聚丙烯酰胺凝胶分散速溶固体组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及聚丙烯酰胺凝胶技术领域，尤其涉及聚丙烯酰胺凝胶分散速溶固体组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]在研究和诊断领域，聚丙烯酰胺凝胶是一种广泛运用的用于分离生物大分子如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、多肽、蛋白质以及它们的复合物等的分离介质。运用此项技术的基本装置为一个两端开口的细管或一个三明治型的两块平板。细管和平板用具有一定的支持强度的材质制作，如玻璃和塑料等。首先将尚未凝固的聚丙烯酰胺溶液加入到上述形状的模具中，待聚丙烯酰胺凝固成胶后，可将生物样品加到凝胶的一端，凝胶的两端分别加上正负极电极，使生物样品分子在凝胶介质中移动。由于生物样品分子的移动速度不同，因而在一段时间后，不同移动速度的生物分子就能被有效分开。一般生物样品分子或经处理以后的生物样品分子带有负电荷，电泳过程中，它们从负极向正极移动。
[0003]在一定电场下，生物分子在介质上的移动速率(泳动速率)取决于生物分子本身的电荷/质量比、生物分子的形状和大小以及介质的孔径。针对确定的样品，前两者是生物分子本身的特征，一般不会改变。操作者可以改变电泳介质的孔径来影响生物分子的泳动速率。聚丙烯酰胺凝胶的孔径首先取决于凝胶体系中丙烯酰胺单体及交联剂单体的总质量-体积浓度，即所谓的丙烯酰胺单体溶液的总质量-体积浓度，用％T表示，即％τ=(丙烯酰胺单体质量+交联剂单体质量)(克)+溶液总体积(毫升)X100%。越高的％τ浓度，使形成的凝胶孔径越小，适合用于分离小分子量的生物分子。越低的％τ浓度，使形成的凝胶孔径越大，适合用于分离大分子量的生物分子。常用的分离生物分子的聚丙烯酰胺凝胶浓度为4%-30%不等。影响聚丙烯酰胺凝胶的另一个因素是交联剂单体质量占所有单体的质量百分比，用％c表示，即％C=交联剂单体质量+ (丙烯酰胺单体质量+交联剂单体质量)X 100%。在总的单体浓度(％τ)确定的情况下，使用越少的交联剂(％c越小)获得的凝胶孔径越大，反之亦然。常用的用于核酸分子分离的凝胶的％c为5% ;用于蛋白分子分离的凝胶的％C为3.3%或2.6%或更低。此外还有其他一些原因可能会带来孔径大小的变化，如不完全的凝结和凝胶的水解等。
[0004]凝胶介质中还含有用于调节pH值、离子强度等的缓冲液体系。一般用于核酸电泳，凝胶的缓冲液常为TAE (40mMTris-乙酸，lOmMEDTA)和TBE (90mM的Tris碱，90mM的硼酸和2mM的EDTA)。在非变性核酸电泳时，电泳过程保持在较低的温度，以维持核酸的结构，特别是用于分离核酸和蛋白质复合物的时候。如要使得分离的核酸分子变性(双链DNA解链；单链DNA和RNA 二级结构解体)，常在缓冲体系中加入足量的变性剂，如尿素和甲酰胺等，并维持较高的电泳温度。其它用于核酸电泳的缓冲液体系还有Tris/磷酸和Tris/双甘氨肽等。电泳缓冲液也使用同样成分的缓冲液，然而在核酸的变性电泳时，电泳缓冲液中常无需添加变性剂。
[0005]蛋白分子表面由于没有大量的负电荷，大多数蛋白电泳都在变性条件下进行，在此条件下，蛋白在上样缓冲液中预先处理，使蛋白表面结合上大量带负电荷的SDS (十二烷基硫酸钠)分子基团，能够在电场力的驱动下有效泳动，即所谓的SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE凝胶灌制的缓冲体系常用的是Laemmli体系(Laemmli, U.Κ.(1970) Nature,227，680-686.)。Laemmli体系包括分离胶和浓缩胶(也称为积层胶)两部分:分离胶的缓冲液为0.375M的Tris (用HC1滴定到ρΗ8.8)，浓缩胶的缓冲液为0.125Μ的Tris (用HC1滴定到ρΗ6.8)0正负极电泳缓冲液为0.024Μ的Tris，0.192M的甘氨酸和0.1%的SDS。另一种常用的缓冲液体系(Schaegger 体系)(Schaegger, H.andvanjagow，G., (1987) Anal.B1chem.166，368-379)为:浓缩胶缓冲液含0.75MTris, HC1滴定到ρΗ8.45 ;分离胶缓冲液含 0.9MTris，HC1 滴定到 ρΗ8.45 ;负极缓冲液为 0.lMTris 和 0.lMTricine，含 0.1%SDS。正极缓冲液为0.2MTris0其它缓冲液包括磷酸盐缓冲体系、Bis-Tris缓冲体系、Tris-乙酸体系、双甘氨酸肽-NaOH体系、PIPES-磷酸钠体系、HEPES/MOPS/MES/Bicine_NaOH体系、M0PS-K0H体系等。如要在非变性条件下分离蛋白质分子，则需在凝胶和缓冲液中忽略SDS。
