一种基于FeMoOv纳米酶双极电极的电化学发光传感器及检测H2O2和PSA应用

背景技术

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背景技术：

1、酶因其无可比拟的催化活性和较高的底物特异性、选择性和产率而引起了生物合成和传感领域的广泛关注，但其变性降解条件恶劣，回收难度大，制备和纯化成本高，限制了其广泛应用[cai,q.q.；yin,t.y.et,al.anal.chem.2022,94,5814-5822]。电化学发光(electrochemluminescence,ecl)是化学发光和电化学方法相结合的一种分析技术，具有灵敏度高、可控性好、背景低和原位分析等独特优点[cai,q.q.；wu,d.et,al.anal.chem.2021,191,113455]。双极电极(bpe)的引入使ecl方法进入无线便携领域，双极电极(bpe)是一种浸在电解液中的独立导体，不与外部电子电路直接连接，与传统的三电极系统相比，bpe具有电极结构简单、传感设计灵活、无线驱动等独特优势[cao,j.t.；wang,y.l.et,al.anal.chem.2018,90,10334-10339]。前列腺癌是第二常见的癌症，由前列腺上皮细胞分泌，是前列腺癌特异性的生物标志物，当其在人血清中的浓度达到阈值4.0ng/ml时，需要进行活检，因此开发一种适合、可靠、高选择性、超灵敏、准确的人血清psa检测方法非常重要[xu,c.；li,j.et,al.anal.chem.2021,93,11641-11647]。

2、本文利用femoov纳米酶加速双氧水分解，结合双极电极构建了一种电化学发光成像生物传感器，实现了对h2o2和psa的双目标灵敏检测。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的之一是首次将femoov纳米酶用于电化学发光生物传感器。

2、具体包括以下步骤：

3、femoov纳米酶的合成：将0.6g单宁酸、0.43g钼酸钠和0.79g氯化铁溶解在35ml蒸馏水中，搅拌30分钟后，将混合溶液转移到50ml聚四氟乙烯高压反应釜中，在160℃下反应10小时，最后收集产品，用蒸馏水洗涤3次。

4、本发明的目的之二是将双极电极和电致化学发光结合构建成像生物传感器用于检测h2o2和psa。

5、具体包括下步骤：

6、步骤1.femoov/aunps纳米酶的合成：为保证fe-moov表面含氨基，将3mg fe-moov分散于1.5ml乙醇中，加入50μlaptes。搅拌30分钟后，将混合物离心，用乙醇洗涤去除多余的aptes，得到端氨基femoov，再分散于1.0ml水中。然后，将250μl 1％haucl4·4h2o与上述水溶液混合，剧烈搅拌10min。在溶液中加入530μl新鲜制备的抗坏血酸(0.5mm)，搅拌5min。离心后，将非均相femoov/aunps用水冲洗，离心，最后在500μl水中重悬。

7、步骤2.femoov/aunps/ab2的制备：将100μl的femoov/aunps混悬液与100μlab2溶液(100μg/ml,0.1m pbs,ph 7.4)，37℃孵育3小时后，将femoov/aunps/ab2溶液离心，用pbs洗涤，然后再分散到含有0.05％tween 20和0.01％bsa的0.1m pbs(ph 7.4)中。

8、步骤3.氨基化ito电极的制备：将ito电极依次在丙酮、乙醇、水中超声清洗10分钟，然后浸入1:1:5(v/v)h2o2/nh3·h2o/h2o的溶液中30分钟，用水清洗。最后，用10％aptes乙醇分散溶液将ito切片硅化90分钟。孵化后，用水冲洗ito切片以去除ito表面物理吸收的硅烷，在ito电极上形成了氨基。

9、步骤4.双氧水的检测：在双极电极的阳极孔加入100μl不同浓度的过氧化氢(溶剂为0.1m ph＝7.4pbs)，在双极电极的阴极孔加入100μl 5mm ru(bpy)32+溶液和100mm tpra进行ecl测试。

10、步骤5.psa的检测：首先将100μl 5％的戊二醛放置到双极电极的阴极孔孵育60分钟；然后将100μl 0.1μg/ml抗体1与ito表面通过共价连接，接着利用1％bsa进行封板在37℃反应60分钟；随后100μl不同浓度的psa放在阴极孔并在37℃反应60分钟；然后将步骤2制备的100μl femoov/aunps/ab2引入到阴极孔并在37℃下反应30分钟，最后用ecl仪器进行检测。

11、步骤3.ecl测试及手机成像分析：ecl测试使用双极电极进行，在双极电极的阴极孔上加入100μl不同浓度的过氧化氢(溶剂为0.1m ph＝7.4pbs)，在双极电极的阳极孔上加入100μl ru(bpy)32+溶液(5mm,tpra 100mm)进行ecl测试；光电倍增管(pmt)的电压设置为400v，检测过程中电位扫描范围为0-3.5v，扫描速率设置为0.2v/s；手机成像分析只需将电位扫描改为0-5v，就可以用手机进行不同浓度的psa成像。

技术特征：

1.一种基于femoov纳米酶双极电极的电化学发光传感器及检测h2o2和psa应用，其特征是：电极阳极孔配有ecl发光试剂联吡啶钌ru(bpy)32+，阴极孔配有femoov/aunps，由于femoov/aunps具有高效的酶催化作用，能极大地促进h2o2的分解，因此纳米酶双极电极体系中的电子转移速率将大大加快，增强ru(bpy)32+的ecl信号，实现了h2o2的敏感检测；本工作还巧妙设计了一种以femoov/aunps为识别探针的免疫夹心传感器，实现对目标psa的高灵敏检测；此外，还开发了一种独特的手机ecl成像系统，用于测定不同浓度的psa，为生物检测开辟了一种新的便携式成像传感设备，该研究开创了双极电极与ecl成像联合应用于生物分析的ecl研究新技术，在蛋白质、核酸和癌细胞的多重检测方面具有广阔的应用前景；

技术总结
本工作首次提出了一种独特的FeMoOv纳米酶双极电极(NM‑BPE)电化学发光(ECL)生物传感成像平台，实现了目标过氧化氢(H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;)和前列腺特异性抗原(PSA)的敏感检测。采用阳极孔配有ECL发光试剂联吡啶钌(Ru(bpy)<subgt;3</subgt;<supgt;2+</supgt;)，阴极孔配有具有优异过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)样活性的铁掺杂氧化钼/金纳米颗粒(FeMoOv/AuNPs)纳米酶。由于FeMoOv/AuNPs具有高效的酶催化作用，能极大地促进H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;的分解，因此NM‑BPE体系中的电子转移速率将大大加快，从而增强Ru(bpy)<subgt;3</subgt;<supgt;2+</supgt;的ECL信号。基于此原理，本工作不仅实现了H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;的敏感检测，还巧妙地设计了一种以FeMoOv/AuNPs为识别探针的夹心免疫传感器，介导阳极上的ECL反应，实现了PSA的高灵敏检测。此外，还开发了一种独特的手机ECL成像系统，用于测定不同浓度的PSA，为生物检测开辟了一种新的便携式成像传感设备。这项工作首次将纳米酶与双极电极结合进行ECL分析和成像，不仅拓宽了纳米酶的应用领域，而且开创了双极电极与ECL成像联合应用于生物分析的ECL研究新技术，在蛋白质、核酸和癌细胞等多重检测方面具有广阔的应用前景。

技术研发人员：接贵芬,李红坤
受保护的技术使用者：青岛科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13