成对的二分免疫受体多核苷酸的高通量克隆及其应用的制作方法

背景技术：

1、t细胞受体(tcr)负责识别抗原主要组织相容性复合体，从而引发抗炎应答的发生。存在许多t细胞子集，包括细胞毒性t细胞和辅助t细胞。细胞毒性t细胞(也称为cd8+t细胞)可杀死异常的细胞，例如病毒感染细胞或肿瘤细胞。辅助t细胞(也称为cd4+t细胞)辅助其他免疫细胞的激活和成熟。细胞毒性t细胞和辅助t细胞在识别特异性靶抗原后都能发挥其功能，这能引发其各自的应答。t细胞的抗原特异性可由在t细胞表面表达的tcr来限定。t细胞受体是由两个多肽链(最常见的为α与β链)构成的异质二聚体蛋白质，但少量的t细胞能表达γ和β链。tcr的特异性氨基酸序列以及所得到的三维结构可限定tcr的抗原特异性和亲和力。任何单个t细胞的tcr链的氨基酸和编码dna序列在生物体的整个tcr谱中几乎都是唯一的或是丰度很低的，因为有大量可能的tcr序列存在。这种大的序列多样性是在t细胞发育过程中通过多种细胞机制实现的并且是免疫系统能够对多种潜在抗原作出应答的能力的一个关键方面。

2、分析tcr谱可有助于更好地理解免疫系统特征以及更好地理解疾病的病因和进展，特别是具有未知抗原诱因的疾病的病因和进展。tcr谱的极端多样性和tcr的二分性质代表了一个重大的分析挑战。高通量测序可以允许更大的测序深度和更准确地定量tcr克隆型丰度，尽管比光谱分型花费更大。然而，高通量测序仍易受pcr偏倚和测序错误的影响，其后果是克隆型丰度会被严重扭曲并且不存在的克隆型会被记录，从而错误地增加了观察到的多样性。此外，从克隆、功能研究和治疗用途等下游应用的测序数据中筛选和/或合成tcr链的同源对会很耗时。并且tcr链的筛选、合成的同源对的文库很小或多样性低。

技术实现思路

1、本文提供了高通量克隆可用于各种应用的天然成对的tcr的组合物和方法。本文提供的组合物和方法可超越测序和合成并提供编码tcr同源对的融合核酸分子以直接表达在宿主细胞中。所述组合物和方法还可应用于其他二分免疫受体(bipartiteimmunoreceptor)，如b细胞受体(bcr)。

2、根据一方面，本文提供了一种组合物，其包含多个融合的t细胞受体(tcr)多核苷酸，其中所述多个融合的tcr多核苷酸中的每个融合的tcr多核苷酸包含：第一核酸序列和第二核酸序列，其中(1)第一核酸序列编码第一tcr肽链的第一可变结构域(variabledomain)，其中第一可变结构域包括cd2和cd3，和(2)第二核酸序列编码第二tcr肽链的第二可变结构域，其中第二可变结构域包括cdr2和cdr3；其中每个融合的tcr多核苷酸的第一和第二核酸序列编码来自免疫细胞的第一和第二tcr肽链的同源对；其中所述多个融合的tcr多核苷酸包含来自至少5、10或20个不同v基因的v区域。在一些实施方案中，第一tcr肽链是t细胞受体(tcr)α肽链，第二tcr肽链是tcrβ肽链。在一些实施方案中，第一tcr肽链是tcrγ肽链、第二tcr肽链是tcrδ肽链。在一些实施方案中，第一可变结构域还包括cdr1，和/或第二可变结构域还包括cdr1。在一些实施方案中，第一tcr肽链的第一可变结构域是第一全长可变结构域，包括fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3和cdr3，和/或第二tcr肽链的第二可变结构域是第二全长可变结构域，包括fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3和cdr3。在一些实施方案中，第一核酸序列还编码第一tcr肽链的第一恒定结构域(constant domain)或其一部分和/或第二核酸序列还编码第二tcr肽链的第二恒定结构域或其一部分。在一些实施方案中，第一恒定结构域是第一胞外结构域，和/或第二恒定结构域是第二胞外结构域。在一些实施方案中，第一恒定结构域包括第一tcr链的第一胞外结构域、第一铰链区、第一跨膜区和第一细胞质尾区，和/或第二恒定结构域包括第二tcr肽链的第二胞外结构域、第二铰链区、第二跨膜区和第二细胞质尾区。在一些实施方案中，多个融合的tcr多核苷酸中的每个融合的tcr多核苷酸的长度为至少800、至少900、至少1000或至少1500个碱基对，多个融合的tcr多核苷酸中的每个融合的tcr多核苷酸的长度为至少1000、至少1500或至少2000个碱基对。在一些实施方案中，从免疫细胞中获得或释放第一核酸序列和第二核酸序列。

3、在一些实施方案中，免疫细胞分离自样品。在一些实施方案中，从受试者中获得样品。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是t细胞。在一些实施方案中，t细胞是炎性t细胞、细胞毒性t细胞、调节性t细胞、辅助t细胞、天然杀伤t细胞或其组合。在一些实施方案中，t细胞是cd4+t细胞或cd8+t细胞。在一些实施方案中，体外扩增免疫细胞。在一些实施方案中，样品是血液细胞样品、骨髓样品、脐带血样品、腹水样品、胸腔积液样品、脑脊髓样品、精液样品、唾液样品、尿液样品、粪便样品或其组合。在一些实施方案中，样品是从脑、肝、肺、肾、前列腺、卵巢、脾、淋巴结、扁桃体、甲状腺、胰腺、心脏、骨骼肌、肠、喉、食管、胸腺、胃、肿瘤、感染部位或其组合中获得的组织样品。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人、狗、猫、小鼠或大鼠。在一些实施方案中，受试者是健康的受试者或患病的受试者。在一些实施方案中，免疫细胞通过标志物分离自样品。在一些实施方案中，标志物是细胞表面标志物。在一些实施方案中，细胞表面标志物是cd39、cd69、cd103、cd25、pd-1、tim-3、ox-40、4-1bb、cd137、cd3、cd28、cd4、cd8、cd45ra和cd45ro、gitr、foxp3或其组合。在一些实施方案中，标志物是细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是ifn-γ、tnf-α、il-17a、il-2、il-3、il-4、gm-csf、il-10、il-13、颗粒酶b、穿孔素或其组合。

4、在一些实施方案中，多个融合的tcr多核苷酸中的每个融合的tcr多核苷酸还包含启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型或可诱导型的。在一些实施方案中，启动子是四环素反应性启动子。在一些实施方案中，启动子是病毒启动子。在一些实施方案中，启动子是β-肌动蛋白启动子、sv40早期启动子、sv40晚期启动子、免疫球蛋白启动子、巨细胞病毒启动子、逆转录病毒启动子、友脾病灶形成病毒启动子、疱疹病毒tk启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、金属硫蛋白启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗7.5k启动子或烯醇化酶启动子。在一些实施方案中，框内融合第一核酸和第二核酸以使第一可变结构域和第二可变结构域的表达受到一个启动子的控制。在一些实施方案中，多个融合的tcr多核苷酸中的每个融合的tcr多核苷酸还包含编码蛋白酶切割位点的序列。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点是细胞蛋白酶切割位点或病毒蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点是肠激酶切割位点、因子xa切割位点、凝血酶切割位点、肾素切割位点、胶原酶切割位点、胰蛋白酶切割位点、半胱天冬酶切割位点、弗林蛋白酶切割位点、pc5/6蛋白酶切割位点；pace蛋白酶切割位点、lpc/pc7蛋白酶切割位点、因子xa蛋白酶切割位点、genenase i切割位点、mmp蛋白酶切割位点或kex2蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点是病毒2a蛋白酶切割位点、病毒3c蛋白酶切割位点、传染性胰腺坏死病毒(ipnv)vp4蛋白酶切割位点、烟草蚀刻病毒(tev)蛋白酶切割位点或芜菁花叶病毒切割位点的核包含蛋白a(n1a)。在一些实施方案中，多个融合的tcr多核苷酸中的每个融合的tcr多核苷酸包含编码自切割肽的序列。在一些实施方案中，自切割肽是内含肽、刺猬肽(hedgehog peptide)或2a肽。在一些实施方案中，至少20个不同的v基因包括至少10个不同的trav基因和/或至少10个不同的trbv基因。在一些实施方案中，trav基因和trbv基因是人或小鼠trav基因和trbv基因。

5、在一些实施方案中，至少10个不同的trav基因选自人trav1-1、trav1-2、trav2、trav3、trav4、trav5、trav6、trav7、trav8-1、trav8-2、trav8-3、trav8-4、trav8-6、trav9-1、trav9-2、trav10、trav12-1、trav12-2、trav12-3、trav13-1、trav14、trav16、trav17、trav18、trav19、trav20、trav21、trav22、trav23、trav24、trav25、trav26-1、trav26-2、trav27、trav29、trav30、trav34、trav35、trav36、trav38-1、trav38-2、trav39、trav40、trav41。在一些实施方案中，至少10个不同的trbv基因选自人trbv2、trbv3-1、trbv4-1、trbv4-2、trbv4-3、trbv5-1、trbv5-4、trbv5-5、trbv5-6、trbv5-8、trbv6-1、trbv6-2、trbv6-3、trbv6-4、trbv6-5、trbv6-6、trbv6-8、trbv6-9、trbv7-2、trbv7-3、trbv7-4、trbv7-6、trbv7-7、trbv7-8、trbv7-9、trbv9、trbv10-1、trbv10-2、trbv10-3、trbv11-1、trbv11-2、trbv11-3、trbv12-3、trbv12-4、trbv12-5、trbv13、trbv14、trbv15、trbvl6、trbv18、trbv19、trbv20-1、trbv24-1、trbv25-1、trbv27、trbv28、trbv29-1和trbv30。

