一种HCG定量检测试纸、试剂盒的制作方法

本发明涉及hcg检测，尤其涉及一种hcg定量检测试纸、试剂盒。

背景技术：

1、hcg是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，它是由α和β二聚体的糖蛋白组成，对维持正常妊娠有着非常重要的作用。α亚基与垂体分泌的fsh(卵泡刺激素)、lh(黄体生成素)和tsh(促甲状腺激素)等基本相似，故相互间能发生交叉反应，而β亚基的结构各不相似。β-hcg于β-lh结构相近，但最后24个氨基酸延长部分在β-lh中不存在。

2、人绒毛膜促性腺激素在受孕后第8～10天开始分泌。在妊娠最初3个月，hcg水平每(2.2±0.5)天约升高一倍，到6～8周孕期hcg浓度达到高峰，至孕期第4个月始降至中等水平并一直维持到妊娠末期。因此，通过监测妊娠期β-hcg浓度的变化可提示胎儿发育的状况，胎儿正常发育时β-hcg的增长速率应符合正常规律，提示胎儿发育状况正常。此外，葡萄胎、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌及睾丸畸胎瘤等患者可伴有hcg升高。因此，在临床上能对hcg检测范围的定量准确检测对早期妊娠判断，妊娠相关疾病、滋养细胞肿瘤等疾病的鉴别和病程观察等有一定借鉴价值。

3、基于定量检测β-hcg对临床的重要性，降低hcg定量检测产品的检出限和扩大检测范围就显得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、便捷、检出限低且检测范围广的hcg定量检测产品。

2、为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种hcg定量检测试纸，所述检测试纸包括底板、样品垫、nc膜和吸水纸；

4、所述底板上依次设置样品垫、nc膜和吸水纸，所述样品垫和吸水纸靠近nc膜的一侧均搭接在nc膜两边沿上；

5、在所述nc膜上沿样本的流经方向依次设有一条检测线和一条质控线；

6、其中，所述检测线上包被有β-hcg单克隆抗体，所述质控线上包被有bsa-dnp偶联物；所述样品垫上喷涂有量子点偶联复合物qd以及荧光微球偶联复合物eu。

7、其进一步地技术方案为，所述nc膜的制备方法包括：

8、使用包被液将β-hcg抗体稀释至1-2mg/ml，使用包被液将bsa-dnp偶联物稀释至0.1-0.3mg/ml；

9、用喷金划膜仪分别将β-hcg抗体包被在检测线的位置，把bsa-dnp偶联物包被在质控线的位置；

10、包被完成后将nc膜置于40-60℃烤箱干燥42-48小时，备用。

11、本发明实施例所用的nc膜为赛多利斯cn140硝酸纤维素膜。

12、其进一步地技术方案为，每100ml的包被液含有以下成份：

13、0.50-0.65g的na2hpo4·12h2o、0.050-0.065g的nah2po4·2h2o、0.80-0.95g的氯化钠、3-6g的海藻糖、0.03-0.05ml的proclin300、余量为超纯水。

14、其进一步地技术方案为，所述量子点偶联复合物qd是由edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)在mes和bs(磷酸盐缓冲液)的溶液下，使量子点与β-hcg抗体和兔抗dnp抗体偶联在一起，形成的偶联复合物；

15、所述荧光微球偶联复合物eu是由edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)在mes的溶液下，使荧光微球与β-hcg抗体和兔抗dnp抗体偶联在一起，形成的偶联复合物。

16、其进一步地技术方案为，所述量子点偶联复合物qd的喷涂量为0.375-0.45ul/cm，所述荧光微球偶联复合物eu的喷涂量为0.0625-0.075ul/cm。

17、其进一步地技术方案为，所述量子点偶联复合物qd的制备过程具体如下：

18、1)活化：取30-60ul的量子点，加入200ul的mes活化液，再加入2-4ul的edc和nhs，震荡混匀，活化10-30min，然后离心(离心力30000g，4℃，25min)，去上清，得到活化完成的量子点；

19、2)标记反应：向步骤1)活化完成的量子点中加入200ul bs缓冲液，超声混匀，再加入15-25ug的β-hcg抗体和3-8ug兔抗dnp抗体，然后震荡混匀，标记反应1-3h；

20、3)清洗：步骤2)标记反应完成后，对反应体系离心(离心力25000g，4℃，25min)，去上清，向沉淀加入200ul的bs缓冲液，超声分散均匀，然后离心(离心力25000g，4℃，25min)，去上清，得到清洗完成的偶联物；

