用于玉米赤霉烯酮检测的电致化学发光免疫传感器及检测方法

本发明属于电化学检测，具体涉及一种用于玉米赤霉烯酮检测的电致化学发光免疫传感器及检测方法。

背景技术：

1、玉米赤霉烯酮(zea)是由禾谷镰刀菌、枯枝镰刀菌和克鲁克韦镰刀菌等真菌产生的一种真菌毒素，主要存在于玉米、水稻、和大豆中，是世界上分布最广泛的真菌毒素之一。玉米赤霉烯酮含量过高会损害生殖器官功能并导致女性卵巢功能障碍和子宫内膜腺癌，也会产生肝毒性、血液毒性、遗传毒性、免疫毒性和神经毒性。欧洲食品安全局声称，zea的每日容许摄入量不应超过0.25mg/kg。

2、玉米赤霉烯酮的准确检测对人类的食品卫生和健康具有重要意义。目前用于检测和定量zea的分析方法包括高效液相色谱(hplc)、液相色谱-串联质谱(uhplc-qtof-ms/ms)、酶联免疫吸附试验(elisa)、毛细管电泳等。这些方法在准确度、精密度和重复性方面提供了良好的性能，但不足以进行大规模和现场快速分析。此外，这些方法价格昂贵并且需要专业人员操作，等待时间较长。因此，需要一种高度灵敏、快速和简单的方法来检测食品和饲料产品中的玉米赤霉烯酮含量。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种用于玉米赤霉烯酮检测的电致化学发光免疫传感器。本发明中以ng-pei-mofnizn滴加aunps为传感界面、ptca-la/au/ab2为信号探针，放大免疫传感器的光信号实现了对玉米赤霉烯酮的超灵敏检测，为食品中玉米赤霉烯酮的检测提供了一种简单、快速、准确的方法。

2、除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。

3、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

4、一种用于玉米赤霉烯酮检测的电致化学发光免疫传感器，其特征在于，所述用于玉米赤霉烯酮检测的电致化学发光免疫传感器的构建方法为：

5、将ng-pei-mofnizn分散液滴加到0.5m h2so4活化的电极表面上，室温干燥后，再将aunps滴加到电极表面，室温干燥；然后再滴加ab1，4-5℃冰箱过夜孵育12-15h；再用超纯水冲洗干净后滴加1％牛血清蛋白(bsa)溶液，4-5℃孵育30-40min；将获得的电极用超纯水冲洗干净，滴加不同浓度的玉米赤霉烯酮于电极表面，于4-5℃下孵育1.5-2h；将获得的电极用超纯水冲洗干净后，滴加ptca-la/au/ab2信号探针溶液，于室温孵育4 -5h，即得到用于玉米赤霉烯酮检测的电致化学发光免疫传感器。

6、所述ng-pei-mofnizn的制备方法为：

7、将氮掺杂石墨烯粉末(ng)加入dmf溶液中，超声分散均匀；加入1％聚乙酰亚胺(pei)，室温下搅拌2-3h；然后，加入nizn mof，超声分散均匀，室温下搅拌8-10h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于超纯水中，得到ng-pei-mofnizn分散液。

8、所述nizn mof的制备方法为：

9、将六水合硝酸锌(zn(no3)2·6h2o)、对苯二甲酸(pta)溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液和乙醇溶液中，然后加入六水合硝酸镍(ni(no3)2·6h2o)，室温超声10-20min，然后将混合溶液放入高压釜中在150-160℃反应4 -5h；冷却至室温，离心，dmf和乙醇洗涤，烘箱80-100℃干燥，得到nizn mof。

10、所述ptca-la/au/ab2的制备方法为：

11、ptca-la/au分散液中加入ab2溶液，冰浴搅拌12-15h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于超纯水中，即得到ptca-la/au/ab2的信号探针溶液。

12、所述ptca-la/au分散液的制备方法为：

13、aunps加入到ptca-la分散液中，在常温下搅拌8-10h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，即得到ptca-la/au分散液。