6、在一些实施方案中，至少20个不同的v基因包括至少20个不同的v基因亚组。在一些实施方案中，至少20个不同的v基因亚组包括至少10个不同的trav基因亚组和/或至少10个不同trbv基因亚组。在一些实施方案中，至少10个不同的trav基因亚组选自人trav1、trav2、trav3、trav4、trav5、trav6、trav7、trav8、trav9、trav10、trav12、trav13、trav14、trav16、trav17、trav18、trav19、trav20、trav21、trav22、trav23、trav24、trav25、trav26、trav27、trav29、trav30、trav34、trav35、trav36、trav38、trav39、trav40和trav41亚组。在一些实施方案中，至少10个不同的trbv基因亚组选自人trbv2、trbv3、trbv4、trbv5、trbv6、trbv7、trbv9、trbv10、trbv11、trbv12、trbv13、trbv14、trbv15、trbv16、trbv18、trbv19、trbv20、trbv24、trbv25、trbv27、trbv28、trbv29和trbv30。

7、在一些实施方案中，至少10个不同的trav基因选自小鼠trav1、trav2、trav3-1、trav3-3、trav3-4、trav3d-3、trav3n-3、trav4-2、trav4-3、trav4-4、trav4d-2、trav4d-3、trav4d-4、trav4n-3、trav4n-4、trav5-1、trav5-2、trav5-4、trav5d-2、trav5d-4、trav5n-2、trav5n-4、trav6-1、trav6-2、trav6-3、trav6-4、trav6-5、trav6-6、trav6-7、trav6d-3、trav6d-4、trav6d-5、trav6d-6、trav6d-7、trav6n-5、trav6n-6、trav6n-7、trav7-1、trav7-2、trav7-3、trav7-4、trav7-5、trav7-6、trav7d-2、trav7d-3、trav7d-4、trav7d-5、trav7d-6、trav7n-4、trav7n-5、trav7n-6、trav8-1、trav8-2、trav8d-1、trav8d-2、trav8n-2、trav9-1、trav9-2、trav9-3、trav9-4、trav9d-1、trav9d-2、trav9d-3、trav9d-4、trav9n-2、trav9n-3、trav9n-4、trav10、trav10d、trav10n、trav11、trav11d、trav11n、trav12-1、trav12-2、trav12-3、trav12d-1、trav12d-2、trav12d-3、trav12n-1、trav12n-2、trav12n-3、trav13-1、trav13-2、trav13-3、trav13-4、trav13-5、trav13d-1、trav13d-2、trav13d-3、trav13d-4、trav13n-1、trav13n-2、trav13n-3、trav13n-4、trav14-1、trav14-2、trav14-3、trav14d-1、trav14d-2、trav14d-3、trav14n-1、trav14n-2、trav14n-3、trav15-1、trav15-2、trav15d-1、trav15d-2、trav15n-1、trav15n-2、trav16、trav16d、trav16n、trav17、trav18、trav19、trav20和trav21。

8、在一些实施方案中，至少10个不同的trbv基因选自小鼠trbv1、trbv2、trbv3、trbv4、trbv5、trbv8、trbv9、trbv10、trbv12-1、trbv12-2、trbv13-1、trbv13-2、trbv13-3、trbv14、trbv15、trbv16、trbv17、trbv19、trbv20、trbv21、trbv23、trbv24、trbv26、trbv29、trbv30和trbv31。在一些实施方案中，至少10个不同的trav基因亚组选自trav1、trav2、trav3、trav4、trav5、trav6、trav7、trav8、trav9、trav10、trav11、trav12、trav13、trav14、trav15、trav16、trav17、trav18、trav19、trav20和trav21亚组。在一些实施方案中，至少10个不同的trbv基因亚组选自小鼠trbv1、trbv2、trbv3、trbv4、trbv5、trbv8、trbv9、trbv10、trbv12、trbv13、trbv14、trbv15、trbv16、trbv17、trbv19、trbv20、trbv21、trbv23、trbv24、trbv26、trbv29、trbv30和trbv31亚组。

9、在一些实施方案中，使所述多个融合的tcr多核苷酸中的每个融合的tcr多核苷酸环化。在一些实施方案中，所述多个融合的tcr多核苷酸包含至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少10,000、至少100,000至少1,000,000或至少10,000,000个不同的序列。

10、根据另一方面，本文提供了多个载体，每个载体包含来自免疫细胞的融合的tcr多核苷酸。在一些实施方案中，所述多个载体包括至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000个载体。在一些实施方案中，所述多个载体是自扩增rna复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。在一些实施方案中，所述多个载体是tc-83α病毒复制子的衍生物，所述衍生物已筛选或工程化为减少宿主细胞i型干扰素的生产，延长表达时长，增加蛋白质生产水平和/或表达除二分免疫受体以外的具有治疗有益效果的另外的试剂。在一些实施方案中，所述多个载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体源自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、α病毒、痘苗病毒、乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或其伪型。在一些实施方案中，多个载体是非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体是纳米颗粒、阳离子脂质、阳离子聚合物、金属纳米聚合物、纳米棒、脂质体、胶束、微泡、细胞穿透肽或脂质球。

11、本文还提供了多个tcr，每个tcr由来自本文公开的组合物的不同的融合的tcr多核苷酸或来自本文公开的多个载体的不同的融合的tcr多核苷酸编码，其中所述多个tcr包括至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000个tcr。

12、本文还提供了多个宿主细胞，每个宿主细胞包含来自本文公开的组合物中的不同的融合的tcr多核苷酸、本文公开的多个载体中的不同载体或者本文公开的多个tcr中的不同的tcr。在一些实施方案中，所述多个宿主细胞是t细胞或b细胞。在一些实施方案中，t细胞是炎性t细胞、细胞毒性t细胞、调节性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞或其组合。在一些实施方案中，t细胞是cd4+t细胞或cd8+t细胞。在一些实施方案中，所述多个宿主细是自体细胞。在一些实施方案中，所述多个宿主细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，所述多个宿主细胞从供体中获得。在一些实施方案中，供体是人。在一些实施方案中，供体是健康的供体或患病的供体。在一些实施方案中，所述多个宿主细胞从样品中获得。在一些实施方案中，样品是血液样品、骨髓样品、脐血样品、腹水样品、胸腔积液样品、脑脊液样品、精液样品、痰样品、尿液样品、粪便样品或其组合。在一些实施方案中，样品是从脑、肝、肺、肾、前列腺、卵巢、脾、淋巴结、扁桃体、甲状腺、胰腺、心脏、骨骼肌、肠、喉、食管、胸腺、胃、肿瘤、感染部位或其组合中获得的组织样品。在一些实施方案中，所述多个宿主细胞是细胞系细胞。在一些实施方案中，细胞系细胞是cho-k1细胞；hek293细胞：caco2细胞：u2-os细胞：nih3t3细胞；nso细胞；sp2细胞；cho-s细胞；dg44细胞；k-562细胞，u-937细胞；mrc5细胞；imr90细胞；jurkat细胞；hepg2细胞；hela细胞；ht-1080细胞；hct-116细胞；hu-h7细胞；huvec细胞；或molt 4细胞。在一些实施方案中，所述多个宿主细胞是转基因细胞。

13、在一些实施方案中，使编码tcrα肽链、tcrβ肽链、tcrγ肽链、tcrδ肽链、bcr重肽链或bcr轻肽链的内源性基因下调或失活。在一些实施方案中，使另一内源性基因下调或失活，其中另一内源性基因选自pd1、ctla-4、lag3、tim3、btla、by55、tigit、b7h5、lair1、siglec10、2b4或其任意组合。在一些实施方案中，所述多个宿主细胞中的每个工程化为表达另外的试剂以增强宿主细胞的功能。在一些实施方案中，所述功能是细胞毒性功能、促炎功能或抗炎功能。在一些实施方案中，所述另外的试剂是细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是促炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是抗炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是肿瘤坏死因子α(tnfα)；白细胞介素(il)-1α；白细胞介素-1β；白细胞介素-2；白细胞介素-5；白细胞介素-6；白细胞介素-8；白细胞介素-15；白细胞介素-18；干扰素(ifn-γ)；血小板活化因子(paf)；单核细胞趋化蛋白1和2(mcp-1，mcp-2)；巨噬细胞移动抑制因子(mif)；cxcl8；cxcl9；cxcl10；高迁移率族盒蛋白1(hmgb-1)、白细胞介素-1ra、白细胞介素-4、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-13，转化生长因子β(tgf-β)，il-16或其任意组合。

14、根据另一方面，本文提供了一种组合物，其包含多个载体，所述多个载体中的每个载体包含具有第一核酸序列和第二核酸序列的融合的t细胞受体(tcr)多核苷酸，其中(1)第一核酸序列编码第一tcr肽链的第一可变结构域，其中第一可变结构域包括cdr1、cdr2和cdr3，和(2)第二核酸序列编码第二tcr肽链的第二可变结构域，其中第二可变结构域包括cdr1、cdr2和cdr3；其中每个融合的tcr多核苷酸的第一和第二核酸序列编码来自免疫细胞的第一和第二tcr肽链的同源对；并且其中所述多个融合的tcr多核苷酸包含来自至少20个不同v基因的v区域。在一些实施方案中，所述多个载体包含至少50、至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少10,000、至少100,000或至少1,000,000个不同的同源对。在一些实施方案中，所述多个载体包含至少约5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500或10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000或更多个不同的同源对。在一些实施方案中，所述多个载体包含至少50、至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000个不同的序列。在一些实施方案中，至少20个不同的v基因包含至少10个不同的trav基因亚组和/或至少10个不同的trbv基因亚组。

