用于电化学检测造血干细胞的组合物及其方法与流程

本发明涉及一种用于检测细胞的组合物，特别涉及一种应用于电化学方法，对造血干细胞实施定性和定量检测的组合物，提高检测的灵敏度。

背景技术：

1、干细胞在体内所有其他细胞中具有独特的自我更新能力和产生分化细胞的能力。造血干细胞(hsc)是最具特色的干细胞类型之一，它是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞具有重要指导意义。相关研究表明，大部分白血病，特别是急性髄系白血病(aml)以及慢性髄性白血病(cml)的发生，都直接或间接与造血干细胞异常相关，而且造血干细胞在实体肿瘤微环境调节中也有一定作用，最重要的是，造血干细胞移植广泛应用于血液系统疾病以及自身免疫疾病的临床治疗中。hsc的功能和潜在的治疗重要性吸引了这些细胞的深入研究。因此，建立一种高效灵敏的造血干细胞分析方法显得尤为重要。

2、目前，已有的造血干细胞检测方法有集落培养法、全自动血细胞计数仪法、酶联免疫吸附试验(elisa)和流式细胞术等，这些常规的方法需要复杂的样品预处理和专用的分析仪器。流式细胞术非常依赖于操作者的经验。除此之外，流式细胞术还存在仪器价格昂贵、数据处理繁琐且由于分析对象必须是细胞单悬液，结果易受到细胞预处理影响等局限。酶联免疫吸附试验(elisa)重复性差，会受到自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性，不论仪器和手工操作，干扰因素均较多。

3、催化发夹组装(cha)是一种等温、无酶的核酸扩增技术，可以克服依赖蛋白酶的缺陷。更重要的是，在cha过程中可以实现启动子-循环信号放大，只需两个亚稳态dna发夹，无需任何人为干预。因此cha具有设计简单、适应性强、信令转换效率高等特点。因此cha是一种强有力的分子生物技术工具，在生物传感和生物成像应用中显示出良好的前景。crispr/cas是细菌和古生菌中的一种rna介导的、可遗传的适应性免疫防御系统，现被用作基因组编辑和生物传感的有效工具。crispr/cas12a对单链dna有非特异性切割活性，其灵敏度能达到pm级。基于该反应，可用于检测dna、microrna和非核酸小分子。方波伏安法(swv)又称现代方波伏安法,它是一种多功能、快速、高灵敏度和高效能的电分析方法，线性扫描电压的一种，在医疗临床通讯等多领域有广泛应用。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种用于电化学检测造血干细胞的组合物，提高造血干细胞检测的准确性，有效避免了检测的假阳性结果。

2、本发明的另一个目的在于提供一种用于电化学检测造血干细胞的组合物，以高效检测造血干细胞，对造血干细胞高效捕获，提高检测灵敏度。

3、本发明的再一个目的在于提供一种电化学检测造血干细胞的方法，以电化学方式实施造血干细胞的检测。

4、本发明的又一个目的在于提供一种电化学检测造血干细胞的方法，实现造血干细胞的定量检测。

5、一种用于电化学检测造血干细胞的组合物，包括：

6、cd34抗体功能化的磁珠，

7、cd31抗体结合的核酸探针，

8、cd45抗体结合的核酸探针，

9、催化发夹组装反应h1链，

10、催化发夹组装反应h2链，

11、crrna，和

12、亚甲基蓝修饰的信号核酸链。

13、本发明的检测造血干细胞的组合物，cd31抗体结合的核酸探针序列为：

14、5'-tttttttttaagtg-3'。

15、本发明的检测造血干细胞的组合物，cd45抗体结合的核酸探针序列为：

16、5'-tctctatcattattt-3'。

17、本发明的检测造血干细胞的组合物，crrna序列为：

18、5'-uaauuucuacuaaguguagauaagugugaagau-3'。

19、本发明的检测造血干细胞的组合物，信号核酸链的序列为：

20、5'-atgccgatccccaaaagtgtacacttaatcgaagcttt-mb-3'。

21、本发明的检测造血干细胞的组合物，催化发夹组装反应h1链的序列为：

22、5'-tctctatcattaatcttcataatgatagagacactt-3'。

23、本发明的检测造血干细胞的组合物，催化发夹组装反应h2链的序列为：

24、5'-atcttcatctctatcattatgaagattaatg-3'。

25、本发明的检测造血干细胞的组合物，结合cd34抗体的免疫磁珠用于捕获造血干细胞。末端修饰n3的s1和末端修饰dbco的s2分别与cd31抗体和cd45抗体结合，形成特异性的抗体-核酸复合探针。当两种探针通过识别表面标志物cd31和cd45固定到造血干细胞表面时，拉近s1和s2的距离，进而通过点击化学反应，将s1和s2的末端连接到一起，形成一条长链s。长链s的部分序列(t)作为激活链，以打开具有发夹环结构的探针链h1，产生t/h1双链结构，进而暴露末端序列，以打开发夹环结构的另一核酸探针h2，产生h1/h2双链并释放t，进行下一轮杂交反应。h1/h2双链结构的末端含有部分单链结构，可以作为cas12a体系的激活链，以激活crispr/cas体系的反式切割活性，随机切割dna链，从而释放末端亚甲基蓝分子，产生电化学信号。

