一种人知降糖胶囊的质量检测方法与流程

1.本发明涉及一种人知降糖胶囊的质量检测方法，属于中成药成分含量测定领域。


背景技术：

2.本发明所述治疗糖尿病的中药制剂为人知降糖，该中药是陕西步长制药公司的独家生产品种。该药是由知母、人参、黄柏、天花粉、生地黄、玄参、麦冬、黄芪、地骨皮、北沙参、石斛、玉竹、五味子、女贞子、枸杞子、山药、鸡内金、葛根组成。其功能主治：具有益气养阴，清热生津的功效。用于ⅱ型糖尿病属气阴两虚兼燥热伤津证的辅助治疗，缓解以下症状：倦怠乏力，气短懒言，口干口渴，五心烦热，自汗盗汗，多食易饥，便秘溲赤，心悸失眠，腰酸不适等。该产品目前已经布局多件专利申请，其申请号为：200610066989.1、cn201310139513.6、201310139020.2、201310139018.5，上述专利技术保护主题为：该人知降糖中药的组方配比、制备工艺改进技术、新剂型等。经过检索，并发现与本产品技术方案相关的文献为“人知降糖胶囊质量标准研究”，陈衍斌，方欢乐，卢新义等人，西部中医药，发表时间2017-12-15，其文中公开相关内容：建立了黄柏、地骨皮、枸杞子、五味子、葛根素、齐墩果酸等tlc鉴别方法，以及菝葜皂苷元的含量测定方法，以甲醇-水(94∶6)为流动相，流速:1.0ml/min，采用蒸发光散射检测器:漂移管温度80℃，氮气流速每分钟1.7l。
3.目前，该药品执行的国家质量标准为ybz05132006-2014z，但该检测标准中有黄柏、地骨皮、五味子、女贞子、枸杞子、葛根6味药材的薄层鉴别，以及知母的水解产物“菝葜皂苷元(c27h44o3)”的含量测定。但上述检测方法标准还存在对中药复方内在质量可控性偏低的问题；且含量测定仅测定单一指标成分，不利于产品质量控制。另外，且该检测方法所选择的菝葜皂苷元成分水解完全才能够准确测出菝葜皂苷元含量，以造成在生产检验中，不同人员操作过程误差较大，不利于企业对真实产品质量的把控。因此，有必要开展该产品质量标准提高研究。


技术实现要素：

4.本发明提供一种人知降糖胶囊的质量检测方法，包括薄层鉴别检测和含量检测；所述薄层鉴别为：知母中芒果苷鉴别和玄参中哈巴俄苷的鉴别；所述含量检测包括知母中知母皂苷bⅱ和黄柏中盐酸小檗碱的含量检测。本发明质量检测方法有利于企业对药物生产过程的监控，并可提高该中药制剂的质量可控性，同时增加多指标成分项目的质量检测，进一步有效保障药物的内在质量。
5.本发明提供的技术方案如下：
6.一种人知降糖胶囊的质量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括知母皂苷bⅱ和盐酸小檗碱的含量测定。
7.所述检测方法还包括芒果苷、哈巴俄苷的薄层色谱鉴别方法。
8.优选的，所述盐酸小檗碱含量测定方法包括如下步骤：
9.⑴
、供试品溶液的制备：取中药制剂内容物，称定，加入20～40％丙酮，称重，采用
超声处理、加热回流提取1小时，放冷，补足损失的重量，摇匀，即得；
10.⑵
、对照品溶液的制备：取知母皂苷bⅱ对照品，称定，加20～40％丙酮，制成每1ml含0.2～0.6mg的溶液，即得；
11.⑶
、色谱条件：流动相为:浓度为0.03～0.07mol/l磷酸二氢钾-乙腈(47:53)，流速:0.8～1.2ml/min、柱温:20～30℃、检测波长:220～300nm；
12.⑷
、测定法：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。
13.优选的，所述盐酸小檗碱含量测定方法包括如下步骤
⑴
和
⑵
中丙酮的浓度为30％。
14.优选的，所述盐酸小檗碱含量测定方法包括如下步骤
⑶
色谱条件：所述磷酸二氢钾浓度为0.05mol/l、流速:1ml/min、柱温:25℃、检测波长265nm。
15.优选的，所述知母皂苷bⅱ含量测定方法包括如下步骤：
16.⑴
、供试品溶液的制备：取中药制剂内容物，称定，加入20～40％丙酮，称重，采用超声处理20～40分钟、加热回流提取0.5～1.5小时，放冷，补足损失的重量，摇匀，即得；
17.⑵
、对照品溶液的制备：取知母皂苷bⅱ对照品，精密称定，加20～40％丙酮制成每1ml含0.2～0.6mg的溶液，即得；
18.⑶
、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％甲酸(23:77)为流动相；蒸发光散射检测器，漂移管温度100～110℃，载气流速每分钟1.8～2.3l；
19.⑷
、测定法：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。
20.优选的，所述芒果苷和哈巴俄苷薄层鉴别方法包括如下步骤：
21.⑴