15、根据另一方面，本文提供了一种组合物，其包括多个水凝胶颗粒或珠，所述多个水凝胶颗粒或珠中的每个水凝胶颗粒或珠包含：第一核酸分子及其编码第一免疫受体肽链的第一可变结构域的第一扩增产物，其中第一可变结构域包括cdr3，和第二核酸分子及其编码第二免疫受体肽链的第二可变结构域的第二扩增产物，其中第二可变结构域包括cdr3，其中第一扩增产物和第二扩增产物嵌入或包埋在具有聚合或胶凝化的多个聚合物和/或单体的基质内，其中第一扩增产物和第二扩增产物的扩散受到限制。

16、根据另一方面，本文体提供了一种组合物，其包括多个水凝胶颗粒或珠，所述多个水凝胶颗粒或珠中的每个水凝胶颗粒或珠包含第一核酸分子及其编码第一免疫受体肽链的第一可变结构域的第一引物延伸产物，其中第一可变结构域包括cdr3，和第二核酸分子及其编码第二免疫受体肽链的第二可变结构域的第二引物延伸产物，其中第二可变结构域包括cdr3，其中第一引物延伸产物和第二引物延伸产物嵌入或包埋在具有聚合或胶凝化的多个聚合物和/或单体的基质内，其中第一引物延伸产物和第二引物延伸产物的扩散受到限制。

17、在一些实施方案中，第一和第二引物延伸产物包含具有预设计序列的接头。在一些实施方案中，接头不与第一或第一核酸杂交或互补。在一些实施方案中，接头包含模板转换寡核苷酸的序列或反向互补序列。在一些实施方案中，第一和第二引物延伸产物是逆转录(rt)产物。在一些实施方案中，第一和第二引物延伸产物是第二链合成(sss)产物。在一些实施方案中，rt产物与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，sss产物与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，sss产物与扩散限制剂间接连接。在一些实施方案中，第一和第二引物延伸产物是第一和第二扩增产物。在一些实施方案中，第一扩增产物和/或第二扩增产物与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，第一扩增产物和/或第二扩增产物通过捕获剂与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，捕获剂包含寡核苷酸，该寡核苷酸具有与第一扩增产物和/或第二扩增产物的衔接子序列互补的序列。

18、在一些实施方案中，扩散限制剂是聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚丙烯酰胺、聚乙二醇或多糖。在一些实施方案中，扩散限制剂是颗粒。在一些实施方案中，所述颗粒的直径大于基质的孔径。在一些实施方案中，扩散限制剂是基质。在一些实施方案中，第一多核苷酸分子和第二核酸分子是从细胞中释放出来的。在一些实施方案中，细胞是单个细胞。在一些实施方案中，细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞是t细胞或b细胞。在一些实施方案中，t细胞是cd3+t细胞、cd28+t细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞、cd45ra+t细胞、cd45ro+t细胞或其任意组合。在一些实施方案中，b细胞是浆母细胞、浆细胞、淋巴浆细胞样细胞、记忆性b细胞、滤泡性b细胞、边缘区b细胞、b-1细胞、b-2细胞或调节性b细胞。在一些实施方案中，第一免疫受体肽链是tcrα肽链，第二免疫受体肽链是tcrβ肽链。在一些实施方案中，第一免疫受体肽链是tcrγ肽链，第二免疫受体肽链是tcrδ肽链。在一些实施方案中，第一免疫受体肽链是免疫球蛋白重肽链，第二免疫受体肽链是免疫球蛋白轻肽链。在一些实施方案中，第一免疫受体肽链和第二免疫受体肽链是二分免疫受体的同源对。在一些实施方案中，第一扩增产物和第二扩增产物连接，形成连续的多核苷酸链。在一些实施方案中，第一扩增产物和/或第二扩增产物包含第一核酸分子和/或第二核酸分子的至少100、至少500、至少1000、至少10000或更多个拷贝。在一些实施方案中，第一或第二核酸受到扩散限制。在一些实施方案中，第一核酸分子和/或第二核酸分子是脱氧核糖核酸或核糖核酸。在一些实施方案中，第一核酸分子和/或第二核酸分子是单链核酸或双链核酸。在一些实施方案中，第一核酸分子还编码第一恒定结构域和/或第二核酸分子还编码第二恒定结构域。在一些实施方案中，第一恒定结构域是第一胞外恒定结构域，和/或第二恒定结构域是第二胞外恒定结构域。在一些实施方案中，第一恒定结构域包括第一胞外恒定结构域、第一交联区、第一跨膜区和第一细胞质尾区，和/或第二恒定结构域包括第二胞外恒定结构域、第二交联区、第二跨膜区和第二细胞质尾区。

19、在一些实施方案中，所述多个水凝胶颗粒或珠包括至少50、至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000个水凝胶颗粒或珠。在一些实施方案中，所述多个水凝胶颗粒或珠包含至少50、至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000个不同的二分免疫受体同源对。在一些实施方案中，聚合物是多糖、聚丙烯酰胺或其组合。在一些实施方案中，多糖是琼脂糖、透明质酸、羧甲基纤维素、壳聚糖、淀粉、葡聚糖或海藻酸盐。在一些实施方案中，单体是丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体。在一些实施方案中，聚合或胶凝化的多个聚合物和/或单体包括琼脂糖和聚丙烯酰胺的混合物。在一些实施方案中，聚合或胶凝化的多个聚合物和/或单体交联。在一些实施方案中，第一可变结构域和/或第二可变结构域还包括cdr1、cdr2或其组合。在一些实施方案中，每个水凝胶颗粒或珠是琼脂糖凝胶颗粒。

20、根据另一方面，本文提供了一种组合物，其包括多个至少5个水凝胶颗粒，其中每个所述至少5个水凝胶颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)包含编码第一免疫受体肽链的序列的第一多核苷酸和(b)包含编码第二免疫受体肽链的序列的第二多核苷酸，其中第一和第二免疫受体肽链中的每个包含唯一的同源免疫受体成对链，其中至少5个水凝胶颗粒中的单个水凝胶颗粒的第一多核苷酸和第二多核苷酸来自单个细胞，并且(ii)彼此连接；并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸从水凝胶颗粒中的扩散受到限制。在一些实施方案中，第一多核苷酸或第二多核苷酸是dna。在一些实施方案中，dna是扩增产物。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸共价连接。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸通过磷酸二酯键连接。在一些实施方案中，第一多核苷酸或第二多核苷酸与扩散限制剂连接。

21、根据另一发面，本文提供了一种组合物，其包含多个至少5个水凝胶颗粒，其中每个所述至少5个水凝胶颗粒包含(a)第一rna，所述第一rna包含编码第一免疫受体肽链的序列和(b)第二rna，所述第二rna包含编码第二免疫受体肽链的序列，其中第一和第二免疫受体肽链中的每个包含唯一的同源免疫受体成对链，其中所述至少5个水凝胶颗粒中的单个水凝胶颗粒的每个第一多核苷酸和第二多核苷酸来自单个细胞，并且其中(1)每个第一rna与包含第一rna的反向互补序列的第一cdna杂交和(2)每个第二rna与包含第二rna的反向互补序列的第二cdna杂交；并且其中来自水凝胶颗粒的第一cdna和第二cdna受到限制。在一些实施方案中，第一cdna或第二cdna还包含不与第一rna或第二rna杂交或互补的序列。在一些实施方案中，第一cdna或第二cdna还包含模板转换寡核苷酸的反向互补序列。在一些实施方案中，第一cdna或第二cdna与扩散限制剂连接。

22、根据另一方面，本文提供了一种组合物，其包含多个至少5个水凝胶颗粒，其中每个所述至少5个水凝胶颗粒包含(a)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸包含编码第一免疫受体肽链的序列和(b)第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含编码第二免疫受体肽链的序列，其中每个第一和第二免疫受体肽链包含唯一的同源免疫受体成对链，其中所述至少5个水凝胶颗粒中的单个水凝胶颗粒的每个第一多核苷酸和第二多核苷酸来自单个细胞，并且其中(1)每个第一多核苷酸与第一引物杂交和(2)每个第二多核苷酸与第二引物杂交；并且其中第一引物和第二引物从水凝胶颗粒中的扩散受到限制。

23、在一些实施方案中，第一引物或第二引物是逆转录引物。在一些实施方案中，第一引物或第二引物是扩增引物。在一些实施方案中，第一多核苷酸或第二多核苷酸是rna。在一些实施方案中，第一多核苷酸或第二多核苷酸是dna。在一些实施方案中，第一引物或第二引物与扩散限制剂连接。

24、根据另一方面，本文提供了一种组合物，其包含多个至少5个水凝胶颗粒，其中每个所述至少5个水凝胶颗粒包含(a)第一dna，所述第一dna包含编码第一免疫受体肽链的序列，和(b)第二dna，所述第二dna包含编码第二免疫受体肽链的序列，其中第一和第二免疫受体肽链中的每个包括唯一的同源免疫受体成对链，其中所述至少5个水凝胶颗粒中的单个水凝胶颗粒的每个第一dna和第二dna来自单个细胞，并且其中(1)每个第一dna与包含编码第一免疫受体链的序列的反向互补序列的第一多核苷酸杂交和(2)每个第二dna与包含编码第二免疫受体链的序列的反向互补序列的第二多核苷酸杂交；并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸从水凝胶颗粒中的扩散受到限制。

