一种阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法与流程

本发明属于药物分析，具体涉及一种阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法。

背景技术：

1、阿加曲班，化学名称(2r,4r)-4-甲基-1-[n-[(3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)磺酰]-l-精氨酰]-2-哌啶甲酸，分子式为c23h36n6o5s，分子量为508.6。阿加曲班为凝血酶抑制剂，具有高度选择性，可逆地与凝血酶活性位点结合，其抗凝血作用不依赖体内的抗凝血酶，而是直接与血液中游离的凝血酶结合并使其灭活，抗凝作用起效快。

2、抗凝治疗是治疗心血管疾病特别是急性冠脉综合征、肺栓塞和深静脉栓塞等血栓性疾病的重要措施之一。阿加曲班的分子量比较小，可以直接进入血栓内部，从而灭活已经与纤维蛋白结合的凝血酶，间接抑制凝血酶的产生，在治疗心血管疾病方面有很好的疗效。另外，阿加曲班可以调节内皮细胞功能，抑制血管痉挛，下调各种导致炎症和血栓的细胞因子，对血小板生成没有影响，不会像抗凝剂肝素一样诱发血小板减少和血栓。

3、阿加曲班对光热敏感，在光热条件下可能会发生降解产生降解产物3-甲基-8-喹啉磺酸，进一步的，3-甲基-8-喹啉磺酸可能与药物制剂中的辅料甘油与无水乙醇反应生成3-甲基-8-喹啉磺酸乙酯或3-甲基-8-喹啉磺酸甘油酯等杂质，这类杂质分子结构中有致基因突变警示结构，是潜在基因毒杂质。药物中的杂质可能会降低药物的疗效、影响药物的稳定性，甚至可能对人体健康产生危害或产生其他副作用，因此为了保证产品的质量与安全，需要一种质量控制方法来检测阿加曲班注射液中基因毒性杂质。

4、现有技术中，研究人员报道了一种检测阿加曲班中基因毒性杂质的方法(勾新磊,赵铁禅,赵婷,等.uplc-ms/ms法测定阿加曲班中4个基因毒性杂质[j].药物分析杂志,2019,39(11):5.)，基因毒性杂质包括3-甲基-8-喹啉磺酸、3-甲基-8-喹啉磺酸甲酯、3-甲基-8-喹啉磺酸乙酯、3-甲基-8-喹啉磺酰氯，该方法采用waters acquity uplc beh c18(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱；以0.1％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b进行线性梯度洗脱；流速0.2ml·min-1；采用esi离子源正离子模式，多反应监测模式下，以外标法对4个基因毒性杂质同时进行定量测定。但该方法操作复杂，且使用的仪器价格昂贵。

5、公开号为cn114689768a的中国专利文献公开了一种阿加曲班一水合物中杂质含量的分离检测方法，检测条件为：手性色谱柱，以甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氟乙酸、三乙胺的均匀混合物为流动相，柱温30±5℃，检测波长为220-270nm；该方法主要用于肼类杂质的控制。

6、因此，为了更加准确地控制阿加曲班注射液的产品质量，有必要开发一种简单、专属性良好的阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，该方法具有操作简单、设备要求低等优点，且专属性良好﹑精密度良好、准确度良好、重复性良好，检测灵敏度较高，实际检测效果良好。

2、具体采用的技术方案如下：

3、一种阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，包括以下步骤：采用c18色谱柱，利用高效液相色谱法进行梯度洗脱，以3-甲基丁酸铵溶液与醋酸铵溶液的混合溶液为流动相a，乙腈为流动相b，对阿加曲班注射液待测品制成的供试品溶液中的基因毒性杂质进行分析检测；

4、所述的基因毒性杂质包括杂质j和杂质k，结构式分别如下：

5、

6、本发明采用3-甲基丁酸铵作为流动相的组分，结合梯度洗脱程序的优化，可以有效地促进阿加曲班注射液中杂质j和杂质k的充分洗脱，提高检测方法的准确性。

7、优选的，c18色谱柱选用hypersil gold 4.6mm×250mm，5μm。

8、具体的，所述的高效液相色谱法的测试条件还包括：柱温为35～40℃，进样量为40～50μl，流速为1.0～1.2ml/min，检测波长为259nm。

9、优选的，柱温为40℃，进样量为50μl，流速为1.0ml/min。

10、优选的，所述的流动相a中，3-甲基丁酸铵溶液的浓度为8～10mmol/l，醋酸铵溶液的浓度为9～11mmol/l。

11、优选的，所述的流动相a中，3-甲基丁酸铵溶液和醋酸铵溶液的体积比为1～5:95～99。

12、梯度洗脱参数为：0～15.0min，60％～70％流动相a和30％～40％流动相b洗脱；15.01～30.0min，60％～70％流动相a和30％～40％流动相b洗脱；30.01～40.0min，20％～30％流动相a和70％～80％流动相b洗脱；40.01～50.0min，60％～70％流动相a和30％～40％流动相b洗脱。