、芒果苷薄层色谱鉴别：
22.取本发明中药制剂内容物，加甲醇，超声处理20～40分钟，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；另取芒果苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05～0.15mg的溶液，作为对照品溶液，吸上述供试品溶液和对照品溶液，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水-甲酸(0.8:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
23.⑵
、哈巴俄苷薄层色谱鉴别：
24.取本发明中药制剂内容物，加甲醇，超声处理20～40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，用三氯甲烷脱脂3次，弃去三氯甲烷液，水层用水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，用氨水洗涤，弃去碱液，正丁醇层用正丁醇饱和的水洗涤，收集正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液，吸上述供试品溶液和对照品溶液，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸-水(13:6.5:0.5:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛-4％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
25.为了说明本发明技术方案的创新性，现将本发明检测条件色谱条件优化展示如下：
26.1.知母皂苷bⅱ(知母)含量优化方法
27.采用单因素方法考察回流提取与超声提取两种方法对知母皂苷bⅱ提取率的影响，再采用l9(34)正交试验对提取溶剂浓度(10％、30％、50％)、提取时间(15min、30min、45min)、料液比(15倍、25倍、50倍)进行考察，考察知母皂苷bⅱ含量检测的提取方法；对提取溶剂浓度、提取时间及溶剂量进行正交l9(34)试验，确定知母皂苷bⅱ含量检测的供试品溶液制备方法；按照确定的最优条件对提取方法进行验证，随后进行重复性、精密度、准确度、专属性、线性关系、线性范围、耐用性(不同品牌色谱柱、不同柱温、不同流动相比例)、溶液稳定性考察的方法学验证。验证符合要求后，确定知母皂苷bⅱ含量检测方法。
28.采用单因素方法考察回流提取与超声提取两种方法对盐酸小檗碱提取率的影响，再采用l9(34)正交试验对提取溶剂浓度(30％、50％、70％)、提取时间(0.5h、1h、1.5h)、料液比(250倍、500倍、1000倍)进行考察，考察盐酸小檗碱含量检测的提取条件；对提取溶剂浓度、提取时间及溶剂量进行正交l9(34)试验，确定盐酸小檗碱含量检测的供试品溶液制备方法；按照确定的最优条件对提取方法进行验证，随后进行重复性、精密度、准确度、专属性、线性关系、线性范围、耐用性(不同品牌色谱柱、不同柱温、不同流动相比例)、溶液稳定性考察的方法学验证。验证符合要求后，确定盐酸小檗碱含量检测方法。
29.最后，利用确定的质量检测方法进行10批次人知降糖胶囊药物知母、玄参两味药材的薄层色谱鉴别、知母皂苷bⅱ含量及黄柏中盐酸小檗碱含量检测，并计算其含量转移率，依据20版《中国药典》中药材含量限度以及10批次平均转移率制定人知降糖胶囊药物知母皂苷bⅱ、盐酸小檗碱两个成份的含量限度要求，以便控制和评价人知降糖胶囊药物质量。
30.2.知母中的芒果苷，玄参药材中哈巴俄苷成分的薄层色谱鉴别
31.首先对知母中的芒果苷以及玄参中的哈巴俄苷按照鉴别方法分别进行5个不同点样量考察，确定最佳点样量；其次对制备对照品溶液、阴性溶液、供试品进行专属性验证，同时对不同温湿度、不同人员以及不同薄层板进行耐用性验证，
32.本发明检测方法的有益效果：
33.⑴
、本发明所选择具有降血糖功效的知母皂苷bⅱ、盐酸小檗碱两个指标成分的含量测定。
①
、本发明所优选的检测方法中知母皂苷bⅱ的保留时间20分钟，其检测方法学验证结果可知，其重复性考察rsd(％)值为3.14％，其表明重复性良好。精密度考察结果为1.94％，表明精密度良好。加样回收率均在90％～108％之间，平均值为106.30％；rsd(％)值为0.78％，表明该方法测定其准确度良好。
②