25、在一些实施方案中，第一dna或第二dna是cdna。在一些实施方案中，第一dna或第二dna是基因组dna。在一些实施方案中，第一多核苷酸或第二多核苷酸是rna。在一些实施方案中，rna是信使rna。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸从水凝胶颗粒中的扩散受到限制。在一些实施方案中，第一多核苷酸或第二多核苷酸是扩增产物。在一些实施方案中，扩增产物包含不与第一或第二dna杂交或互补的接头。在一些实施方案中，所述接头进一步与捕获剂杂交。在一些实施方案中，捕获剂与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，扩散限制剂是聚合物或颗粒。在一些实施方案中，第一和第二免疫受体肽链是tcrα和tcrβ肽链、tcrγ和tcrδ肽链或bcr重和轻肽链。在一些实施方案中，单个细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是t细胞或b细胞。

26、根据另一方面，本文提供了一种制备融合的二分免疫受体多核苷酸文库的方法，其包括：(a)生成多个容器，每个容器包括(1)细胞，其中所述细胞包含编码二分免疫受体的第一肽链的第一核酸和编码二分免疫受体的第二肽链的第二核酸和(2)多个可聚合或可胶凝聚合物和/或单体；以及(b)将所述多个可聚合或可胶凝聚合物和/或单体聚合或胶凝化，形成多个硬化颗粒，所述多个硬化颗粒中的每个硬化颗粒具有由聚合或胶凝化的多个聚合物和/或单体构成的基质，其中所述多个硬化颗粒中的每个硬化颗粒包括第一核酸的第一引物延伸产物和第二核酸的第二引物延伸产物；其中所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物嵌入或包埋在基质内，并且其中所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物的扩散受到限制。

27、在一些实施方案中，第一和第二引物延伸产物是逆转录(rt)产物、第二链合成(sss)产物或扩增产物。在一些实施方案中，第一和/或第二引物延伸产物包含衔接子序列。在一些实施方案中，衔接子序列不与第一或第二核酸分子杂交或互补。在一些实施方案中，第一和第二引物延伸产物编码可变结构域。在一些实施方案中，可变结构域包括cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方案中，第一和/或第二引物延伸产物还编码恒定结构域。

28、在一些实施方案中，所述方法还包括裂解细胞以释放第一核酸和第二核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括逆转录第一核酸和第二核酸。在一些实施方案中，使用rt引物进行逆转录。在一些实施方案中，rt引物与扩散限制剂连接，其中扩散限制剂限制rt引物在基质内的扩散。在一些实施方案中，所述方法还包括进行模板转换反应或sss反应。在一些实施方案中，所述方法还包括扩增第一核酸和第二核酸以生成第一和第二扩增产物。在一些实施方案中，对于每个第一或第二核酸来说，使用第一扩增引物和第二扩增引物进行扩增。在一些实施方案中，第一扩增引物与扩散限制剂连接，其中扩散限制剂限制第一扩增引物在基质内的扩散。

29、在一些实施方案中，所述方法还包括清洗多个硬化颗粒。在一些实施方案中，所述方法还包括清洗多个硬化颗粒以使试剂从多个硬化颗粒中扩散出来。在一些实施方案中，所述试剂包含rt引物、扩增引物、模板转换引物、sss引物或其任意组合。在一些实施方案中，所述方法还包括反复清洗多个硬化颗粒。在一些实施方案中，所述方法还包括在清洗步骤后在油中乳化多个硬化颗粒，从而形成另外的多个容器，所述另外的多个容器中的每个容器包括多个硬化颗粒中的单个硬化颗粒。在一些实施方案中，第一和第二引物延伸产物与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，扩散限制剂是聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚丙烯酰胺、聚乙二醇或多糖。在一些实施方案中，扩散限制剂是颗粒。在一些实施方案中，颗粒的直径大于基质的孔径。在一些实施方案中，扩散限制剂是基质。在一些实施方案中，第一和第二引物延伸产物通过捕获剂与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，捕获剂包括固定化部分。在一些实施方案中，固定化部分将捕获剂与扩散限制剂连接。

30、在一些实施方案中，固定化部分包括反应性基团。在一些实施方案中，捕获剂还包括靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分是捕获寡核苷酸。在一些实施方案中，第一扩增引物包含与捕获寡核苷酸杂交的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，第一和第二扩增产物包含与捕获寡核苷酸杂交的寡核苷酸序列，从而将第一和第二扩增产物与捕获剂连接并且从而与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，反应性基团是琥珀酰亚胺酯、酰胺、丙烯酰胺、酰基叠氮化物、酰基卤化物、酰基腈、醛、酮、烷基卤化物、烷基磺酸盐、酸酐、芳基卤化物、氮杂环丙烷、硼酸盐、碳二亚胺、重氮烷、环氧化物、卤代乙酰胺、卤代铂、卤代三嗪、亚胺酯、异氰酸酯，异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磷酰胺、硅卤化物、磺酸酯、磺酰卤化物、胺、苯胺、硫醇、醇、苯酚、杂环、羟胺、羧酸、乙二醇或杂环。在一些实施方案中，所述方法还包括将第一扩增产物与第二扩增产物连接以在多个另外的容器中的每个容器内形成融合的二分免疫受体多核苷酸，从而生成具有多个融合的二分免疫受体多核苷酸的融合的二分免疫受体多核苷酸文库。在一些实施方案中，第一扩增产物和第二扩增产物通过连接反应(1igation)或pcr来连接。在一些实施方案中，第一扩增产物和第二扩增产物通过磷酸二酯键连接，形成连续的多核苷酸。在一些实施方案中，第一扩增产物和第二扩增产物是框内连接。

31、在一些实施方案中，所述方法还包括从另外的多个容器中释放融合的二分免疫受体多核苷酸。

32、在一些实施方案中，所述方法还包括使多个融合的二分免疫受体多核苷酸中的每个融合的二分免疫受体多核苷酸环化。在一些实施方案中，所述方法还包括将多个融合的二分免疫受体多核苷酸中的每个融合的二分免疫受体多核苷酸插入载体中。在一些实施方案中，载体是自扩增rna复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体源自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、α病毒、痘苗病毒、乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或其伪型。在一些实施方案中，载体是非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体是纳米颗粒、阳离子脂质、阳离子聚合物、金属纳米聚合物、纳米棒、脂质体、胶束、微泡、细胞穿透肽或脂球。在一些实施方案中，二分免疫受体是t细胞受体(tcr)或b细胞受体(bcr)。在一些实施方案中，tcr包含tcrα肽链和tcrβ肽链或tcrγ肽链和tcrδ肽链；bcr包含重肽链和轻肽连。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是t细胞或b细胞。在一些实施方案中，t细胞是炎性t细胞、细胞毒性t细胞、调节性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞或其组合。在一些实施方案中，t细胞是cd4+t细胞或cd8+t细胞。在一些实施方案中，b细胞是浆母细胞、浆细胞、淋巴浆细胞样细胞、记忆b细胞、滤泡b细胞、边缘区b细胞、b-1细胞、b-2细胞或调节性b细胞。在一些实施方案中，免疫细胞分离自肿瘤组织或血液样品。在一些实施方案中，所述方法还包括将融合的二分免疫受体多核苷酸递送至宿主细胞中。在一些实施方案中，融合的二分免疫受体多核苷酸文库包含至少50、至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000个不同的融合二分免疫受体序列。在一些实施方案中，第一肽链和第二肽链是二分免疫受体的同源对。在一些实施方案中，容器是液滴。在一些实施方案中，液滴是油包水液滴。在一些实施方案中，硬化颗粒是水凝胶颗粒。在一些实施方案中，聚合物是多糖、聚丙烯酰胺或其组合。在一些实施方案中，多糖是琼脂糖、透明质酸、羧甲基纤维素、壳聚糖或海藻酸盐。在一些实施方案中，单体是丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体。在一些实施方案中，聚合或胶凝化的多个聚合物和/或单体包括琼脂糖和聚丙烯酰胺的混合物。在一些实施方案中，聚合或胶凝化的多个聚合物和/或单体交联。在一些实施方案中，聚合或胶凝化的多个可聚合或可胶凝聚合物和/或单体包括使用引发剂。在一些实施方案中，引发剂是uv光或化学品。在一些实施方案中，聚合或胶凝化多个可聚合或可胶凝聚合物和/或单体包括降低容器的温度。

33、根据另一方面，本文提供了一种在液体中进行的方法，其包括：(a)使与核酸分子杂交的第一寡核苷酸延伸，从而形成第一延伸产物；(b)用包含第一引物和第二引物的引物组扩增第一延伸产物或其反向互补链，从而形成第一扩增产物；(c)在液体中生成聚合物基质以形成水凝胶颗粒，从而限制第一扩增产物的扩散；以及(d)清洗水凝胶颗粒，从而从水凝胶颗粒中去除第二引物。在一些实施方案中，第一引物或第一扩增产物与扩散限制剂连接。

34、根据另一方面，本文提供了一种在液体中进行的方法，其包括：(a)使与核酸分子杂交的第一寡核苷酸延伸，从而形成第一延伸产物；(b)在液体中生成聚合物基质以形成是水凝胶颗粒，从而限制第一延伸产物或其反向互补链的扩散；(c)清洗水凝胶颗粒；以及(d)用包含第一引物和第二引物的引物组扩增第一延伸产物或其反向互补链，从而形成第一扩增产物。

