基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统的制作方法

本发明属于荧光光谱显微成像领域，特别涉及一种基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统。

背景技术：

1、荧光光谱成像技术通过解析不同目标独特的光谱特征，是对多个事件或者多种结构进行并行探测的有力手段；在生命科学、医学、材料科学等相关领域具有重要的应用。其包含两个信息维度，即荧光发射光谱(emission spectrum)与荧光激发光谱(excitationspectrum)。通常的光谱成像技术是基于荧光发射光谱实现的，即在荧光信号的收集通路上放置分光元件(光栅或者棱镜)来获得探测位点的完整的光谱信息。目前的荧光发射光谱成像技术能够同时对多大4种不同的目标进行观测。虽然这种光谱采集方式在技术实现上更为直接，但是逐点扫描的成像方式极大地限制了光谱成像速度(大于5秒/帧)，这对高度动态目标的观测是不够的。另一个维度，与发射光谱不同，激发光谱成像却可以在宽场条件下采集样品的信息，从而大大提高光谱成像的速度，满足对高度动态目标的成像需求，成为最近发展起来的一个更具潜力的成像工具。由于激发光谱并不随着荧光信号探测端的硬件(比如探测器、滤光片等)改变和不同，整个成像系统的可扩展性、可迁移性也大大增加；而单一通道的荧光信号探测也避免了多通道探测中像差对后续图像配准的干扰。

2、但是目前的荧光激发光谱成像最多只能实现对六种不同目标结构的同时成像，这给实际成像应用中还是带来了挑战。一方面是细胞内部的结构非常复杂，六种成像目标往往不能满足对感兴趣空间结构或者过程的观测需求；另一方面，目前的成像波段通常局限于可见光波段的其中一部分，限制了成像过程中荧光标记物的选择。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种能够覆盖整个可见光波段的超多复用荧光激发光谱成像系统，用于同时获得荧光样品中的多达十个不同目标。在使用宽带光源的基础上，采用基于声光效应的激发波长选择器件，可以对荧光样品进行高速宽场成像的同时获得每一个像素的激发光谱信息，基于多通道的切换技术，可以极大地扩展激发光谱范围，实现在350-665纳米任意波长激发，最大可以获得24个不同激发波长的光谱图像，极大地增加了对多个成像目标的解析能力，可以实现超过十个不同目标的同时成像。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、一种实现多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，包括：

4、用于输出宽带光谱(2)的宽带光源(1)；

5、用于产生单波长光束(5)的激发波长选择器件(4)；

6、用于实现宽场荧光激发的激发光扩束单元(7)以及通道切换单元(8)；

7、用于进行荧光激发和收集的物镜(9)以及探测的宽场相机部分(12)；

8、用于实现相机帧率和激发波长同步的信号控制与同步单元(13)；

9、以及，

10、用于实现线性分解多色图像以及图像显示部分；

11、所述激发波长的产生部分包括用于输出宽带光谱2的宽带光源1，用于产生线偏振光的偏振片3，用于产生单波长光束5的激发波长选择器件4，以及用于过滤杂光的线性偏振片6。特别地，线性偏振片6的透光方向与线性偏振片3相互垂直。

12、所述激发光扩束单元7包括消色差透镜7-1、7-2和7-3；

13、所述激发光扩束单元7中，短焦距透镜7-1和长焦距透镜7-2构成一个4f系统，平行光束进入透镜7-1后聚焦在其焦点处；调整透镜7-2的位置，使得光束经过透镜后重新变成平行光束。透镜7-3重新将该平行光束聚焦于显微物镜9的后焦面处。

14、所述通道切换单元8中，机械转盘8-10用于安装三个通道滤光片组，同时实现不同波长通道的切换。通道1用于覆盖短波范围350纳米-500纳米，通道2用于覆盖中波范围450纳米-565纳米，通道3用于覆盖长波范围550纳米-665纳米。短通滤光片8-1、8-4、8-7分别用于覆盖激发波长λ1到λ8、λ9到λ16、λ17-到λ24的波长范围，二向色镜8-2、8-5、8-8将激发光反射进入显微物镜，同时允许产生的荧光信号经物镜9收集后在竖直方向透射，长通滤光片8-3、8-6、8-9用于进一步过滤非荧光信号。