、本发明所优选的检测方法中盐酸小檗碱的保留时间为20分钟，含量方法学验证，重复性结果可知，其rsd(％)值为1.20％。对照品溶液精密度(0.19％)及供试品溶液精密度(0.13％)。中间精密度考察结果，rsd(％)值为1.36％，本方法测定盐酸小檗碱加样回收率均在95％-99％之间，平均值为97.28％；rsd(％)值为1.94％，表明该方法，测定其准确度良好。
34.⑵
、本发明还建立了芒果苷薄层色谱鉴别(知母药材)、哈巴俄苷(黄柏药材)薄层色谱鉴别，该检测方法具有快速，简便专属性强的优点。本发明检测方法有利于人知降糖胶囊药物质量控制；有效保证该产品的内在质量。
附图说明
35.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发
明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
36.图1-专属性hplc知母皂苷bⅱ对照品溶液色谱图；
37.图2-知母皂苷bⅱ标准曲线图；
38.图3-专属性hplc盐酸小檗碱对照品溶液色谱图；
39.图4
‑‑
盐酸小檗碱标准曲线图；
40.图5-芒果苷的薄层鉴别(供试品溶液：样品1-200601、样品2-200602、样品3-200603、样品4-200604、样品5-200605，对照品溶液:6-芒果苷对照品溶液)；
41.图6-哈巴俄苷薄层鉴别(供试品溶液：样品1-200601、样品2-200602、样品3-200603、样品4-200604、样品5-200605、样品7-200606、样品8-210303、样品9-210304、样品10-210305，样品11-210306，对照品溶液：样6-哈巴俄苷对照品溶液)。
具体实施方式
42.为了更加充分理解本发明的实施，下面列举一个或多个实验例，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。
43.实施例1知母皂苷bⅱ(知母)含量测定内容
44.1.1仪器与试药
45.1.1.1仪器
46.高效液相色谱仪(e2695，waters)；高效液相色谱仪(1260，aglient)；高效液相色谱仪(u3000，美国戴安)；薄层色谱成像系统(goodlook-1000，上海科哲生化科技有限公司)；十万分之一电子天平(dvz15cd，ohaus)；万分之一电子天平(ar1140，ohaus)；优普超纯水机(upt
‑ⅱ
，成都超纯科技有限公司)；超纯水机(milli-q，默克)超声波清洗仪(kq-250v，昆山市超声仪器有限公司)；超声波清洗仪(sk8200hp，上海科导仪器有限公司)；电子恒温鼓风干燥箱(gzx-gfc
·
101-1-bs，上海博泰实验设备有限公司)；旋转蒸发仪(re-52aa，上海亚荣生化仪器厂)；循环水真空泵(shz-dⅱ，西安予辉仪器设备有限公司)。
47.1.1.2试药
48.试验药品：人知降糖胶囊(批号:151202、160701、160801，170701，陕西步长制药有限公司)；对照品及来源：知母皂苷bⅱ，来源:中国食品药品检定研究院，批号:111839-201505，纯度:94.4％。
49.1.1.3试剂及材料
50.甲醇(批号:10014118，国药集团化学试剂有限公司)，乙醇(批号:10009164，国药集团化学试剂有限公司)，三氯甲烷(批号:10006818，国药集团化学试剂有限公司)，甲酸(批号:80065518，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸二氢钾(批号:20161226，国药集团化学试剂有限公司)，十二烷基硫酸钠(批号:20160413，国药集团化学试剂)，色谱乙腈(批号:ja043730，默克股份两合公司)水为超纯水。
51.1.2试验方法及结果
52.1.2.1色谱条件的考察
53.色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相:乙腈-0.1％甲酸(23:77)，流速:1ml/min，柱温:25℃蒸发光检测器参数:漂移管温度105℃，载气流速每分钟2.1l，进样量:供试品10μl、对照品5～15μl，理论塔板数:理论板数按知母皂苷bⅱ峰计算应不低于
10000。
54.1.2.2供试品溶液制备方法的考察
55.色谱条件及系统适应性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％甲酸(23:77)为流动相；蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃，载气流速每分钟2.1l，理论板数按知母皂苷bⅱ峰计算应不低于10000。
56.对照品溶液的制备：取知母皂苷bⅱ对照品适量，精密称定，加30％丙酮制成每1ml含0.4mg的溶液，即得。
57.1.2.2.1提取条件的考察