35、在一些实施方案中，第一寡核苷酸或第一延伸产物与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，该方法还包括使与另一核酸分子杂交的第二寡核苷酸延伸。在一些实施方案中，核酸分子和另一核酸分子编码免疫受体的第一肽链和第二肽链，其中第一肽链和第二肽链是免疫受体的同源对。在一些实施方案中，扩散限制剂是聚合物或颗粒。在一些实施方案中，聚合物是聚丙烯酰胺、聚乙二醇或多糖。在一些实施方案中，颗粒的直径大于聚合物基质的孔径。在一些实施方案中，扩散限制剂是聚合物基质。在一些实施方案中，核酸分子是dna或rna。在一些实施方案中，核酸分子是基因组dna。在一些实施方案中，核酸分子是信使rna。在一些实施方案中，第一寡核苷酸是逆转录(rt)引物。在一些实施方案中，所述方法还包括用模板转换寡核苷酸使rt引物延伸，从而生成具有模板转换寡核苷酸的反向互补序列的第一延伸产物。在一些实施方案中，所述方法还包括使用具有衔接子序列的第二链合成(sss)引物合成第一延伸产物的反向互补链。在一些实施方案中，衔接子序列不与核酸分子或第一延伸产物杂交或互补。在一些实施方案中，第一延伸产物包含衔接子序列。在一些实施方案中，核酸分子编码免疫受体的肽链。在一些实施方案中，所述方法还包括在清洗水凝胶颗粒之后或期间使试剂与水凝胶颗粒接触，以使试剂扩散至水凝胶颗粒中。在一些实施方案中，试剂是寡核苷酸或酶。在一些实施方案中，酶是聚合酶。在一些实施方案中，所述方法还包括在清洗后在油中乳化水凝胶颗粒。

36、根据另一方面，本文提供了一种在液体中进行的方法，其包括：(a)形成多个液滴，其中所述多个液滴中的至少2个液滴包括单个细胞；(b)使与来自单个细胞的第一核酸分子杂交的第一寡核苷酸延伸，从而形成第一延伸产物；和使与来自单个细胞的第二核酸分子杂交的第二寡核苷酸延伸，从而形成第二延伸产物；(c)用包含第一引物和第二引物的第一引物组扩增第一延伸产物或其反向互补链，从而形成第一组扩增产物；和用包含第三引物和第四引物的第二引物组扩增第二延伸产物或其反向互补链，从而形成第二组扩增产物；以及(d)将第一组扩增产物中的扩增产物与第二组扩增产物中的扩增产物连接，其中连接包括在不存在第二和第四引物的情况下在液体中进行连接。

37、根据另一方面，本文提供了一种在液体中进行的方法，其包括：(a)形成多个液滴，其中所述多个液滴中的至少2个液滴包括单个细胞；(b)使与来自单个细胞的第一核酸分子杂交的第一寡核苷酸延伸，从而形成第一延伸产物；和使与来自单个细胞的第二核酸分子杂交的第二寡核苷酸延伸，从而形成第二延伸产物；(c)用包含第一引物和第二引物的第一引物组扩增第一延伸产物或其反向互补链，从而形成第一组扩增产物；和用包含第三引物和第四引物的第二引物组扩增第二延伸产物或其反向互补链，从而形成第二组扩增产物；(d)去除第二和第四引物；和将第一组扩增产物中的扩增产物与第二组扩增产物中的扩增产物连接。

38、在一些实施方案中，每个液滴包含多个可聚合或胶凝化聚合物和/或单体。在一些实施方案中，所述方法还包括在液体中生成聚合物基质以形成水凝胶颗粒，从而限制第一组扩增产物和第二组扩增产物的扩散。在一些实施方案中，所述方法还包括清洗水凝胶颗粒，从而从水凝胶颗粒中去除第二引物和第四引物。在一些实施方案中，连接包括在第一和第二组扩增产物上生成粘性末端。在一些实施方案中，使用user酶在扩增产物上生成粘性末端。在一些实施方案中，连接包括使第一和第二组扩增产物杂交。在一些实施方案中，连接包括将第一和第二组扩增产物连接。在一些实施方案中，第一引物和第三引物是同一引物。在一些实施方案中，第一引物、第三引物、第一组扩增产物或第二组扩增产物与扩散限制剂连接。

39、根据另一方面，本文提供了一种在液体中进行的方法，其包括：(a)形成多个液滴，其中多个滴液中的至少两个液滴包含单个细胞；(b)使与来自单个细胞的第一核酸分子杂交的第一寡核苷酸延伸，从而形成第一延伸产物；并且使与来自单个细胞的第二核酸分子杂交的第二寡核苷酸延伸，从而形成第二延伸产物；(c)在液体中形成聚合物基质，形成水凝胶颗粒，从而限制第一延伸产物和第二延伸产物的扩散；(d)用包含第一引物和第二引物的第一引物组扩增第一延伸产物或其反向互补链，从而形成第一组扩增产物；并且用包含第三引物和第四引物的第二引物组扩增第二延伸产物或其反向互补链，从而形成第二组扩增产物；以及(e)将第一组扩增产物中的扩增产物与第二组扩增产物中的扩增产物连接。

40、在一些实施方案中，该方法还包括在(c)后清洗水凝胶颗粒。在一些实施方案中，该方法还包括使试剂与水凝胶颗粒接触，以使试剂扩散至水凝胶颗粒中。在一些实施方案中，寡核苷酸包含第一引物组和/第二引物组。在一些实施方案中，酶是聚合酶、连接酶、user酶或其组合。在一些实施方案中，该方法还包括在清洗后在油中乳化水凝胶颗粒。在一些实施方案中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与扩散限制剂连接。在一些实施方案中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸是rt引物。在一些实施方案中，该方法还包括使用第二链(sss)引物来合成第一和/或第二延伸产物的反向互补链。在一些实施方案中，sss引物包含衔接子序列。在一些实施方案中，衔接子序列不与第一和/或第二延伸产物杂交或互补。在一些实施方案中，该方法还包括用模板转换寡核苷酸延伸rt引物。在一些实施方案中，单个细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是t细胞或b细胞。在一些实施方案中，第一核酸分子和第二核酸分子是dna或rna。在一些实施方案中，dna是基因组dna。在一些实施方案中，rna是信使rna。在一些实施方案中，第一核酸分子编码免疫受体的第一肽链，第二核酸分子编码免疫受体的第二肽链。在一些实施方案中，第一肽链和第二肽链是免疫受体的同源对。在一些实施方案中，第一肽链或第二肽链包含可变结构域。在一些实施方案中，可变结构域包括cdr1、cdr2、cdr3或其组合。在一些实施方案中，第一肽链或第二肽链包含恒定结构域。在一些实施方案中，第一肽链或第二肽链包含跨膜区和/或细胞质尾。在一些实施方案中，免疫受体是b细胞受体。在一些实施方案中，免疫受体是t细胞受体。在一些实施方案中，扩散限制剂是聚合物或颗粒。在一些实施方案中，聚合物是聚丙烯酰胺、多糖或聚乙二醇。在一些实施方案中，颗粒的直径大于水凝胶颗粒的孔径。在一些实施方案中，扩散限制剂是聚合物基质。在一些实施方案中，连接包括在第一和第二组扩增产物上生成粘性末端。在一些实施方案中，在扩增产物上生成粘性末端包括使用user酶。在一些实施方案中，连接包括将第一和第二组扩增产物杂交。在一些实施方案中，连接包括连接第一和第二组扩增产物。

41、根据另一方面，本文提供了一种方法，其包括：(a)获得宿主细胞群，该群中的每个宿主细胞表达具有天然配对的tcrα和β肽链的tcr或具有天然配对的bcr重和轻肽链的bcr；富集(i)来自该群中的宿主细胞亚群，或(ii)来自该群的宿主细胞亚群的被表达tcr或bcr，其中宿主细胞亚群或宿主细胞亚群的被表达tcr或bcr与靶抗原或靶mhc-抗原复合物结合；以及(b)向表达靶抗原或靶mhc-抗原复合物的受试者中施用从步骤(b)中富集的宿主细胞亚群或该亚群的被表达tcr或bcr。

42、在一些实施方案中，获得包括使用本文所述方法中的任意一种。在一些实施方案中，(b)包括使宿主细胞亚群或被表达tcr或bcr与靶抗原或靶mhc-抗原复合物接触。在一些实施方案中，mhc是mhc四聚体。在一些实施方案中，(c)包括通过注射进行施用。在一些实施方案中，注射包括静脉注射、皮下注射、皮内注射或肌肉注射。在一些实施方案中，靶抗原是新生抗原或肿瘤相关抗原。

43、根据另一方面，本文提供了一种方法，其包括：(1)提供多个至少1,000个细胞，至少1,000个细胞中的每个细胞包含tcrα链和tcrβ链；(2)提供多个至少1,000个隔室，至少1,000个隔室中的每个隔室包含固体支持物，其中固体支持物包括：(a)第一多核苷酸，其包含第一共同序列、第二共同序列和在第一共同序列和第二共同序列之间编码tcrα链的蛋白编码序列，和(b)第二多核苷酸，其包含第三共同序列、第四共同序列和在第三共同序列和第四共同序列之间编码tcrβ链的蛋白编码序列，其中每个隔室中的tcrα链和tcrβ链是存在于多个细胞中的至少一个中的同源对，从而提供各自编码tcrα链的第一多个蛋白编码序列和各自编码tcrβ链的第二多个蛋白编码序列；以及(3)将每个隔室中的第一多核苷酸和第二多核苷酸在物理上连接。在一些实施方案中，第一多个蛋白编码序列包括至少10个trav亚组，第二多个蛋白编码序列包括至少10个trbv亚组。在一些实施方案中，至少1,000个隔室中的每个隔室包含来自多个至少1,000个细胞中的细胞。在一些实施方案中，隔室是孔、微孔或液滴。在一些实施方案中，固体支持物是珠、水凝胶颗粒或者是孔或微孔的表面。在一些实施方案中，第一共同序列、第二共同序列、第三共同序列或第四共同序列在多个至少1,000个隔室中相同。