26、当检测体系中存在造血干细胞时，捕获探针(mbs@cd34)特异性识别造血干细胞。同时，造血干细胞表面的cd31蛋白和cd45蛋白可以通过抗体-抗原反应与对应抗体修饰的s1和s2核酸链结合，进而通过点击化学反应将邻近的s1和s2连接成为长链s，激活催化发夹组装反应并进一步激活crispr/cas体系，产生电化学信号。

27、将本发明提供的组合物用于以电化学方法实施造血干细胞的检测，提高信号标记效率和检测灵敏度。

28、一种电化学检测造血干细胞的方法，包括：

29、将待测溶液与cd34抗体功能化磁珠混合并孵育，过夜后提取结合了造血干细胞的磁珠；

30、然后，加入cd31抗体结合的核酸探针和cd45抗体结合的核酸探针，反应后，磁性分离；

31、接着，加入发夹环结构的催化发夹组装反应h1链和发夹环结构的催化发夹组装反应h2链，反应后，磁吸取上清；

32、之后，加入crrna和信号核酸链后，进行crispr/cas反应；

33、最后，产生的游离亚甲基蓝分子与葫芦[7]脲(cb[7])、金纳米颗粒(aunps)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)共同功能化的石墨电极孵育，能够被cb[7]的疏水空腔捕获，形成具有的稳定的主-客体配合物，产生电化学信号，通过测定功能化石墨电极表面富集的亚甲基蓝电化学信号，实现造血干细胞的检测。

34、另一种电化学检测造血干细胞的方法，包括：

35、将待测溶液与cd34抗体功能化磁珠混合并孵育(如：4℃±0.2℃)，过夜后提取结合了造血干细胞的磁珠；

36、然后，加入cd31抗体结合的核酸探针和cd45抗体结合的核酸探针，反应(如：37℃±0.2℃，1-1.5小时)后，磁性分离；

37、接着，加入发夹环结构的催化发夹组装反应h1链(8-10μl，20-30μm)和发夹环结构的催化发夹组装反应h2链(8-10μl，20-30μm)，反应(如：37℃±0.2℃，2个小时)后，磁吸取上清；、

38、之后，加入depc水、10×buffer、crrna(20-25mm、2-5μl)、cas12a蛋白(20-30mm、4-6μl)和信号核酸链(100-150mm、2-5μl)后，进行crispr/cas反应(如：37℃±0.2℃，1-1.5小时)；

39、最后，产生的游离亚甲基蓝分子与葫芦[7]脲(cb[7])、金纳米颗粒(aunps)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)共同功能化的石墨电极孵育，能够被cb[7]的疏水空腔捕获，形成具有的稳定的主-客体配合物，产生电化学信号，通过测定功能化石墨电极表面富集的亚甲基蓝电化学信号，实现造血干细胞的检测。

40、上清液于功能化石墨电极上室温孵育1～2个小时，将修饰过的电极彻底清洗以进行电化学测量。通过高纯度氮气将溶液彻底脱氧，并在整个电化学检测过程中使用氮气流使得保持溶液厌氧。测定方波伏安法(swv)时所采用的实验条件是：电位扫描范围0～0.6v，电位阶跃4mv，振幅25mv，频率15hz。

41、本发明技术方案实现的有益效果：

42、使用单一标志物对造血干细胞进行检测时，通常漏检率较高。常用的造血干细胞标志物有cd31、cd45和cd34等。本发明借助表面标志物cd31和cd45构建基于表面双识别的电化学分析体系，可以有效避免单一靶标引起假阳性和假阴性结果，满足了更高的特异性识别分析需求。

43、本发明利用催化发夹组装(cha)具有成本低，易于操作和出色的信号放大性能的特点，同时，将催化发夹组装反应与crispr/cas体系结合，可以进一步增强造血干细胞分析的灵敏性。

44、本发明借助了点击化学反应温和且简便高效的特点，同时，结合具有操作简便、信号灵敏且价格经济优势的电化学技术，可以满足更为便利的造血干细胞分析需求。

45、本发明中使用的电化学技术更方便、更灵敏，不需要复杂样品处理以及精密仪器的分析，有望实现临床上和检测。