58.采用单因素方法考察回流提取与超声提取两种方法对知母皂苷bⅱ提取率的影响，再采用l9(34)正交试验对提取溶剂浓度(10％、30％、50％)、提取时间(15min、30min、45min)、料液比(15倍、25倍、50倍)进行考察，最终确定提取条件参数。
59.根据《中国药典》2015年版一部成方制剂以及相关文献资料中检测知母皂苷bⅱ含量的各产品可得出两种提取方式:超声处理(不同功率，不同频率)、加热回流；有多种提取时间，分别进行考察。
60.供试品溶液的制备
61.取本品(批号160801)内容物约1g，共两组，每组平行2份，精密称定，置100ml三角瓶中，精密加入30％丙酮25ml，称重，分别采用超声处理(功率250w，频率50khz)30分钟、回流提取1小时方式提取，放冷，补足损失的重量，摇匀，即得。
62.测定法分别精密吸取上述对照品溶液5μl、15μl与供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
63.表1不同提取方法测定知母皂苷bⅱ含量
[0064][0065]
由t检测可得，两种提取方法测得样品知母皂苷bⅱ含量p值大于0.05，无显著性差异，表明采用两种提取方法对知母皂苷bⅱ的提取率差异较小，故确定采用经济、简便的超声提取的方法制备供试品溶液。
[0066]
1.2.2.2提取溶剂浓度、提取时间及溶剂量考察
[0067]
取本品(批号160801)内容物约1g，精密称定，置100ml三角瓶中，按正交l9(34)表进行试验，制备相应的供试品溶液。按色谱条件进行测定，计算不同条件提取所得知母皂苷bⅱ的含量并进行分析。正交直观分析见表2，方差分析见表3。
[0068]
表2知母皂苷bⅱ直观分析表
[0069][0070]
表3知母皂苷bⅱ方差分析表
[0071][0072][0073]
从直观分析表可以看出，知母皂苷bⅱ最佳提取条件为a2b2c1，即加30％丙酮15ml，超声提取30min，又从方差分析表可知，各因素均无显著性差异，故确定人知降糖胶囊中知母皂苷bⅱ的提取条件为:加30％丙酮15ml，超声提取30min。
[0074]
1.2.3提取方法的验证
[0075]
取本品(批号160801)内容物约1g，平行3份，精密称定，置100ml三角瓶中，精密加入30％丙酮15ml，称重，超声提取30分钟，放冷，补重，摇匀，即得。按色谱条件进行测定，计算知母皂苷bⅱ的含量。结果见表4。
[0076]
表4知母皂苷bⅱ提取条件验证结果
[0077][0078]
从上表可以看出，最优条件测得知母皂苷bⅱ含量高于正交最优(实验8)，且平行3组rsd(％)值为2.13％，表明采用30％丙酮15ml，超声提取30分钟的条件提取人知降糖胶囊中知母皂苷bⅱ的提取率较高，且方法稳定，重复性良好。
[0079]
1.3方法学验证
[0080]
1.3.1重复性考察
[0081]
取同一批号供试品(批号:170701)1g，平行6份，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液5μl、15μl和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表5。
[0082]
表5重复性试验结果
[0083][0084]
根据表1可知，6份供试品溶液测得的知母皂苷bⅱ含量的rsd(％)值为3.14％(n＝6)。表明供试品溶液制备方法重复性良好。
[0085]
1.3.2精密度考察
[0086]
分别吸取对照品溶液10μl，按照确定色谱方法和色谱条件，注入液相色谱仪，连续重复进样6次，测定，记录其峰面积值，对照品精密度试验。结果见表6。
[0087]
表6对照品精密度试验
[0088][0089]
由上表可见，对照品精密度均在要求范围内，表明仪器精密度良好。
[0090]
1.3.3中间精密度考察
[0091]
两名检验员在不同实验室、不同时间取同一批号供试品(批号:170701)1g，平行6份，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液5μl、15μl和供试品溶液10μl，注入不同液
相色谱仪，测定。结果见表7。
[0092]
表7中间精密度考察结果
[0093][0094]
由表可见，不同分析人员测得样品含量的相对平均偏差为3.55％，表明供试品溶液制备方法中间精密度良好。
[0095]
1.3.4回收率考察
[0096]