44、根据另一方面，本文提供了一种组合物，其包含多个至少1,000个隔室，至少1,000个隔室中的每个隔室包括固体支持物，其中固体支持物包含：(a)第一多核苷酸，其包含第一共同序列、第二共同序列以及编码第一和第二共同序列之间的tcrα链的蛋白编码序列，和(b)第二多核苷酸，其包含第三共同序列、第四共同序列以及编码第三和第四共同序列之间的tcrβ链的蛋白编码序列，其中(i)每个隔室中的tcrα链和tcrβ链是同源对，(ii)多个隔室中的多个第一共同序列具有相同的序列并且与第一引物杂交或互补，(iii)多个隔室中的多个第二共同序列具有相同的序列并且与第二引物杂交或互补，(iv)多个隔室中的多个第三共同序列具有相同的序列并且与第三引物杂交或互补和(v)多个隔室中的多个第四共同序列具有相同的序列并且与第四引物杂交或互补。

45、在一些实施方案中，每个隔室还包含第一引物、第二引物、第三引物和第四引物。在一些实施方案中，第一引物的浓度是至少1nm，第二引物的浓度是至少1nm，第三引物的浓度是至少1nm，第四引物的浓度是至少1nm。在一些实施方案中，第二共同序列与每个隔室中的第四共同序列或其反向互补序列杂交或互补。

46、根据另一方面，本文提供了一种组合物，其包含多个至少1,000个隔室，至少1,000个隔室中的每个隔室包含：(a)第一全部或部分单链多核苷酸，其包含5’端的第一共同序列、第3’端的第二共同序列以及编码第一和第二共同序列之间的tcrα链的蛋白编码序列，和(b)第二全部或部分单链多核苷酸，其包含5’端的第三共同序列、第3’端的第四共同序列以及编码第三和第四共同序列之间的tcrβ链的蛋白编码序列，其中(i)tcrα链和tcrβ链是同源对，和(ii)第二共同序列与第四共同序列杂交。在一些实施方案中，第一共同序列、第二共同序列、第三共同序列或第四共同序列在多个至少1,000个隔室中相同。在一些实施方案中，每个隔室还包含固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物是珠或水凝胶颗粒。

47、根据另一方面，本文提供了一种鉴定靶反应性t细胞受体(tcr)的方法，其包括：(a)提供表达多个tcr的多个t细胞，其中多个t细胞中的每个t细胞表达多个tcr中的tcr的同源对；(b)将多个t细胞分配至多个隔室，其中每个隔室包含多个t细胞中的单个t细胞；(c)在每个隔室内，将编码单个t细胞的tcr的同源对的第一tcr链的第一多核苷酸和编码单个t细胞的tcr的同源对的第二tcr链的第二多核苷酸连接，从而生成多个融合的多核苷酸，其中(i)第一多核苷酸和第二多核苷酸是单个t细胞的内源性核酸的转录产物或扩增产物或者(ii)第一多核苷酸和第二多核苷酸不是使用亚磷酰胺化学合成的；(d)生成包含多个融合的多核苷酸的多个载体，多个载体中的每个载体包含多个融合的多核苷酸中的融合的多核苷酸；(e)将多个载体递送至多个细胞中，其中多个细胞中的每个细胞包含多个载体中的至少一个载体；(f)在多个细胞中表达来自多个载体的多个融合的多核苷酸，其中多个细胞的子集表达多个靶反应性tcr；(g)使多个细胞与一个或多个靶抗原接触，其中表达多个靶反应性tcr的多个细胞的子集与一个或多个靶抗原结合；以及(h)鉴定多个细胞的子集的多个靶反应性tcr中的靶反应性tcr。

48、根据另一方面，本文提供了一种鉴定靶反应性t细胞受体(tcr)的方法，其包括：(a)提供表达多个tcr的多个t细胞，其中多个t细胞中的每个t细胞表达多个tcr中的tcr的同源对；(b)将多个t细胞分配至多个隔室，其中每个隔室包含多个t细胞中的单个t细胞；(c)在每个隔室内，将编码单个t细胞的tcr的同源对的第一tcr链的第一多核苷酸和编码单个t细胞的tcr的同源对的第二tcr链的第二多核苷酸连接，从而生成多个融合的多核苷酸，其中(i)第一多核苷酸和第二多核苷酸是单个t细胞的内源性核酸的转录产物或扩增产物或者(ii)第一多核苷酸和第二多核苷酸不是使用亚磷酰胺化学合成的；(d)将多个融合的多核苷酸递送至多个细胞中，其中多个细胞中的每个细胞包含多个融合的多核苷酸中的至少一个融合的多核苷酸；(e)在多个细胞中表达来自多个载体的多个融合的多核苷酸，其中多个细胞的子集表达多个靶反应性tcr；(f)使多个细胞与一个或多个靶抗原接触，其中表达多个靶反应性tcr的多个细胞的子集与一个或多个靶抗原结合；以及(g)鉴定多个细胞的子集的多个靶反应性tcr中的靶反应性tcr。

49、在一些情况下，该方法还包括在递送前生成包含多个融合的多核苷酸的多个载体，多个载体中的每个载体包含多个融合的多核苷酸中的融合的多核苷酸。在一些情况下，多个细胞是多个受体细胞。在一些情况下，内源性核酸是脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。在一些情况下，dna是基因组dna。在一些情况下，rna是信使rna。在一些情况下，接触还包括使细胞群与呈递一个或多个靶抗原的一个或多个细胞接触。在一些情况下，一个或多个细胞是一个或多个肿瘤细胞、肿瘤球体、肿瘤裂解物脉冲的抗原呈递细胞(apc)或工程化为呈递一个或多个靶抗原的apc。在一些情况下，与编码靶抗原的dna或rna的dna或rna递送(例如，转染或电穿孔)工程化为呈递一个或多个靶抗原的一个或多个apc。在一些情况下，接触还包括使细胞群与肿瘤组织接触。在一些情况下，一个或多个靶抗原与主要组织相容性复合体(mhc)复合。在一些情况下，mhc是mhc四聚体。在一些情况下，第一tcr链是tcrα链，第二tcr链是tcrβ链。在一些情况下，第一tcr链是tcrγ链，第二tcr链是tcrδ链。在一些情况下，多个细胞是细胞系细胞。在一些情况下，细胞系细胞是cho-k1细胞；hek293细胞；caco2细胞；u2-os细胞；nih 3t3细胞；nso细胞；sp2细胞；cho-s细胞；dg44细胞；k-562细胞，u-937细胞；mrc5细胞；imr90细胞；jurkat细胞；hepg2细胞；hela细胞；ht-1080细胞；hct-116细胞；hu-h7细胞；huvec细胞；或molt4细胞。在一些情况下，多个细胞分离自来自受试者的样品。在一些情况下，多个t细胞分离自来自受试者的样品。在一些情况下，样品是肿瘤组织、血液样品，外周血单核细胞(pbmc)样品或其组合。在一些情况下，肿瘤组织最多为约2000mm3。在一些情况下，血液样品包含外周血核细胞(pbmc)。在一些情况下，多个t细胞是肿瘤浸润性t细胞或外周t细胞。在一些情况下，多个t细胞包括cd8+t细胞、cd4+t细胞、耗尽型t细胞、调节性t细胞或其任意组合。在一些情况下，该方法还包括分离多个细胞的子集中的至少一个细胞。在一些情况下，通过facs分离多个细胞的子集中的至少一个细胞。在一些情况下，基于标志物分离多个细胞的子集中的至少一个细胞。在一些情况下，标志物是细胞表面标志物或细胞因子。在一些情况下，细胞表面标志物是cd39、cd69、cd103、cd25、pd-1、tim-3、ox-40、4-1bb、cd137、cd3、cd28、cd4、cd8、cd45ra、cd45ro、gitr、foxp3或其组合。在一些情况下，细胞因子是ifn-γ、tnf-α、il-17a、il-2、il-3、il-4、gm-csf、il-10、il-13、颗粒酶b、穿孔素或其组合。在一些情况下，该方法还包括(i)向受试者施用多个细胞的子集中的至少一个细胞或者(ii)向受试者施用包含所鉴定的靶反应性tcr的自体或同种异体细胞。在一些情况下，自体或同种异体细胞包含编码所鉴定的靶向反应性tcr的多核苷酸。在一些情况下，编码所鉴定的靶反应性tcr的多核苷酸是融合的多核苷酸或其扩增产物，或者包含编码融合的多核苷酸的第一tcr链和第二tcr链的序列。

50、根据另一方面，本文提供了一种鉴定多个靶反应性t细胞受体(tcrs)的方法，其包括：(a)提供表达多个tcr的多个细胞，多个细胞中的每个细胞表达多个tcr中的tcr，其中多个tcr包含至少50个不同的同源对和包含来自多个v基因的v区，并且其中多个tcr对多个细胞来说具有外源性；(b)使多个细胞与一个或多个靶抗原接触，其中表达多个靶反应性tcr的多个细胞的子集与一个或多个靶抗原接触；以及(c)鉴定多个细胞的子集中的至少2个细胞，所述至少2个细胞表达多个靶反应性tcr中的至少两个靶特异性tcr，从而鉴定出多个靶反应性tcr中的至少两个靶反应性tcr。