[0006]传统制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶凝胶方法，都是先将所需试剂成水剂溶液，比如丙烯酰胺/交联剂单体的水溶液和调节滴定好pH值及离子强度的缓冲水溶液，然后按照一定的比例混合成溶液，再添加氧化还原反应催化剂混匀再进行灌胶，在灌制后需要凝固才能作为有效的分离介质。丙烯酰胺单体在催化剂存在的情况下可以聚合成长的线性聚丙烯酰胺，如果体系中存在甲叉双丙烯酰胺、1，4-二丙烯酰基哌嗪、N，N’_双(丙烯酰)胱胺、酒石酸双丙烯酰胺或它们的混合物等交联剂，则在这些线性聚丙烯酰胺之间，可以通过交联剂形成桥连接体，由此构成网状聚丙烯酰胺。实验中一般使用过硫酸铵与N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)组成的催化体系。由于上述两种物质均不稳定，因此操作者可在凝胶配制前临时加入新鲜上述试剂，即可使丙烯酰胺单体快速聚合。聚合后的聚丙烯酰胺即可用于电泳分离生物大分子等实验。
[0007]众所周知，丙烯酰胺水溶液以及丙烯酰胺/交联剂单体的水溶液不稳定会缓慢水解，所以一般只能在2~8°C存放一周左右。丙烯酰胺的缓慢水解会使得凝胶电泳的分辨率和分离效果急剧下降。所以，聚丙烯酰胺凝胶一般都是现用现配。但是配制聚丙烯酰胺凝胶需要计算及称量多个组分试剂的质量以及体积，操作繁琐、重复性差，性质性能不稳定、保存周期短，无法批量化操作，存在极大的损耗，使用成本高。由于目前的生命科学和医学研究中极为常用，自制凝胶需要较多的时间，在此环节，广大研究人员浪费了大量的时间和精力。因此该应用领域很需要一种可以大为缩减凝胶配制时间，而价格又相对低廉的产品。
[0008]可自由基聚合单体尤其是聚丙烯酰胺凝胶使用的丙烯酰胺有一定的毒性，对于人体有伤害。这些单体化合物对温度和湿度的要求较高，在一定的温度下容易熔化，添加可交联单体会出现共熔聚合现象不利于形成混合物，同时也易吸潮降解，很难制成固体，所以现有的做法都是将丙烯酰胺制成聚丙烯酰胺凝胶液试剂。
[0009]目前，配制聚丙烯酰胺凝胶的时候，都是采用预先使用液体酸来滴定调节达到需要的胶缓冲区溶液pH值，广泛使用的是强酸(如盐酸、磷酸、乙酸等)滴定调节pH值。众所周知，这些液体酸都是一种强酸，有强烈的腐蚀性，而且在空气中发烟易挥发，需要烟室和其他警示设施，很难应用于粉末、颗粒成型工艺和压片制备工艺，并且调节pH值是一个繁琐而且不稳定的过程，操作比较麻烦。。
【发明内容】
[0010]本发明的目的就是针对现有技术存在的不足而提供一种能够快速灌制聚丙烯酰胺凝胶、同时容易成型、可长时间保存的聚丙烯酰胺凝胶分散速溶固体组合物，其操作简单方便、性质性能稳定、存储方便、保存周期长，同时还分别提供这种聚丙烯酰胺凝胶分散速溶固体组合物粉剂、颗粒剂和片剂的制备方法，制备工艺简单、剂量准确，可以批量规模化生产使得聚丙烯酰胺凝胶更加稳定可靠、批间差更小、重复性更好、成本更低。
[0011 ] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
聚丙烯酰胺凝胶分散速溶固体组合物，包括以下组分:含丙烯酰胺的可自由基聚合单体、可交联单体、制胶缓冲剂、pH调节剂以及固体成型辅料。固体成型辅料选自水溶性填料、崩解剂、粘结剂中的一种或者多种的组合，优先地，固体成型辅料各组分的重量比为:水溶性填料30~99.9%、崩解剂0~70%、粘结剂0.1-20%0
[0012]优选的，聚丙烯酰胺凝胶分散速溶固体组合物包括以下重量份的组分:
含丙烯酰胺的可自由基聚合单体30~80份
可交联单体1~20份制胶缓冲剂3~50份 pH调节剂0.1-10份固体成型辅料5~40份。
[0013]所述含丙烯酰胺的可自由基聚合单体为非离子型水溶性乙烯基单体，含丙烯酰胺的可自由基聚合单体为单体丙烯酰胺、(甲基)丙烯酰胺、甲基(甲基)丙烯酰胺、羟甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺(甲基)、N，N- 二甲基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、羟甲基(甲基)丙烯酰胺、羟(甲基)丙烯酰胺、丙烯酸(甲基)丙烯酸酯、羟丙基(甲基)丙烯酰胺、乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基丁二酰亚胺、N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、乙酰胺或双丙酮丙烯酰胺。
[0014]所述可交联单体为亚甲基双丙烯酰胺、(聚)乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、哌嗪双丙烯酰胺或酒石酸酰胺的交联单体。
[0015]所述pH调节剂为固体酸试剂，pH调节剂选自天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、羟基乙酸、牛磺酸、柠檬酸、抗坏血酸、酒石酸、乳酸、马来酸、苹果酸、富马酸、己二酸和琥珀酸中的一种或者多种的组合。
[0016]制胶缓冲剂可以是一种或者是多种化合物的组合，以能够使得聚丙烯酰胺凝胶能够进行电泳分离为佳。制胶缓冲剂包括一种或者多种生物缓冲液试剂组合，可以进一步包括一种或者多种氨基酸的两性电解质，还可以更进一步包括表面活性剂和染料。生