用对照品进行加样回收率测定。取已知含量重复性试验项下的样品约0.5g(批号:170701)，平行6份，分别精密加入知母皂苷bⅱ对照品溶液(配制批号:cs171128，浓度:0.1280mg/ml)15ml，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液5μl、15μl和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，并计算回收率，结果见表8。
[0097]
表8回收率试验结果
[0098][0099]
如表8所示，本方法测定知母皂苷bⅱ加样回收率均在90％～108％之间，平均值为106.30％；rsd(％)值为0.78％，表明该方法测定其准确度良好。
[0100]
1.3.5专属性的考察
[0101]
按处方比例和供试品溶液制备同法制成不含知母药材的阴性对照溶液，按正文方法测定，见附图1。结果可知，人知降糖胶囊供试品溶液与知母皂苷bⅱ对照品相应的保留时间出现色谱峰，而无知母药材的阴性样品溶液在与知母皂苷bⅱ相应的保留时间未出现色谱峰，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。
[0102]
1.3.6线性关系的考察
[0103]
分别配制一系列不同浓度的知母皂苷bⅱ对照品溶液，分别精密吸取20μl进样，以进样质量对数值为横坐标(x)，以色谱峰面积对数值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并对所测得的数据进行回归分析，标准曲线见表9。
[0104]
表9线性关系考察结果
[0105][0106]
结果表明：知母皂苷bⅱ对照品进样质量在0.000778mg～0.015558mg范围内呈良好的线性关系。
[0107]
1.3.7范围的考察
[0108]
取同一批号供试品(批号:170701)参考线性、准确度、精密度结果及方法学验证要求确定为
±
20％，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液5μl、15μl和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表10。
[0109]
表10范围考察结果
[0110][0111]
由表10可见，样品称样量的
±
20％内结果均符合要求。
[0112]
1.3.8耐用性的考察
[0113]
1.3.8.1不同品牌色谱柱考察
[0114]
取本品(批号:170701)内容物1g，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液5μl、15μl和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，柱温25℃，流速1.0ml/min，分别用不同品牌色谱柱在同一台色谱仪中测定。结果见表11。
[0115]
表11不同品牌色谱柱考察结果
[0116][0117]
由表可见，同一供试品溶液分别用不同品牌色谱柱进样，其知母皂苷bⅱ含量的rsd(％)值为1.43％。表明该方法对色谱柱耐用性良好。
[0118]
1.3.8.2不同柱温考察
[0119]
取本品(批号:170701)内容物1g，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液5μl、15μl和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，流速1.0ml/min，分别用不同柱温进行测定。
[0120]
表12不同柱温考察结果
[0121][0122]
根据检测色谱图，柱温30℃供试品峰分离效果不佳，分离度不符合要求，因此柱温30℃无法分析。
[0123]
根据表12可见，柱温20℃、25℃测得结果无显著性差异。但柱温30℃时目标峰两侧有杂质峰，存在与杂质峰重合的风险，因此综合考虑将柱温确定为25℃。
[0124]
1.3.8.3不同流动相比例考察
[0125]
取本品(批号:170701)内容物1g，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液5μl、15μl和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，柱温25℃，流速1.0ml/min，流动相分别用不同比例的乙腈进行测定。结果见表13。
[0126]
表13不同流动相比例考察结果
[0127][0128]
根据表15可见，不同比例乙腈测得结果无显著性差异。综合考虑将乙腈比例确定为23％。
[0129]
1.3.9溶液稳定性的考察
[0130]
取同一样品溶液(批号:170701)分别在0、5、10、15、20、24h测定，精密吸取对照品
溶液5μl、15μl和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。实际测定结果见表14。
