用于一步加样式ELISA检测的酶标抗体保护液、试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及酶联免疫检测，特别涉及用于一步加样式elisa检测的酶标抗体保护液、试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、由于具有敏感性高、特异性强、实验设备要求简单、无放射性污染、能定性及半微量、微量、超微量定量分析等特点，elisa(酶联免疫吸附试验)在检测领域应用广泛，成为免疫检测界的金标准方法。

2、目前常见的elisa(酶联免疫吸附试验)方法，其技术原理是：利用捕获抗体与目标物抗原特异性结合，再与酶标抗体结合，形成夹心复合物，然后加入底物发生显色反应，最后通过显色深浅与待测物质的含量成正比，用仪器检测得出结果。目前常见的elisa方法包括直接法、间接法、夹心法和竞争法。

3、在使用夹心elisa方法检测时，传统步骤是在酶标板上包被有包被抗体，经过封闭及保护处理后，先加入标准品梯度及待测样本孵育，洗板，使包被抗体与目标抗原特异性结合；再加入酶标抗体孵育，洗板，使酶标抗体也与目标抗原结合，形成双抗体夹心；最后加入底物显色，终止显色后读取od值。也有某些elisa方法的步骤是将标准品梯度及待测样本、酶标抗体一起加到载体上，直接孵育，洗板，最后显色、终止，读取od值，即一步孵育式elisa检测法。

4、例如，授权专利cn103630689b提供的检测西马特罗药物残留的酶联免疫试剂盒，就是在酶标板上包被西马特罗药物检测原，然后将标样或者经预处理的待测样品、西马特罗药物单抗、酶标物依次加入反应孔中，孵育，显色、读数完成检测。又例如cn114252624a也提供了竞争法、双抗原夹心法、间接法等多个不同类型的试剂盒。

5、现有不论是任何专利技术，所使用的酶标板一般情况下都是从上游生物企业直接购买的成品，即已经在酶标板上包被了抗原或抗体，检测单位购买回来后需要先加入标准品梯度及待测样本进行孵育，再加入检测抗体/检测抗原进行孵育。这种elisa检测方法对于检测单位来说就需要进行两次孵育及两次洗板操作，耗时较长，操作步骤繁杂，对实验人员的操作要求也较高，限制了试剂盒的应用。

6、因此，本发明的申请人认为，如果转变思路，使检测单位能够实现一步加样式elisa检测，上游生产企业预先将包被抗体和检测抗体都固定在载体上，检测单位买到酶标板后，只需加入标准品梯度及待测样本进行孵育，然后洗板后加入底物进行显色反应，这样就能省去加入检测抗体/检测抗原进行孵育及一次洗板的时间。但是，如果上游生产企业预先将包被抗体和检测抗体都固定在载体上，做成酶标板或试剂盒进行销售，势必需要考虑包被抗体和检测抗体的活性问题。如果采用这种方案影响了包被抗体和检测抗体的活性，就无法获得准确的检测结果。此外，加入酶标抗体孵育的过程，操作人员也可能会产生加错或漏加情况，这种操作失误在实验过程中可能无法发现，只能在得到实验结果后才发现，导致无法得出准确的测定结果。

技术实现思路

1、针对采用一步加样式elisa检测方法时，存在的包被抗体和检测抗体的活性的问题，本发明提供了用于一步加样式elisa检测的酶标抗体保护液、试剂盒及其使用方法。申请人偶然发现，在完成对载体(基板)的包被抗体包被步骤之后，如果同时加入检测抗体(即酶标抗体)，同时采用本发明提供的保护液进行保护处理，最后经干燥获得的全新酶标板，就能同时有效保证包被抗体和检测抗体的活性。检测单位进行检测时，可以直接将标准品或待测品加到含有上述酶标板的反应孔中按常规方式孵育一段时间，就能直接加入底物实现显色反应。经过大量实验的验证后发现，检测结果与常规传统方法基本一致，灵敏度、准确度都很高。这一打破本领域技术人员常规认知的技术构思在现有的专利或文献中还尚未发现有任何公开。具体通过以下技术实现。

2、用于一步加样式elisa检测的试剂盒，包括酶标板；所述酶标板的制备方法是：先将包被抗体包被在载体上，经过(常规方法的)封闭和保护后，再将酶标抗体与酶标抗体保护液混合后加在所述载体上，并加入保护液处理，最终干燥后制备而成；所述酶标抗体保护液的原料按质量分数包括明胶0.05-1wt％和蔗糖5-50wt％。

3、需要说明的是，本发明提供的试剂盒，是提供了一种新的试剂盒技术构思，而并非针对任何具体的抗原。本发明的申请人通过对不同类型的抗原(例如甲胎蛋白afp、癌胚抗原cea、糖类抗原125(ca125)、神经元特异性烯醇化酶nse)的试验后发现，本发明提供的试剂盒和酶标板，能够适用于绝大多数基于夹心elisa技术的抗原检测领域。

