基于镧系MOF和纸针的病原菌快速、准确检测方法

本发明属于生物检测，具体涉及基于镧系mof和纸针的病原菌快速、准确检测方法。

背景技术：

1、副溶血性弧菌(vp)是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，是引起腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部痉挛和低发热的人胃肠炎的主要原因，也是海产品中生物安全问题的主要来源。目前用于检测副溶血性弧菌的方法主要有传统方法、pcr、lamp、基因芯片、elisa、upt-lf等方法。以上几种方法有的存在检测速度过慢、成本高、仪器复杂、灵敏度差等缺点。因此，建立相关快速准确的检测方法，对海产品相关安全问题的检测尤为重要。

2、纸基器件可满足非专业人员在野外环境或资源有限地区对病原菌检测的需求。其中，侧向流试纸条作为最成熟的纸基器件之一，已成功应用于病原菌等目标物的快速检测中。由于侧向流试纸条检测存在灵敏度低、对信号标签有严格粒径要求的限制(一般小于100–200nm)以及依靠单一信号导致结果不准的问题，而其进一步发展受到了制约。

3、将信号标签在纸张界面上扩散的距离作为可视化信号的输出方式，可解决侧向流试纸条对信号标签颗粒限制的问题。其中，自带荧光的镧系mof(lnmof)由于颗粒大小适中，可顺利地在纸基界面上扩散一定的距离；此外，lnmof具有信号强度高、响应速度快的优点，可以在一定程度上提高纸基器件的检测灵敏度和检测速度。因此，基于镧系mof和纸基器件开发出适用于vp检测的方法，不仅有利于提高纸基器件对病原菌检测的准确度，而且有利于提高非专业人士操作的便利性。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于镧系mof(lnmof)和纸针的病原菌快速、准确检测方法，通过将lnmof与核酸适配体(特异性捕获靶标病原菌)(apt-lnmof)作为荧光生物传感器，以吸水纸作为视觉信号输出载体，构建了针形纸基器件(纸针)，既可以通过裸眼直接观察距离信号进行定性分析，又可以通过智能手机对r值进行定量分析，还可以通过将扩散距离和颜色强度两种信号相结合，进一步提高纸基器件对病原菌检测的准确度。

2、为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明第一方面提供了一种基于镧系mof和纸针的非疾病诊断和治疗目的的病原菌检测方法，包括以下步骤：

4、s1、制备镧系mof(lnmof)溶液：将四氯化锆、六水硝酸铕、2,6-萘二羧酸和2-氟苯甲酸溶于有机溶剂中，110-120℃下热处理40-60h，收集产物后经洗涤和复溶后即得；

5、s2、制备纸针器件：将吸水纸修剪成“t”字形器件；

6、s3、病原菌检测：将病原菌待测样品溶液、特异性捕获靶标病原菌的核酸适配体(apt)溶液和镧系mof溶液混合，静置反应20-30min后将纸针器件的针状端插入混合溶液中进行信号输出，再通过荧光激发观察荧光条带的扩散距离，与阴性对照相比扩散距离更短即为阳性结果。

7、优选地，所述病原菌为副溶血性弧菌(vp)，所述核酸适配体具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。

8、优选地，还可以通过红色荧光强度r计算病原菌浓度。

9、本发明以副溶血性弧菌(vp)为例，展示了本发明方法对病原菌进行快速、准确可视化分析的性能。如图1所示，检测的基本原理是：vp可以与apt-lnmof表面的适配体发生特异性的结合(阳性)，导致apt-lnmof发生聚集，从而缩短了apt-lnmof在纸针界面的扩散距离。相反，当没有vp(阴性)时，apt-lnmof保持分散状态，从而可在纸针界面扩散更长的距离。值得注意的是，在阳性反应中仍然存在部分处于非聚集状态的apt-lnmof，因此这部分apt-lnmof也会扩散较长的距离(靠近纸针器件吸水垫的位置)。由于在吸收垫附近显示的红色荧光会(r值)可随vp浓度的变化而变化，这一现象为第二信号的采集提供了前提。在信号采集方面，将吸收了阳性和阴性反应混合物的纸针置于254nm紫外灯下激发荧光产生颜色信号，然后分别通过裸眼观察(观察荧光扩散距离)或智能手机拍摄的方式(定量读取r值)可以进行定性和定量分析。

10、本发明所构建的检测方法，操作过程非常简单，只需要在室温下将样品与反应试剂经一步混合即可。经过20–30min的静置反应后，即可通过纸针器件快速输出可视化结果。这种检测策略非常适合非专业人员在现场环境下的操作，让病原菌可视化检测技术真正走出实验室成为可能。