[0131]
表14溶液稳定性考察结果
[0132][0133]
由表14结果可见，供试品溶液分别于不同时间间隔进样，知母皂苷bⅱ含量的rsd(％)值为3.89％，表明供试品溶液在室温下放置27小时内稳定性良好。
[0134]
实施例2盐酸小檗碱(黄柏)含量测定内容
[0135]
2.1仪器与试药
[0136]
2.1.1仪器
[0137]
高效液相色谱仪(e 2695，waters)；高效液相色谱仪(1260，aglient)；高效液相色谱仪(u3000，赛默飞)；薄层色谱成像系统(goodlook-1000，上海科哲生化科技有限公司)；十万分之一电子天平(dvz15cd，ohaus)；万分之一电子天平(ar1140，ohaus)；优普超纯水机(upt
‑ⅱ
，成都超纯科技有限公司)；超纯水机(milli-q，默克)超声波清洗仪(kq-250v，昆山市超声仪器有限公司)；超声波清洗仪(sk8200hp，上海科导仪器有限公司)；电子恒温鼓风干燥箱(gzx-gfc
·
101-1-bs，上海博泰实验设备有限公司)；旋转蒸发仪(re-52aa，上海亚荣生化仪器厂)；循环水真空泵(shz-dⅱ，西安予辉仪器设备有限公司)。
[0138]
2.1.2试药
[0139]
2.1.2.1试验药品
[0140]
人知降糖胶囊(批号:151202、160701、160801，170701陕西步长制药有限公司)；对照品及来源：盐酸小檗碱，来源:中国食品药品检定研究院，批号:110713-201212，纯度:86.7％。
[0141]
2.1.2.2试剂及材料
[0142]
甲醇(批号:10014118，国药集团化学试剂有限公司)，乙醇(批号:10009164，国药集团化学试剂有限公司)，三氯甲烷(批号:10006818，国药集团化学试剂有限公司)，甲酸(批号:80065518，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸二氢钾(批号:20161226，国药集团化学试剂有限公司)，十二烷基硫酸钠(批号:20160413，国药集团化学试剂有限公司)，色谱乙腈(批号:ja043730，默克股份两合公司)水为超纯水。
[0143]
2.2试验方法及结果
[0144]
2.2.1色谱条件的考察
[0145]
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相:0.05mol/l磷酸二氢钾-乙腈(47:53，每1000ml流动相中含十二烷基硫酸钠1.7g)，流速:1ml/min，柱温:25℃，检测波长:265nm，进样量:10μl，理论塔板数:理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4000。
[0146]
2.2.2.1提取条件的考察、提取方法考察
[0147]
采用单因素方法考察回流提取与超声提取两种方法对盐酸小檗碱提取率的影响，再采用l9(34)正交试验对提取溶剂浓度(30％、50％、70％)、提取时间(0.5h、1h、1.5h)、料
液比(250倍、500倍、1000倍)进行考察，最终确定提取条件参数。
[0148]
取本品(批号160801)内容物约0.1g，共两组，每组平行2份，精密称定，置150ml烧瓶中，精密加入50％乙醇100ml，称重，第一组超声处理(功率250w，频率50khz)30min，第二组回流提取1小时，放冷，补重，摇匀，即得。按色谱条件进行测定，计算不同方法提取所得盐酸小檗碱的含量。结果见表15。
[0149]
表15不同提取方法测定盐酸小檗碱含量
[0150][0151]
由t检测可得，两种提取方法测得样品盐酸小檗碱含量p值小于0.05，具有显著性差异，表明采用回流提取进行供试品溶液的制备提取率较高，故确定采用回流提取的方法制备供试品溶液。
[0152]
2.2.2.2提取溶剂浓度、提取时间及溶剂量考察
[0153]
取本品(批号160801)内容物约0.1g，精密称定，置150ml烧瓶中，按正交l9(34)表进行试验，制备相应的供试品溶液。按色谱条件进行测定，计算不同方法提取所得盐酸小檗碱的含量并进行分析。正交直观分析见表16，方差分析见表17。
[0154]
表16盐酸小檗碱直观分析表
[0155]
[0156][0157]
表17盐酸小檗碱方差分析表
[0158][0159]
从直观分析表可以看出，盐酸小檗碱最佳提取条件为a2b3c3，即加50％乙醇100ml，回流提取1.5h，又从方差分析表可知，各因素均无显著性差异，故确定人知降糖胶囊中盐酸小檗碱的提取条件为：加50％乙醇100ml，回流提取1.5h。