4、还需要说明的是，为了避免检测误差，本发明提供的试剂盒中包被抗体和酶标抗体的选择，以相互不会发生特异性结合为准。

5、优选地，所述保护液的原料按质量分数包括明胶0.5wt％和蔗糖20wt％。

6、更优选地，所述保护液的原料还包括基础缓冲液。

7、进一步优选地，所述基础缓冲液为cbs、pbs、tbs、pbst、tbst、np-40、ripa、hepes或生理盐水。

8、优选地，所述试剂盒还包括标准品、标准品/待测样品稀释液、洗涤液、底物。此外，还可以包括底物显色液和显色终止液。

9、更优选地，所述酶标板的制备方法中，干燥的方法为烘干、室温真空干燥、冷冻干燥的任意一种方法。

10、本发明还提供了使用上述试剂盒的一步加样式elisa检测方法，使用步骤为：先将标准品稀释成不同浓度梯度的标准品工作液，再将待测样品稀释到需要的倍数制成待测样品工作液，然后在检测孔中滴入所述标准品工作液，震板孵育，洗板后加入底物，震板避光孵育，读取特定波长的od值，获得标准曲线和标准曲线方程，计算得到待测样品中目标抗原浓度；

11、本发明还提供了用于一步加样式elisa检测的酶标抗体保护液，其原料按质量分数包括明胶0.05-1wt％和蔗糖5-50wt％。

12、本发明还提供了用于一步加样式elisa检测的酶标板，其制备方法是先将包被抗体包被在载体上，经过封闭和保护处理后，再将酶标抗体与酶标抗体保护液混合后加在载体上，最终干燥后制备而成；所述保护液的原料按质量分数包括明胶0.05-1wt％和蔗糖5-50wt％。

13、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明打破了本领域技术人员对于夹心elisa原理的检测方法的常规操作步骤的认知，将包被抗体和酶标抗体同时包被/固定在基板上，使用时直接滴加标样或待测样品进行孵育即可，为检测单位省略了滴加酶标抗体进行孵育及一次洗板的步骤，节省了一半以上的检测时间。整个检测过程的反应时间更短，操作更简便，对人员操作要求更低，检测灵敏度、准确度非常高。

技术特征：

1.用于一步加样式elisa检测的试剂盒，其特征在于，包括酶标板；所述酶标板的制备方法是：先将包被抗体包被在载体上，经过封闭和保护后，再将酶标抗体与酶标抗体保护液混合后加在所述载体上，最终干燥后制备而成；所述酶标抗体保护液的原料按质量分数包括明胶0.05-1wt％和蔗糖5-50wt％。

2.根据权利要求1所述的用于一步加样式elisa检测的试剂盒，其特征在于，所述保护液的原料按质量分数包括明胶0.5wt％和蔗糖20wt％。

3.根据权利要求1或2所述的用于一步加样式elisa检测的试剂盒，其特征在于，所述保护液的原料还包括基础缓冲液。

4.根据权利要求3所述的用于一步加样式elisa检测的试剂盒，其特征在于，所述基础缓冲液为cbs、pbs、tbs、pbst、tbst、np-40、ripa、hepes或生理盐水。

5.根据权利要求1、2或4所述的用于一步加样式elisa检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品、标准品/待测样品稀释液、洗涤液、底物。

6.根据权利要求5所述的用于一步加样式elisa检测的试剂盒，其特征在于，所述酶标板的制备方法中，干燥的方法为烘干、室温真空干燥、冷冻干燥的任意一种方法。

7.一种权利要求1、2、4或6所述的用于一步加样式elisa检测的试剂盒的使用方法，其特征在于，使用步骤为：先将标准品稀释成不同浓度梯度的标准品工作液，再将待测样品稀释到需要的倍数制成待测样品工作液，然后在检测孔中加入所述标准品工作液及待测样品工作液，震板孵育，洗板后加入底物，震板避光孵育，读取特定波长的od值，获得标准曲线方程，将获得的待测样品对应的od值带入标准曲线方程中经计算最终得到待测样品试剂浓度。

8.用于一步加样式elisa检测的酶标抗体保护液，其特征在于，其原料按质量分数包括明胶0.05-1wt％和蔗糖5-50wt％。

9.用于一步加样式elisa检测的酶标板，其特征在于，其制备方法是：先将包被抗体包被在载体上，经过封闭和保护处理后，再将酶标抗体与酶标抗体保护液混合后加在载体上，最终干燥后制备而成；所述保护液的原料按质量分数包括明胶0.05-1wt％和蔗糖5-50wt％。

技术总结
本发明公开了一种用于一步加样式ELISA检测的酶标抗体保护液、试剂盒及其使用方法，涉及酶联免疫检测技术领域。本发明通过使用特殊的酶标抗体保护液和相应的试剂盒，保护液的原料包括明胶和蔗糖；将酶标抗体预先固定于检测板内，使用时直接加入标准品和待测样品进行孵育即可，为检测单位省略了孵育酶标抗体的步骤，节省了一半以上的检测时间。整个检测过程的反应时间更短，操作更简便，对人员操作要求更低，检测灵敏度、准确度非常高。

技术研发人员：黄丽萍,周翰霖,刘钢,颜迎冬
受保护的技术使用者：量准（武汉）生命科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15