系，放置实时荧光定量pcr仪中，反应程序：95℃、3min， 95℃、20s，66℃、10s， 循环3次；95℃ 、10s，55℃、 15s，70℃、1s，总共循环39次，65℃-95℃溶解分析，目的基因mrna水平与β-actin的表达矫正归一化；

22、c2：将细胞接种于中，按照实验设计用试剂处理，在结束时间点，丢弃培养液，用冷磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗细胞，将6孔板置于冰上，每孔加入300 μl的放射免疫沉淀(ripa)裂解缓冲液(qs0006, saimike, china chongqing)5分钟，将裂解液收集到1.5 mlep管中，4℃离心10分钟(12000 g)，再将上清转移到新的1.5 ml ep管中，加入75 μl的加载缓冲液；

23、c3：混合物煮沸10分钟使其变性，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，转移到pvdf膜上，用5％牛血清白蛋白阻塞90分钟，然后用tris缓冲盐水和tween 20(tbst)冲洗膜3次，与一抗在4℃孵育过夜，再用tbst冲洗膜3次，并用辣根过氧化物酶(hrp)偶联二抗体孵育，数据由chemiscope6200凝胶成像仪收集，使用imagej软件对数据进行量化；

24、c4：将细胞接种于24孔板中，按照实验设计用试剂处理，5或7天后，按照碱性磷酸酶试剂盒的说明进行组织化学染色，再用pbs轻轻清洗盘子并风干，用显微镜拍摄图像，用imagej软件对平板进行扫描和量化。

25、优选的，所述s4的具体方法步骤如下所示：

26、d1：将小鼠头盖骨手术部位的毛发拔掉，用一个直径3毫米的环钻小心翼翼地在头盖骨上钻了一个洞，然后根据实验设计，用adgfp、adbmp9、adbmp9+adleptin或adsileptin、adbmp9+adleptin+adβ-catenin、adbmp9+adsileptin+adsiβ-catenin预处理c3h10t1/2细胞填充孔；

27、d2：8周后，所有小鼠安乐死，取出颅骨并用福尔马林固定，用于后续影像学评估；

28、d3：采用vivact 40μ-ct系统对颅骨缺损修复标本进行扫描，对原始数据进行进一步分析，并利用μ-ct 516.1软件进行三维重建。

29、优选的，所述s5的具体方法步骤如下所示：

30、e1：将富集的赖氨酸-丙二酰化多肽溶于溶剂a(0.1％fa,2％acn)中，加载到自制的反相预柱(75μm id×4 cm长，5μm粒径)上，溶剂b(0.1％甲酸，98％乙腈)在开始的26分钟内梯度从6％增加到23％，8分钟从23增加到35％，3分钟内增加到80％，然后在最后3分钟保持在80％；在easy-nlc 1000 uplc系统中，所有的梯度变化都是在恒定流速为400 nl/min的情况下进行的

31、e2：样品被置于nanospray电离源中，随后在q exactivetmplus系统(thermoscientific)中进行串联质谱(ms/ms)，并在线结合超高效液相色谱，然后在参数为2.0 kv的电喷雾电压和350～1800 m/z的全扫描范围和在70000分辨率下，在orbitrap (thermoscientific)中检测到完整的肽，然后选择多肽进行ms/ms，使用归一化碰撞能量值设置为28，在orbitrap中以17500分辨率检测片段，一个依赖于数据的过程在一次ms扫描和20次ms/ms扫描之间交替，使用15.0 s动态排除。。

32、优选的，所述s6中共聚焦分析的方法步骤如下所示：

33、f1：将c3h10t1/2细胞置于激光共聚焦细胞培养皿中，分别用adgfp、adbmp9、adleptin、adsileptin、adbmp9和adleptin、adbmp9和adsileptin、sisirt5或adbmp9和sisirt5处理，24 h后，用冷pbs(4℃)洗涤细胞，4％多聚甲醛固定15 min, pbs洗涤，0.3％triton x-100处理20 min，再用冷pbs洗涤，4℃山羊血清阻塞1小时。

34、f2：细胞与抗β-catenin一抗4℃孵育过夜，细胞用冷pbs洗涤2次，用dylight 594标记的荧光二抗孵育30分钟，用冷pbs洗涤2次，最后用二氨基苯基吲哚(dapi)孵育细胞5min，然后用冷pbs洗涤两次，图像采用共聚焦显微镜拍摄。

35、优选的，所述s6中免疫沉淀法的方法步骤如下所示：

36、g1：细胞接种于6孔板中，按实验设计处理，30小时后，用pbs(4℃)清洗细胞，用ripa裂解缓冲液处理细胞，其中含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂；

37、g2：蛋白g磁珠先用ripa裂解缓冲液进行预处理，随后裂解液用这些磁珠进行处理，防止蛋白与磁珠非特异性结合，裂解物与β-catenin、赖氨酸丙二酰化、sirt5或兔igg抗体在4℃孵育过夜，然后与蛋白g磁珠孵育；

38、g3：用ripa裂解缓冲液仔细洗涤磁珠，收集的ripa裂解缓冲液煮沸10分钟，将磁珠粒中洗脱出的蛋白质变形，最后对样品进行标准western blot检测。

39、本发明的有益效果如下：

40、1.本发明所述的leptin/sirt5对bmp9诱导间充质干细胞成骨分化的影响，在c3h10t1/2细胞中，外源性敲低leptin的表达可以增强bmp9所诱导的runx2、opn、 alp活性和基质矿化水平，而过表达leptin则抑制。实验结果发现，leptin敲低可以促进β-catenin的蛋白水平，并且对p-β-catenin没有影响。通过使用adsiβ-catenin病毒与adsileptin及adbmp9联合使用处理细胞时，沉默leptin对bmp9诱导runx2和alp活性的增加作用可被部分逆转。在体内实验结果显示，leptin敲低可以增强bmp9诱导颅骨缺损的面积和骨密度。通过质谱分析发现β-cateni可能存在赖氨酸丙二酰化修饰，同时这种修饰是由leptin通过sirt5，是赖氨酸丙二酰化全局调控因子，来调控。