[0160]
2.2.3提取条件验证
[0161]
取本品(批号160801)内容物约0.1g，平行3份，精密称定，置150ml烧瓶中，精密加入50％乙醇100ml，称重，回流提取1.5小时，放冷，补重，摇匀，即得。按色谱条件进行测定，计算盐酸小檗碱的含量。结果见表18。
[0162]
表18盐酸小檗碱提取条件验证结果
[0163][0164]
从上表可以看出，最优条件测得盐酸小檗碱含量高于正交最优(实验5)，且平行3组rsd(％)值为0.22％，表明采用50％乙醇100ml，回流提取1.5h的条件提取人知降糖胶囊中盐酸小檗碱的提取率较高，且方法稳定，重复性良好。
[0165]
2.3方法学验证
[0166]
2.3.1重复性考察
[0167]
取同一批号供试品(批号:170701)0.1g，平行6份，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表19。
[0168]
表19重复性试验结果
[0169][0170]
根据表19可知，6份供试品溶液测得的盐酸小檗碱含量的rsd(％)值为1.20％(n＝6)。表明供试品溶液制备方法重复性良好。
[0171]
2.3.2对照品溶液精密度及供试品溶液精密度考察
[0172]
分别吸取对照品溶液及供试品溶液(批号:170701)各10μl，注入液相色谱仪，连续重复进样6次，测定，记录其峰面积值，对照品精密度试验结果见表20；供试品精密度试验。结果见表21。
[0173]
表20对照品精密度试验
[0174][0175]
表21供试品精密度试验
[0176][0177]
由上表可见，对照品及样品的精密度均在要求范围内，表明仪器精密度良好。
[0178]
2.3.3中间精密度考察
[0179]
两名检验员在不同实验室、不同时间取同一批号供试品(批号:170701)0.1g，平行6份，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入不同液相色谱仪，测定。结果见表22。
[0180]
表22中间精密度考察结果
[0181][0182]
由表22可见，不同分析人员测得样品含量的rsd(％)值为1.36％，表明供试品溶液制备方法中间精密度良好。
[0183]
2.3.4准确度考察
[0184]
用对照品进行加样回收率测定，取已知含量重复性试验项下的样品约0.05g(批号:170701)，平行6份，分别精密，加入盐酸小檗碱对照品溶液(配制批号:cs1710172-171110，浓度:2.032μg/ml)100ml，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，并计算回收率，结果见表23。
[0185]
表23回收率试验结果
[0186][0187][0188]
如表25所示，本方法测定盐酸小檗碱加样回收率均在95％-9％之间，平均值为97.28％；rsd(％)值为1.94％，表明该方法测定其准确度良好。
[0189]
2.3.5专属性的考察
[0190]
按处方比例和供试品溶液制备同法制成不含黄柏药材的阴性对照溶液，按正文方法测定，见附图3。结果可知，人知降糖胶囊供试品溶液与盐酸小檗碱对照品相应的保留时间出现色谱峰，而无黄柏药材的阴性样品溶液在与盐酸小檗碱相应的保留时间未出现色谱峰，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。
[0191]
2.3.6线性关系的考察
[0192]
分别配制一系列不同浓度的盐酸小檗碱对照品溶液，分别精密吸取10μl进样，以对照品的浓度为横坐标(x)，以色谱峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并对所测得的数据进行回归分析，标准曲线见表24，可参见附图4。
[0193]
表24线性关系考察结果
[0194][0195][0196]
结果表明，盐酸小檗碱对照品进样浓度在1.0285μg/ml～20.5700μg/ml范围内呈良好的线性关系。
[0197]
2.3.7范围的考察
[0198]
取同一批号供试品(批号:170701)参考线性、准确度、精密度结果及方法学验证要求确定为
±
20％，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表25。
[0199]
表25范围考察结果
[0200][0201]
由表25可见，样品称样量的
±
20％内结果均符合要求。
[0202]
2.3.8耐用性的考察
[0203]
2.3.8.1不同品牌色谱柱考察
[0204]
