SYBRGreenI在聚丙烯酰胺凝胶电泳显影中的应用

本发明涉及生物技术应用领域，具体涉及一种电泳分析技术，更具体地，涉及sybrgreen i染料在聚丙烯酰胺凝胶电泳显影中的应用。

背景技术：

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学研究中常用的实验技术，主要用于pcr反应产物的分离检测，具有简单、快速、灵敏、成本低的优点。目前聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分析分子量小于1000bp的核酸片段，并且分辨率可达到1bp。对聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子染色显影的方法通常有：溴化乙锭(eb)染色、亚甲蓝染色和快速硝酸银染色法。

2、王绍鹏等人，在对多个马铃薯品种的ssr标记的分析研究中，将电泳后的12％聚丙烯酰胺凝胶在0.5μg/ml的eb染液中浸泡30分钟，来对凝胶中的核酸分子进行染色。eb分子含有一个三环平面基团可以嵌入到dna堆积碱基中，与未结合eb的核酸分子相比，其荧光增加了21-25倍。由于其具有低成本、灵敏度高的特性，使得在分子生物学实验中得到了广泛的应用。但eb还是一种强致癌物，eb分子嵌入dna分子后在复制时会发生错误配对，可能会诱发癌变，严重影响了实验人员的健康安全。

3、物种进化研究、遗传图谱的构建、指纹图谱的绘制等研究中广泛地利用基因组简单重复序列(ssr)标记通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。huang和liang等人开发了一种简便的硝酸银染色方案，整个染色过程只需7分钟即可完成，但仍需要两个步骤(浸渍和显影)和三种试剂(硝酸银、氢氧化钠和甲醛)。

4、目前关于聚丙烯酰胺凝胶的显影方案，主要有eb染色和快速硝酸银染色法两种。虽然eb价格低廉，但eb具有极强的毒性，已经被逐步淘汰；快速硝酸银染色法使用的试剂对环境和人体均有危害，而且实验步骤繁琐复杂，实验耗时长，实验成本高。因此，亟需提供一种高效、低成本、高安全性的聚丙烯酰胺凝胶显影方案。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中eb染色和快速硝酸银染色法在聚丙烯酰胺凝胶显影中存在的缺陷和不同，提供sybr green i染料在聚丙烯酰胺凝胶电泳显影中的应用。本发明通过优化sybr green i核酸染料在pcr反应体系中的最适工作浓度，从而表明sybr green i核酸染料在聚丙烯酰胺凝胶显影方案方面具有较大的应用价值。

2、本发明的第一个目的在于提供sybr green i染料在聚丙烯酰胺凝胶电泳显影中的应用。

3、本发明的另一目的在于提供一种核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳显影方法。

4、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

5、sybr green i染料是一种直接与双链dna(dsdna)结合的荧光染料，是荧光定量pcr最常用的dna结合染料。在定量pcr中，sybr green i可与双链dna(dsdna)非特异性结合后发出荧光，则可以通过检测反应体系中的sybr green i荧光强度，达到检测pcr产物扩增量的目的。游离状态下，sybr green i发出微弱的荧光，一旦与dsdna结合，其荧光增加1000倍，一个反应发出的全部荧光信号与出现的dsdna量成比例，且会随扩增产物的增加而增加；所以通过检测pcr反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的dna片段的熔解温度。目前sybr green i还鲜有用于核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳显影中的报道。

6、本发明以水稻基因组为实验材料，将sybr green i核酸染料与传统的快速硝酸银染色法在显影效果、实验效率、实验成本等方面进行比较，开发了一种高效、低成本、高安全性的聚丙烯酰胺凝胶显影方案。本发明具体将pcr反应体系分别与10×、20×、30×、40×sybr green i核酸染料混合，核酸染料终浓度为1×、2×、3×、4×。反应后的pcr产物在10％聚丙烯酰胺凝胶中180v电泳70min在凝胶成像系统中拍照得到的结果，并将凝胶硝酸银染色显影作为对照。