14、所述ptca-la的制备方法为：

15、将ptca溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液中，室温超声10-15min，在硅油浴中将ptca溶液加热到120-130℃，加入用n,n-二甲基甲酰胺溶解的六水合硝酸镧(la(no3)3·6h2o)溶液，磁力搅拌下在该温度保持反应6-7h；冷却至室温后离心、纯水洗涤，真空干燥箱40-60℃干燥，得到ptca-la材料。

16、所述ptca的制备方法为：

17、将苝-3,4,9,10-四羧酸酐(ptcda)加入0.1m氢氧化钠(naoh)溶液中，在80℃下加热溶解，溶液呈亮绿色，然后缓慢加入1m盐酸溶液(hcl)，产生橙色沉淀，冷却至室温后离心、纯水洗涤并调整ph为7后，真空干燥箱40-60℃干燥，得到橙色的ptca材料。

18、一种用于玉米赤霉烯酮检测的电致化学发光免疫传感器，其特征在于，包括如下步骤：

19、(1)信号探针的制备；

20、1)ptca：将50mg苝-3,4,9,10-四羧酸酐(ptcda)加入20ml，0.1m氢氧化钠(naoh)溶液中，在80℃下加热溶解，溶液呈亮绿色；然后向上述溶液中缓慢加入20ml，1m盐酸溶液(hcl)，此时产生橙色沉淀；冷却至室温后、离心、纯水洗涤并调整ph为7后，真空干燥箱40℃干燥，得到橙色的ptca材料；

21、2)ptca-la：将8.56mg ptca、8.66mg六水合硝酸镧(la(no3)3·6h2o)分溶于2ml和9ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液中，室温超声10min，然后，在硅油浴中将ptca溶液加热到120℃，再缓慢加入la(no3)3·6h2o溶液；在连续磁力搅拌下，将混合物在该温度下保持反应6h；冷却至室温后、离心、纯水洗涤三次后，真空干燥箱40℃干燥，得到橙色的ptca-la材料；

22、3)au纳米粒子：将1ml 1％haucl4溶液加入至100ml超纯水中煮沸，然后迅速加入2.5ml 1％柠檬酸三钠溶液继续煮沸15min，冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为金纳米粒子(aunps)，于4℃保存；

23、4)ptca-la/au：取400μl步骤3)制得的aunps加入步骤2)制得的1ml、1mg/ml ptca-la分散液中，在常温下搅拌8h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在1.5ml超纯水中，即得到ptca-la/au分散液；

24、5)ptca-la/au/ab2：向1.5ml步骤4)制得的ptca-la/au分散液中加入200μl浓度为10μg/ml的ab2溶液，冰浴搅拌12h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于1.5ml超纯水中，即得到ptca-la/au/ab2的信号探针溶液，并在4℃下储存备用；

25、(2)基底材料的制备；

26、1)nizn mof:将35mg六水合硝酸锌(zn(no3)2·6h2o)、17mg对苯二甲酸(pta)溶于16ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液和9.6ml乙醇溶液中；然后，将35mg六水合硝酸镍(ni(no3)2·6h2o)加入上述溶液中，室温超声10min，然后将混合溶液放入高压釜中在150℃反应4h；冷却至室温后、离心、dmf和乙醇洗三次后，烘箱80℃干燥，得到淡绿色nizn mof材料；

27、2)ng-pei-mofnizn：将1mg氮掺杂石墨烯粉末(ng)加入1ml dmf溶液中，超声分散均匀；然后将500μl 1％聚乙酰亚胺(pei)加入上述溶液，在室温下搅拌2h；然后，加入1ml(2mg/ml)步骤1)制得的nizn mof，然后，超声分散均匀，在室温下搅拌8h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于1.5ml超纯水中，得到ng-pei-mofnizn分散液。

28、(3)用于玉米赤霉烯酮检测的电致化学发光免疫传感器的构建

29、1)用0.1m pbs(ph＝7)缓冲液室温下处理捕获抗体ab1和玉米赤霉烯酮抗原，储存备用；

30、2)将玻碳电极用食人鱼洗液(98％ h2so4/30％ h2o2＝3:1,v/v)浸泡30min后用超纯水冲洗干净备用；

31、3)将步骤2)得到的电极分别用0.3μm和0.05μm的al2o3粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；