取本品(批号:170701)内容物0.1g，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，柱温30℃，流速1.0ml/min，分别用不同品牌色谱柱在同一台色谱仪中测定。结果见表26。
[0205]
表26不同品牌色谱柱考察结果
[0206][0207]
由表可见，同一供试品溶液分别用不同品牌色谱柱进样，其盐酸小檗碱含量的rsd(％)值为0.70％。表明该方法对色谱柱耐用性良好。
[0208]
2.3.8.2不同柱温考察
[0209]
取本品(批号:170701)内容物0.1g，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，流速1.0ml/min，分别用不同柱温，进行测定。
[0210]
表27不同柱温考察结果
[0211][0212]
根据表27可见，柱温25℃、30℃、35℃测得结果无显著性差异。综合考虑，选择室温25℃为宜。
[0213]
2.3.8.3不同流动相比例考察
[0214]
取本品(批号:170701)内容物0.1g，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液
和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，柱温30℃，流速1.0ml/min，流动相分别用不同比例的乙腈进行测定，结果见表28。
[0215]
表28不同流动相比例考察结果
[0216][0217]
根据表28可见，不同比例乙腈测得结果无显著性差异。综合考虑，将乙腈比例确定为53％。
[0218]
2.3.8.4不同类型高效液相色谱仪的考察
[0219]
取本品(批号:190701)内容物0.1g，按供试品溶液同法制备，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，柱温30℃，流速1.0ml/min分别在不同色谱仪中测定，结果见表29。
[0220]
表29不同类型高效液相色谱仪的考察结果
[0221][0222][0223]
由表可见，同一供试品溶液分别用不同品牌色谱仪检测，其盐酸小檗碱含量的rsd(％)值为2.82％。表明该方法对高效液相色谱仪耐用性良好。
[0224]
2.3.9溶液稳定性的考察
[0225]
取同一样品溶液(批号:170701)分别在0、2、4、6、8、12、24h测定，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表30。
[0226]
表30溶液稳定性考察结果
[0227][0228]
由表30可见，供试品溶液分别于不同时间间隔进样，盐酸小檗碱含量的rsd(％)值为2.05％。表明供试品溶液在室温下放置25小时内稳定性良好。
[0229]
实施例3
[0230]
3.1薄层色谱鉴别
[0231]
3.1.1知母药材(芒果苷)薄层色谱鉴别
[0232]
取本品内容物4g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取芒果苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸上述两种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水-甲酸(0.8:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，结果可参见附图5。
[0233]
3.1.2黄柏药材(哈巴俄苷)薄层色谱鉴别
[0234]
取本品内容物10g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用三氯甲烷脱脂3次，每次20ml，弃去三氯甲烷液，水层用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨水30ml洗涤，弃去碱液，正丁醇层用正丁醇饱和的水30ml洗涤，收集正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸上述供试品溶液2μl和对照品溶液1μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸-水(13:6.5:0.5:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛-4％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结论:供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，符合要求。