7、在sybr green i核酸染料与pcr反应体系混合反应的实验中显示，观察到sybrgreen i核酸染料终浓度为1×的实验组有清晰可辨的荧光条带，sybr green i核酸染料终浓度提高至2×的荧光条带与1×相比较稍微减弱，但仍然清晰可辨，与硝酸银染色的显影的条带相一致。而sybr green i核酸染料终浓度提高到为3×和4×时，实验组中几乎检测不到荧光条带，也与硝酸银染色的显影的结果相一致。以上的结果表明，1×终浓度的sybrgreen i核酸染料对pcr反应几乎没有抑制效应，随着sybr green i核酸染料终浓度的提高至2×，sybr green i核酸染料对pcr反应的具有一定的抑制效果，随着sybr green i核酸染料终浓度提高至3×和4×时，则完全抑制了pcr反应的进行。因此，1×染料浓度对pcr反应的影响较小，将核酸染料直接加入pcr反应体系中一同反应，能够大量减少实验工作量。2×核酸染料对pcr反应有更强的抑制作用，与1×实验组相比条带的荧光强度较弱，投入更多的核酸染料反而显影效果更弱，不利于实验的经济效益。综合可知，1×sybr green i核酸染料不仅对pcr反应的抑制效果更弱，并且能够保证实验结果的呈现效果的可信度，而且核酸染料的用量也更少，既节约了实验成本，也节约了实验的时间成本。

8、本发明所述通过比对pcr体系中加入1×、2×、3×、4×sybr green i核酸染料反应后在10％聚丙烯酰胺凝胶的电泳结果，以及利用快速硝酸银染色法将凝胶硝酸银染色显影作为对照，利用凝胶成像系统记录的条带与硝酸银染色显影的结果几乎一致。1×sybrgreen i核酸染料加入pcr体系中一同反应，pcr产物经电泳后利用凝胶成像系统能够显示出清晰的条带；sybr green i核酸染料提高至2×也能观察到较清晰的条带，但荧光强度与1×实验组相比较弱；随着sybr green i核酸染料浓度进一步提高至3×和4×pcr反应几乎被完全抑制。综上所述，可采用1×sybr green i核酸染料浓度加入到pcr体系中，pcr反应完成后用于电泳。

9、在成本方面，传统的快速硝酸银染色法，该方法所需的试剂有硝酸银、氢氧化钠、甲醛等，所使用的试剂不仅对环境有害，而且对人体有害；同时该种方法步骤繁琐，实验耗时长，实验成本高昂，每硝酸银染色一块凝胶需要花费约12元，按照每一块凝胶按照检测40个样品计算，一个样品检测成本为0.3元。若是使用1×sybr green i核酸染料加入到pcr体系中一同进行pcr反应的实验方案，每一块凝胶显影的实验成本仅需0.02元，即一个样品检测成本为0.0005元，实验的显影成本是前者的1/600。因此在不影响实验结果的前提下，采用1×sybr green i核酸染料加入到pcr体系中一同进行pcr反应的实验方案能够极大的降低实验成本，并且节约了实验工作量。

10、因此，本发明所述使用sybr green i核酸染料对聚丙烯酰胺凝胶进行显影的方法兼具高效性和安全性，使用1×sybr green i核酸染料浓度加入到pcr体系中的显影方案，更是可以大大缩短了实验时长，简略了实验步骤，并且进一步降低了实验成本，本方案具有较大的应用价值。

11、因此本发明首先提供sybr green i作为显影剂在聚丙烯酰胺凝胶电泳显影中的应用。

12、可选地，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳为核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳。

13、优选地，所述sybr green i的终浓度为1×～2×。

14、进一步优选地，所述sybr green i的终浓度为1×。

15、本发明还提供一种核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，是将pcr扩增产物点入聚丙烯酰胺凝胶胶孔中，电泳，电泳结束后，利用凝胶成像系统记录电泳结果；所述pcr扩增产物采用的pcr扩增体系中添加有sybr green i作为显影剂。

16、可选地，所述聚丙烯酰胺凝胶为10％聚丙烯酰胺凝胶。

17、优选地，所述sybr green i在pcr扩增体系中的终浓度为1×～2×。

18、可选地，电泳时间为60～80分钟。

19、进一步优选地，所述sybr green i在pcr扩增体系中的终浓度为1×。

20、可选地，所述电泳的电压为180v，电泳时间70分钟。

21、本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

22、本发明提供了sybr green i染料在聚丙烯酰胺凝胶电泳显影中的应用。本发明研究表明，采用sybr green i核酸染料对聚丙烯酰胺凝胶电泳进行显影的兼具高效性和安全性，而使用1×sybr green i核酸染料浓度加入到pcr体系中的显影方案，不仅显影效果好，更是可以大大缩短实验时长，简略实验步骤，并且进一步降低实验成本。