51、在一些情况下，多个v基因包括至少10个不同的v基因。在一些实施方案中，多个细胞是多个基因工程化的细胞。在一些情况下，多个细胞不分离自患者。在一些情况下，多个细胞分离自来自受试者的样品。在一些情况下，样品是组织样品，血液样品、pbmc样品或其组合。在一些情况下，多个细胞不包括耗尽型t细胞。在一些情况下，多个tcr包含至少100个不同的同源对。在一些情况下，该方法还包括分离多个细胞的子集中的至少两个细胞。在一些情况下，(b)包括使多个细胞与呈递一个或多个靶抗原的一个或多个细胞接触。在一些情况下，一个或多个细胞是一个或多个肿瘤细胞、肿瘤球体、肿瘤裂解物脉冲的抗原呈递细胞(apc)或工程化为呈递一个或多个靶抗原的apc。在一些情况下，工程化为呈递一个或多个靶抗原的一个或多个apc包含编码靶抗原的dna或rna。在一些情况下，(b)包括使多个细胞与肿瘤组织接触。在一些情况下，(b)包括使多个细胞与和主要组织相容性复合物(mhc)复合的一个或多个靶抗原接触。在一些情况下，mhc是mhc四聚体。在一些情况下，一个或多个靶抗原的序列或身份是未知的。在一些情况下，该方法还包括向受试者施用多个细胞的子集中的至少两个细胞中的至少一个。在一些情况下，多个细胞中的每个细胞包含报告基因，调节所述报告基因以在细胞的tcr与一个或多个靶抗原中的靶抗原结合时发送信号。在一些情况下，多个细胞是细胞系细胞。在一些情况下，多个tcr包含至少100个不同的vj组合。

52、根据另一方面，本文提供了一种治疗受试者中癌症的方法，其包括：(a)提供表达多个tcr的多个t细胞，其中多个t细胞中的每个t细胞表达多个tcr中的tcr的同源对；(b)将多个t细胞分配至隔室，其中每个隔室包含多个t细胞中的单个t细胞；(c)在每个隔室内，将编码单个t细胞的tcr的同源对的第一tcr链的第一多核苷酸和编码单个t细胞的tcr的同源对的第二tcr链的第二多核苷酸连接，从而生成多个融合的多核苷酸，其中(i)第一多核苷酸和第二多核苷酸是单个t细胞的内源性核酸的转录产物或扩增产物或(ii)第一多核苷酸和第二多核苷酸不是使用亚磷酰胺化学合成的；(d)将多个融合苷酸递送至多个细胞中，其中多个细胞中的每个细胞包含多个融合的多核苷酸中的至少一个融合的多核苷酸；(e)在多个细胞中表达多个融合的多核苷酸，其中多个细胞的子集表达来自多个融合多个苷酸的子集的多个反应性tcr；(f)从多个融合的多核苷酸的子集中鉴定出多个靶反应性tcr；(g)将多个融合的多核苷酸的子集中的一个或多个融合的多核苷酸或其衍生物递送至多个受体细胞中，其中多个受体细胞中的每个细胞包含多个融合的多核苷酸的子集中的一个或多个融合的多核苷酸或其衍生物中的至少一个；以及(h)(i)向受试者施用多个受体细胞中的至少一个受体细胞或者(ii)向受试者施用多个受体细胞中的至少两个受体细胞，其中至少两个受体细胞表达不同的tcr。

53、在一些情况下，多个t细胞是肿瘤浸润性t细胞或外周t细胞。在一些情况下，多个t细胞包括cd8+t细胞、cd4+t细胞、耗尽型t细胞、调节性t细胞或其任意组合。在一些情况下，多个t细胞被体外激活和/或扩增。在一些情况下，在多个载体中递送多个融合的多核苷酸，其中多个载体中的每个载体包含多个融合的多核苷酸中的融合的多核苷酸。在一些情况下，该方法还包括在(d)中进行递送之前生成多个载体。在一些情况下，(f)中的鉴定包括使多个细胞与一个或多个靶抗原接触，其中表达多个靶反应性tcr的多个细胞的子集与一个或多个靶抗原结合。在一些情况下，一个或多个靶抗原由一个或多个肿瘤细胞或抗原呈递细胞(apc)呈递。在一些情况下，一个或多个apc(i)由一个或多个靶抗原脉冲或者(ii)包含编码靶抗原的dna或rna。在一些情况下，一个或多个抗原中的每个抗原与主要组织相容性复合物(mhc)复合。在一些情况下，mhc是mhc四聚体。在一些情况下，该方法还包括在(g)进行递送之前分离多个细胞的子集中的一个或多个细胞。在一些情况下，该方法还包括从受试者中分离表达多个tcr的多个t细胞。在一些情况下，在分离多个t细胞后最多约60天、50天、40天、30天、20天或更少进行施用。在一些情况下，多个受体细胞是同种异体细胞、自体细胞或细胞系细胞。在一些情况下，多个细胞是基因工程化的细胞或细胞系细胞。在一些情况下，该方法还包括在(h)之前扩增多个受体细胞。在一些情况下，衍生物包含一个或多个融合的多核苷酸的序列。在一些情况下，衍生物是一个或多个融合的多核苷酸的扩增产物或合成产物。

54、根据另一方面，本文提供了一种治疗受试者中肿瘤的方法，其包括：(a)从表达多个t细胞受体(tcr)的受试者中分离多个t细胞，其中多个t细胞中的每个t细胞表达多个tcr中的tcr的同源对，其中多个tcr包括多个肿瘤反应性tcr；(b)从多个tcr中鉴定多个肿瘤反应性tcr；(c)将编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸递送至多个受体细胞中，其中多个受体细胞中的每个受体细胞包含编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸中的至少一个多核酸苷酸；(d)在多个受体细胞中表达多个肿瘤反应性tcr或其子集；以及(e)(i)向受试者施用多个受体细胞中的至少一个受体细胞或者(ii)向受试者施用多个受体细胞中的至少两个受体细胞，其中在(a)中分离多个t细胞后的最多约60天、50天、40天、30天、20天或更少天进行施用。

55、根据另一方面，本文提供了一种治疗受试者中肿瘤的方法，其包括：(a)从表达多个t细胞受体(tcr)的受试者中分离多个t细胞，其中多个t细胞中的每个t细胞表达多个tcr中的tcr的同源对，其中多个tcr包括多个肿瘤反应性tcr；(b)从多个tcr中鉴定多个肿瘤反应性tcr；(c)将编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸递送至多个受体细胞中，其中受体细胞中的每个受体细胞包含编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸中的至少一个多核苷酸；(d)在多个受体细胞中表达多个肿瘤反应性tcr或其子集；以及(e)(i)向受试者施用多个受体细胞中的至少一个受体细胞或者(ii)向受试者施用多个受体细胞中的至少两个受体细胞，其中至少两个受体细胞表达不同的tcr，其中从受试者中分离多个t细胞到向受试者施用多个受体细胞中的至少一个或至少两个受体细胞，受试者的肿瘤在超过约60天、50天、40天、30天、20天或更少天内未进展。

56、根据另一方面，本文提供了一种治疗受试者中肿瘤的方法，其包括：(a)从表达多个t细胞受体(tcr)的受试者中分离多个t细胞，其中多个t细胞中的每个t细胞表达多个tcr中的tcr的同源对，其中多个tcr包括多个肿瘤反应性tcr；(b)鉴定多个肿瘤反应从多个tcr中鉴定多个肿瘤反应性tcr；(c)将编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸递送至多个受体细胞中，其中多个受体细胞中的每个受体细胞包含编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸中的至少一个多核酸苷酸；(d)在多个受体细胞中表达多个肿瘤反应性tcr或其子集；以及(e)(i)向受试者施用多个受体细胞中的至少一个受体细胞或者(ii)向受试者施用多个受体细胞中的至少两个受体细胞，其中至少两个受体细胞表达不同的tcr，其中(i)肿瘤的大小已增加了低于约50％、30％、40％、20％、15％、10％、5％或2％，或者(ii)从分离多个t细胞到施用多个受体细胞中的至少一个或至少两个受体细胞，受试者中肿瘤细胞的数量未增加约2倍、3倍、4倍、5倍或更多。

57、根据另一方面，本文提供了一种治疗受试者中肿瘤的方法，其包括：(a)从表达多个t细胞的受试者中分离多个t细胞，其中多个t细胞中的每个t细胞表达多个tcr中的tcr的同源对，其中多个tcr包括多个肿瘤反应性tcr；(b)鉴定多个肿瘤反应从多个tcr中鉴定多个肿瘤反应性tcr；(c)将编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸递送至多个受体细胞中，其中多个受体细胞中的每个受体细胞包含编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸中的至少一个多核苷酸；(d)在多个受体细胞中表达多个肿瘤反应性tcr或其子集；以及(e)(i)向受试者施用多个受体细胞中的至少一个受体细胞或者(ii)向受试者施用多个受体细胞中的至少两个受体细胞，其中至少两个受体细胞表达不同的tcr，其中从分离多个t细胞到施用多个受体细胞中的至少一个或至少两个受体细胞，肿瘤不会进展到新的阶段。

58、根据另一方面，本文提供了一种治疗受试者中肿瘤的方法，其包括：(a)从表达多个t细胞受体(tcr)受试者中分离多个t细胞，其中多个t细胞中的每个t细胞表达多个tcr中的tcr的同源对，其中多个tcr包括多个肿瘤反应性tcr；(b)鉴定多个肿瘤反应从多个tcr中鉴定多个肿瘤反应性tcr；(c)将编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸递送至多个受体细胞中，其中多个受体细胞中的每个受体细胞包含编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸中的至少一个多核苷酸，其中(i)多核苷酸是内源性核酸的转录产物或扩增产物或者(ii)多核苷酸不是使用亚磷酰胺化学合成的；(d)在多个受体细胞中表达多个肿瘤反应性tcr或其子集；以及(e)(i)向受试者施用多个受体细胞中的至少两个受体细胞，其中至少两个受体细胞表达不同的tcr。