21、4)回收保存：向步骤3)清洗完成的偶联物中加入保存液，超声分散沉淀并定容至50ul，于2-8℃保存备用；

22、所述edc和nhs在使用前用mes活化液将其溶解成18-22mg/ml；

23、所述mes活化液的浓度为15-25mmol/l；所述bs缓冲液的浓度为15-25mmol/l。

24、其进一步地技术方案为，所述荧光微球偶联复合物eu的制备过程具体如下：

25、3)活化：取15-30ul的荧光微球，加入200ul的mes缓冲液，再加入0.5-1.5ul的edc和nhs，震荡混匀，活化10-30min，然后离心(离心力30000g，4℃，25min)，去上清，得到活化完成的荧光微球；

26、4)标记反应：向步骤1)活化完成的荧光微球中加入200ulmes缓冲液，超声混匀，再加入15-25ug/20ul的β-hcg抗体，然后震荡混匀，标记反应1-3h；

27、3)清洗：步骤2)标记反应完成后，对反应体系离心(离心力25000g，4℃，25min)，去上清，向沉淀加入200ul的mes缓冲液，超声分散均匀，然后离心(离心力25000g，4℃，25min)，去上清，得到清洗完成的偶联物；

28、4)回收保存：向步骤3)清洗完成的偶联物中加入保存液，超声分散沉淀并定容至50ul，于2-8℃保存备用；

29、所述edc和nhs在使用前用mes缓冲液将其溶解成18-22mg/ml；

30、所述mes缓冲液的浓度为80-120mmol/l。

31、其进一步地技术方案为，所述样品垫的制备方法如下：

32、将样品垫在预处理液中浸泡1-3min，然后将其置于30-50℃的烘箱中干燥18-24小时，密封保存备用；

33、按调试好的用量在干燥后的样品垫上喷涂量子点偶联复合物qd以及荧光微球偶联复合物eu；

34、喷涂完成后置于30-50℃的烘箱中干燥42-48小时，干燥完密封保存备用。

35、进一步地，所述预处理液的组成含有2mm bs、5％wt海藻糖、0.5％wt吐温20、0.25％wt酪蛋白钠盐、0.2％wt pvp40000、0.05mg/ml阻断剂、0.03mg/ml rbc，ph8.0。

36、进一步地，吸水纸在使用前进行以下处理：把采购到的吸水纸，放置在50-60℃烤箱干燥42-48小时，把干燥后的吸水纸裁成指定的大小备用。使用自封袋先包装起来，再用铝箔袋包装，在铝箔袋放置一定量的干燥剂，热封机封口备用。

37、进一步地，所述的hcg定量检测试纸的制备方法如下：

38、将底板、处理过的样品垫、nc膜以及吸水纸在湿度低于30％的环境中按预设结构层压成大板，然后切割成3～5mm宽度的若干试纸条；所述底板的材质为pvc。

39、第二方面，本发明提供一种hcg定量检测试剂盒，包括第一方面所述的hcg定量检测试纸。

40、第三方面，本发明提供一种检测hcg的方法，包括：

41、将样本与样本处理液混合，随后加入至层析试纸以进行反应；

42、将所述层析试纸放入检测仪以获得检测结果；

43、其中，所述层析试纸为如第一方面所述的hcg定量检测试纸。

44、进一步地，每1000ml样本处理液：含29g的na2hpo4·12h2o、2.9g的nah2po4·2h2o、8.5g的氯化钠、0.5ml的proclin300、余量为超纯水，ph7.4。

45、与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

46、现有的人绒毛促性腺激素(hcg)定量检测试剂盒，在偶联过程中通常采用单一的荧光示踪物来进行检测，但是，不同的荧光示踪物会有不同的浓度检测范围，例如，当示踪物为量子点时(100nm)在1:30的高稀释倍数下对浓度低的样本会无法检出，读值在cut off值以下；而偶联过程中采用荧光微球(300nm)为示踪物时，最低检出限会更低，在检测低浓度样本时可以有效的拉开梯度。因此，可以同时采用多种荧光示踪物来对hcg进行检测，以扩大检测范围。但是，经发明人验证，当多种荧光示踪物同时使用时，势必会加大对样品垫的喷垫量，检测时，由于喷垫量过高会对nc膜造成较为严重的堵膜，影响检测结果的准确性。

47、本发明在主要为量子点示踪的样品垫上加入少量偶联hcg的荧光微球，一方面，这样可以增加荧光微球示踪物对低浓度样本的检出率，低值样本差距会拉得更开，线性会更好，扩大样本检测范围；另一方面，荧光微球示踪物的添加量较低，不会造成堵膜现象。