15、所述样品10为可以产生自发荧光信号或通过外部荧光物质标记产生荧光信号。

16、所述荧光信号探测、图像采集存储单元包括：

17、用于将荧光信号聚焦到相机成像面的透镜11，用于探测微弱荧光信号的高灵敏度宽场相机12，以及用于读取相机电压信号，采集、传输和存储图像的计算机设备14；

18、所述信号控制与同步单元13主要用于读取宽场相机每一帧图开始曝光的触发信号，并通过模拟输出设备同步控制激发波长选择器件4的开关以及波长的选择。特别地，使得激发波长λ1,λ2,……λ24与每一帧荧光图像f1,f2,……f24一一对应。

19、所述图像处理和显示系统包括：

20、用于运行光谱分解算法进行多色图像分解的计算机程序15，以及多单色显微图像进行合成、显示的计算机设备(16)；

21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

22、1.采用宽带光源作为激发光源，避免了传统成像系统中集成大量单色激光器的复杂性和高的成像成本。

23、2.采用基于声光效应的波长选择器件实现和相机同步的波长扫描，显著提高了成像宽场成像速度。

24、3.采用多通道切换技术，可以极大地扩展激发光谱范围，实现在350-665纳米任意波长激发，最大可以获得24个不同激发波长的光谱图像，极大地增加了对多个成像目标的解析能力，可以实现超过十个不同目标的同时成像。

技术特征：

1.一种基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，其特征在于，所述宽带光源(1)具有覆盖可见光到近红外波段400纳米-2200纳米的连续光谱输出(2)，线性偏振片(3)置于其后用于产生线性偏振光束。

3.根据权利要求1所述的基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，其特征在于，所述激发波长选择器件(4)产生单波长光束(5)；信号控制与同步单元(13)同步激发波长选择器件(4)和宽场相机(12)的帧率，使得每一帧荧光图像f1,f2,……fn与激发波长λ1,λ2,……λn一一对应；线性偏振片(6)的光轴与(3)垂直，用于过滤杂光。

4.根据权利要求3所述的基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，其特征在于，激发波长选择器件(4)产生的单波长光束(5)的中心波长λ1,λ2,……λn在与样品(10)中成像目标的激发光谱的峰值位置一致的前提下均匀分布于通道切换单元(8)中三个通道的波长范围内。

5.根据权利要求1所述的基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，其特征在于，所述激发光扩束单元(7)包括：

6.根据权利要求1所述的基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，其特征在于，所述通道切换单元(8)包括：

7.根据权利要求1所述的基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，其特征在于，激发光束通过物镜(9)对样品(10)进行成像，并通过物镜(9)收集荧光信号。

8.根据权利要求1所述的基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，其特征在于，所述信号探测，图像采集存储、处理和显示系统包括

9.根据权利要求1或8所述的基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，其特征在于，所述光谱算法过程如下：

技术总结
一种基于多通道的超多复用荧光激发光谱成像系统，包括宽带光源、激发波长选择器件、激发光扩束单元、通道切换单元、信号控制与同步单元、显微激发和荧光探测系统，以及图像采集存储和图像分解部分。其中宽带光源输出覆盖整个可见光范围的光谱；波长选择器件筛选得到的特定波长光束经过物镜后辐照在样品上，激发后得到的荧光信号由相机探测。在多色荧光成像过程中，通过切换通道1‑3，且在每个通道扫描8个激发波长，并收集对应的8帧图像；从而得到包含24帧图的三维光谱图像数据；通过光谱分解算法处理，可以实现大于等于10个不同目标的超多复用荧光激发成像。本发明结合激发光谱扫描和多通道切换，显著提升了荧光成像中可以同时探测的目标数量。

技术研发人员：陈琨,曾虎
受保护的技术使用者：成都超分光学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15