59、在一些情况下，该方法不包括使用亚磷酰胺化学合成编码多个肿瘤反应性tcr或其子集的多核苷酸。在一些情况下，多个t细胞是肿瘤浸润性t细胞或外周t细胞。在一些情况下，多个t细胞包括cd8+t细胞、cd4+t细胞、耗尽型t细胞、调节性t细胞或其任意组合。在一些情况下，多个受体细胞是同种异体t细胞、自体t细胞或细胞系细胞。在一些情况下，该方法还包括在(b)之前在多个报告子细胞中表达多个tcr。在一些情况下，表达包括通过病毒载体递送表达多个tcr的核酸序列。在一些情况下，病毒载体是慢病毒载体。在一些情况下，多个报告子细胞中的每个报告子细胞包含报告基因。在一些情况下，在(b)中，进行鉴定包括使多个tcr与一个或多个靶抗原或者呈递一个或多个靶抗原的细胞或组织接触。在一些情况下，一个或多个靶抗原由一个或多个肿瘤细胞或抗原呈递细胞(apc)呈递。在一些情况下，一个或多个apc包含编码靶抗原的dna或rna。在一些情况下，一个或多个靶抗原与mhc复合。在一些情况下，mhc是mhc四聚体。在一些情况下，多个tcr中的多个肿瘤反应性tcr包含tcr的至少2、5、10、15或20个不同的同源对。在一些情况下，多个肿瘤反应性tcr中的每个tcr对不同表位或不同蛋白具有特异性。在一些情况下，多个肿瘤反应性tcr中的每个tcr包含不同的(i)tcrαcdr3序列、(ii)tcrβcdr3可变结构域序列、(iii)tcrα可变结构域序列、(iv)tcrβ可变结构域序列，或者(v)包含tcrα和tcrβ可变结构域序列组合。在一些情况下，多个肿瘤反应性tcr与来自受试者的肿瘤细胞结合但不与来自受试者的健康细胞结合或者与来自受试者的健康细胞结合，其中对健康细胞的亲和力比对肿瘤细胞至少低10倍。在一些情况下，在(e)中施用的多个受体细胞所包括的细胞比(a)中分离的多个t细胞多至少10、至少20、至少50、至少100、至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少100,000或至少1,000,000倍。

60、根据另一方面，本文提供了一种治疗受试者中肿瘤的方法，其包括：(a)从表达t细胞受体(tcr)群的受试者中分离t细胞群，其中t细胞群包括最多约10,000个细胞；(b)从tcr群中鉴定多个肿瘤反应性tcr；以及(c)向受试者施用表达多个肿瘤反应性tcr或其子集的多个细胞，其中多个肿瘤反应性tcr或其子集包含至少2个不同的同源对。

61、根据另一方面，本文提供了一种治疗受试者中肿瘤的方法，其包括：(a)从tcr群中鉴定多个肿瘤反应性t细胞受体(tcr)，其中tcr群包含tcr的至少50个不同的同源对；以及(b)向受试者施用表达多个肿瘤反应性tcr或其子集的多个细胞，其中多个肿瘤反应性tcr或其子集包含至少50个不同的同源对中的至少5、至少10、至少15或至少20个不同的同源对，其中多个肿瘤反应性tcr对多个细胞具有外源性。在一些情况下，多个肿瘤反应性tcr或其子集包括至少5个tcr，并且其中至少5个tcr中的每个tcr(1)对不同的表位或不同的蛋白质具有特异性或者(2)包含不同的(i)tcrαcdr3序列、(ii)tcrβcdr3可变结构域序列、(iii)tcrα可变结构域序列、(iv)tcrβ可变结构域序列，或(v)tcrα和tcrβ可变结构域序列组合。

62、在一些情况下，该方法还包括：在(a)之前，从受试者中分离表达tcr群的t细胞群。在一些情况下，至少50个不同的同源对包含来自至少5、10、15或20个不同的v基因的v区。在一些情况下，鉴定包括通过标志物分离多个肿瘤反应性tcr。在一些情况下，表达多个肿瘤反应性tcr或其子集的多个细胞是多个同种异体细胞、自体细胞或细胞系细胞。在一些情况下，多个同种异体细胞表达与抑制性天然杀伤(nk)细胞受体结合的蛋白质。在一些情况下，该蛋白质是b2m-hla-e或b2m-hla-g融合蛋白。

63、根据另一方面，本文提供了一种鉴定靶特异性t细胞受体(tcr)的方法，其包括：(a)使来自第一样品的多个t细胞与包含来自受试者的肿瘤细胞的第二样品或第三样品接触，其中第三样品衍生自第二样品，并且其中第三样品包含：(i)来自第二样品的肿瘤细胞或编码靶抗原的核酸和mhc的靶抗原，(ii)在mhc中呈递靶抗原的细胞，或(iii)包含mhc和由核酸编码的蛋白产物的细胞，并且其中多个t细胞的子集与和mhc复合的靶抗原结合；(b)分离第一样品的多个t细胞的子集或其一部分；(c)将多个t细胞的子集或其一部分分配至多个隔室，其中每个隔室包含多个t细胞的子集或其一部分中的单个t细胞；以及(d)在每个隔室内，鉴定编码单个t细胞的tcr的同源对的第一tcr链的第一多核苷酸和编码单个t细胞的tcr的同源对的第二tcr链的第二多核苷酸，从而生成一个或多个配对的多核苷酸。

64、在一些情况下，进行鉴定包括将编码单个t细胞的tcr的同源对的第一tcr链的第一多核苷酸和编码单个t细胞的tcr的同源对的第二tcr链的第二多核苷酸物理上连接。在一些情况下，一个或多个配对的多核苷酸是一个或多个融合的多核苷酸。在一些情况下，鉴定包括对编码单个t细胞的tcr的同源对的第一tcr链的第一多核苷酸和编码单个t细胞的tcr的同源对的第二tcr链的第二多核苷酸测序。

65、在一些情况下，第一多核苷酸和第二多核苷酸不是使用亚磷酰胺化学合成的。在一些情况下，第一多核苷酸和第二多核苷酸是单个t细胞的内源性核酸的转录产物或扩增产物。在一些情况下，第一样品或第二样品分离自受试者。在一些情况下，第一样品和第二样品分离自同一受试者。在一些情况下，第一样品和第二样品分离自不同的样品。在一些情况下，第一样品或第二样品是组织样品、血液样品、pbmc样品或其组合。在一些情况下，组织样品是肿瘤组织或健康组织。在一些情况下，通过核心活检、细针活检或单采从受试者中分离第一样品或第二样品。在一些情况下，分离包括通过标志物分离多个t细胞的子集或其一部分。在一些情况下，标志物是细胞表面标志物或细胞因子。在一些情况下，细胞表面标志物是cd39、cd69、cd103、cd25、pd-1、tim-3、ox-40、4-1bb、cd137、cd3、cd28、cd4、cd8、cd45ra、cd45ro、gitr、foxp3或其组合。在一些情况下，呈递靶抗原的细胞是肿瘤细胞、抗原呈递细胞、人造apc或其任意组合。在一些情况下，apc或aapc用靶抗原脉冲。在一些情况下，包含由核酸编码的蛋白产物是与核酸或其衍生物递送(例如，转染或电穿孔)的apc或aapc。在一些情况下，进一步向apc或aapc递送编码mhc的其他核酸。在一些情况下，核酸或其衍生物是dna或rna。在一些情况下，呈递靶抗原的细胞或包含由核酸编码的蛋白产物的细胞分离自受试者或者是细胞系细胞。在一些情况下，呈递靶抗原的细胞或包含由核酸编码的蛋白产物的细胞分离自从其中分离出第一样品和第二样品的同一受试者。在一些情况下，该方法还包括生成包含一个或多个融合的多核苷酸的一个或多个载体，一个或多个载体中的每个载体包含一个或多个融合的多核苷酸中的融合的多核苷酸。在一些情况下，该方法还包括将一个或多个载体递送至多个细胞中，其中多个细胞中的每个细胞包含一个或多个载体中的至少一个载体。在一些情况下，该方法还包括在多个细胞中表达一个或多个融合的多核苷酸，其中多个细胞的子集表达多个靶反应性tcr。在一些情况下，该方法还包括使多个细胞与一个或多个靶抗原接触，其中表达多个靶反应性tcr的多个细胞的子集与一个或多个靶抗原结合。在一些情况下，该方法还包括鉴定多个靶反应性tcr中的一个或多个靶反应性tcr。在一些情况下，该方法还包括将编码一个或多个靶反应性tcr的多核苷酸递送至多个受体细胞中。在一些情况下，该方法还包括向受试者施用多个受体细胞中的一个或多个细胞。

66、根据另一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含受体细胞，该受体细胞包含编码由本文所述方法鉴定的靶反应性或肿瘤反应性tcr的序列。

67、根据另一方面，本文提供了一种方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。在一些情况下，以约1x109个细胞至约1x1011个细胞的剂量施用受体细胞。

68、根据以下详细描述，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中，仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。将会认识到，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，而所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。

69、通过引用合并

70、本说明书中提及的所有出版物，专利和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物，专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用并入一样。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相抵触的范围内，该说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。