32、4)将步骤3)得到的电极在0.5m h2so4中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥；

33、5)将10μl的ng-pei-mofnizn分散液滴加到步骤4)清洁的玻碳电极表面上，室温干燥后，再将10μl的aunps滴加到电极表面，室温干燥；

34、6)将10μl步骤1)制得的ab1，滴加在步骤5)制备得到的电极上4℃冰箱过夜孵育12h；

35、7)将步骤6)获得的电极用超纯水冲洗干净后,滴加4μl 1％牛血清蛋白(bsa)溶液4℃孵育30min；

36、8)将步骤7)获得的电极用超纯水冲洗干净后,滴加不同浓度的玉米赤霉烯酮于电极表面，于4℃下孵育1.5h；

37、9)将步骤8)获得的电极用超纯水冲洗干净后，滴加10μl的ptca-la/au/ab2信号探针溶液于室温孵育4h，即得到用于玉米赤霉烯酮检测的电致化学发光免疫传感器。

38、本发明还提供一种利用上述电致化学发光免疫传感器检测玉米赤霉烯酮的方法。

39、一种利用上述电致化学发光免疫传感器检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：

40、1)向所述的传感器电极上滴加不同浓度的目标物玉米赤霉烯酮；

41、2)将电极置于含有0.1m k2s2o8的0.1m pbs(ph＝7.0)溶液中进行表征，测量其发光强度值；

42、3)根据步骤2)所得发光强度与玉米赤霉烯酮浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；

43、4)将待测样品用所述的传感器检测，将得到的电流值通过步骤3)制得的工作曲线计算得到待测样品中的玉米赤霉烯酮的浓度。

44、与现有技术相比，本发明的一种检测玉米赤霉烯酮的电化学免疫传感器的制备方法与应用，其突出的特点是：

45、本发明制备了镧系金属有机框架(ptca-la)作为发光体负载au纳米粒(aunps)，然后通过金属纳米粒子与氨基的键合作用装载大量二抗(ab2)，最终制备得到了ptca-la/au/ab2的信号探针溶液。ptca本身也是一种发光体，由于其水溶性差，发光信号弱且不稳定，但与镧系金属形成的有机框架(ptca-la)可以明显提高发光体的ecl信号及其稳定性，实现信号放大从而提高传感器的灵敏性。通过组装aunps作为中间连接体与二抗(ab2)交联形成示踪标记物，提高ab2负载量。本发明以复合材料ng-pei-mofnizn作为传感界面，捕获大量与玉米赤霉烯酮特异性结合的一抗(ab1)进一步实现信号放大。因此，本发明中以ng-pei-mofnizn为传感界面、ptca-la/au/ab2为信号探针，经过ab1、ab2和玉米赤霉烯酮的特异性结合，成功构建了ecl免疫传感器。与传统的玉米赤霉烯酮检测方法相比，本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，操作方便，设备材料价格低廉，无污染，从而为食品中玉米赤霉烯酮的检测提供了新的分析方法。

46、本发明的有益效果是：

47、1)通过制备的新型镧系金属有机框架(ptca-la)发光体，极大地改善ptca的低发光效率、容易团聚和发光稳定性差的特点，从而提高传感器性能实现信号放大作用，同时提高检测的灵敏度。

48、2)aunps具有良好的导电性，能提高电极导电性，同时通过金胺键负载抗体。

49、3)抗体用于目标物(抗原)的识别具有高度的特异性，可提高传感器的选择性，从而为微量玉米赤霉烯酮的检测提供了新的研究方向和分析方法。

50、4)涉及的材料均可在实验室条件下合成，具有操作简单，原材料价格低廉，毒性低、环境友好，而且每次使用量少，降低了实验成本。

51、5)整个检测分析方法步骤清晰简便，灵敏度高，信号响应迅速。

52、6)本方法制备的电化学免疫传感器可为玉米赤霉烯酮的检测提供新方法；该发明所制备的电致化学发光免疫传感器也可应用于其它生物样本测定、食品药品和环境的监测等方面。