13、优选的，每1ml的供试品溶液中含4.8～5.2mg阿加曲班。

14、优选的，将基因毒性杂质对照品用甲醇溶解，进一步使用60％甲醇稀释，制成各杂质浓度均为0.120～0.128μg/ml的混合对照溶液；以检测所述的供试品溶液的条件对所述的混合对照溶液进行分析检测，再根据外标法测得供试品溶液中基因毒性杂质的含量。

15、具体的，供试品溶液中基因毒性杂质的含量计算方法为：

16、

17、其中，w对1，w对2为对照品的称样量(mg)；

18、a对1，a对2为对照品溶液中主峰峰面积；

19、a供为供试品溶液中主峰峰面积；

20、d供为供试品的稀释倍数；

21、d对为对照品的稀释倍数。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

23、(1)本发明采用高效液相色谱法对阿加曲班注射液中基因毒性杂质进行检测，方法简单、设备要求低，采用3-甲基丁酸铵溶液与醋酸铵溶液的混合溶液为流动相a，乙腈为流动相b，同时结合梯度洗脱程序的优化，从而有效地促进阿加曲班注射液中杂质j和杂质k的充分洗脱。

24、(2)本发明检测方法专属性良好﹑精密度良好、准确度良好、重复性良好，检测灵敏度较高，符合相关法规和指导原则的要求，非常适用于阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测，能够为控制阿加曲班注射液质量提供有力保障。

技术特征：

1.一种阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：采用c18色谱柱，利用高效液相色谱法进行梯度洗脱，以3-甲基丁酸铵溶液与醋酸铵溶液的混合溶液为流动相a，乙腈为流动相b，对阿加曲班注射液待测品制成的供试品溶液中的基因毒性杂质进行分析检测；

2.根据权利要求1所述的阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，c18色谱柱选用hypersil gold 4.6mm×250mm，5μm。

3.根据权利要求1所述的阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法的测试条件还包括：柱温为35～40℃，进样量为40～50μl，流速为1.0～1.2ml/min，检测波长为259nm。

4.根据权利要求1所述的阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，柱温为40℃，进样量为50μl，流速为1.0ml/min。

5.根据权利要求1所述的阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述的流动相a中，3-甲基丁酸铵溶液的浓度为8～10mmol/l，醋酸铵溶液的浓度为9～11mmol/l。

6.根据权利要求1所述的阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，所述的流动相a中，3-甲基丁酸铵溶液和醋酸铵溶液的体积比为1～5:95～99。

7.根据权利要求1所述的阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，梯度洗脱参数为：0～15.0min，60％～70％流动相a和30％～40％流动相b洗脱；15.01～30.0min，60％～70％流动相a和30％～40％流动相b洗脱；30.01～40.0min，20％～30％流动相a和70％～80％流动相b洗脱；40.01～50.0min，60％～70％流动相a和30％～40％流动相b洗脱。

8.根据权利要求1所述的阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，每1ml的供试品溶液中含4.8～5.2mg阿加曲班。

9.根据权利要求1所述的阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于，将基因毒性杂质对照品用甲醇溶解，进一步使用60％甲醇稀释，制成各杂质浓度均为0.120～0.128μg/ml的混合对照溶液；以检测所述的供试品溶液的条件对所述的混合对照溶液进行分析检测，再根据外标法测得供试品溶液中基因毒性杂质的含量。

技术总结
本发明公开了一种阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测方法，属于药物分析技术领域，包括以下步骤：采用C18色谱柱，利用高效液相色谱法进行梯度洗脱，以3‑甲基丁酸铵溶液与醋酸铵溶液的混合溶液为流动相A，乙腈为流动相B，对阿加曲班注射液待测品制成的供试品溶液中的基因毒性杂质进行分析检测。本发明方法操作简单、设备要求低，能够使阿加曲班注射液中基因毒性杂质充分洗脱，且方法专属性良好﹑精密度良好、准确度良好、重复性良好，检测灵敏度较高，符合相关法规和指导原则的要求，非常适用于阿加曲班注射液中基因毒性杂质的检测，能够为控制阿加曲班注射液质量提供有力保障。

技术研发人员：刘景萍,刘全国,符丹玉,陈克领
受保护的技术使用者：海南葫芦娃药业集团股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15