11、更优选地，所述核酸适配体为氨基修饰的核酸适配体，序列为5'-nh2-tctaaaaatgggcaa aga aacagtgactcgttgagatact-3'。

12、优选地，以扩散距离d和红色荧光强度r相耦合的双信号ndual-pdual作为可视化结果的输出方式：ndual-pdual的计算参照公式(2)-(4)：

13、δr＝normalized rnegative–normalized rpositive(2)；

14、δd＝normalized dnegative–normalized dpositive(3)；

15、ndual-pdual＝(normalized dnegative+normalized rnegative)–(normalized dpositive+

16、normalized rpositive)(4)；

17、其中，normalized rnegative为阴性对照归一化r值，normalized rpositive为阳性样品归一化r值，normalized dnegative为阴性对照归一化距离，normalized dpositive为阳性样品归一化距离。

18、阳性结果为大于0的正值，阴性结果为0或小于0的负值。实际检测中，为了检测结果更可信，通常结果数值大于0.5为阳性(大于等于最低vp检测浓度所对应的数值)。

19、在定量分析时，先通过手机软件显示所选区域的rgb数值(只看r值)作为第二信号。将结果r值与肉眼观察的距离值(第一信号)代入计算公式(4)，然后将所得值代入工作曲线方程，计算所对应的细菌浓度。

20、优选地，s3中，核酸适配体溶液的浓度为0.4-0.6μm，镧系mof溶液的浓度为8-9mg/ml，病原菌待测样品溶液、核酸适配体溶液、镧系mof溶液的体积比为20：10：15。

21、优选地，s1所述四氯化锆、六水硝酸铕、2,6-萘二羧酸、2-氟苯甲酸的质量比为2-3、10-15：6-7：30-35。

22、优选地，s1所述有机溶剂为dmf和hno3的混合水溶液，水、dmf、hno3的体积比为3-4：14-15：0.2-0.5。

23、优选地，s1所述纸针器件的纸针区域宽度为2mm，长度为3cm，吸水垫为边长1cm的正方形。

24、优选地，使用前，先将纸针器件置于含1％bsa的pbs缓冲液中浸泡40-50min，再用水浸泡1-3min，对纸针器件进行防污改性。

25、优选地，核酸适配体溶液的溶剂为100mm ph＝7.5pbs，镧系mof溶液的溶剂为dmf。

26、本发明第二方面提供了一种用于病原菌检测的试剂盒，所述试剂盒包括镧系mof溶液、特异性捕获靶标病原菌的核酸适配体溶液和纸针器件。所述镧系mof溶液和纸针器件的制备具体见第一方面所述的步骤s1和s2。

27、优选地，所述核酸适配体具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。

28、更优选地，所述核酸适配体为氨基修饰的核酸适配体，序列为5'-nh2-tctaaaaatgggcaa aga aacagtgactcgttgagatact-3'。

29、优选地，所述试剂盒的使用方法为：将病原菌待测样品溶液、特异性捕获靶标病原菌的核酸适配体溶液和镧系mof(lnmof)溶液混合，静置反应20-30min后将纸针器件的针状端插入混合溶液中进行信号输出，再通过荧光激发观察荧光条带的扩散距离，与阴性对照相比扩散距离更短即为阳性结果。

30、更优选地，以扩散距离d和红色荧光强度r相耦合的双信号ndual-pdual作为可视化结果的输出方式：ndual-pdual的计算参照公式(2)-(4)：

31、δr＝normalized rnegative–normalized rpositive(2)；

32、δd＝normalized dnegative–normalized dpositive(3)；

33、ndual-pdual＝(normalized dnegative+normalized rnegative)–(normalized dpositive+

34、normalized rpositive)(4)；

35、其中，normalized rnegative为阴性对照归一化r值，normalized rpositive为阳性样品归一化r值，normalized dnegative为阴性对照归一化距离，normalized dpositive为阳性样品归一化距离。

36、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

37、本发明公开了一种基于镧系mof和纸针的病原菌检测方法，通过共价键将lnmof与核酸适配体(特异性捕获靶标病原菌)结合(apt-lnmof)构建了荧光生物传感器，然后以“t”字形的吸水纸作为视觉信号输出载体，通过优化吸水纸的几何形状和尺寸，构建了针形纸基器件(纸针)，检测时将病原菌待测样品溶液、特异性捕获靶标病原菌的核酸适配体(apt)溶液和镧系mof溶液混合，静置反应后将纸针器件的针状端插入混合溶液中进行信号输出，最后通过apt-lnmof在纸基界面的扩散距离和红色荧光强度(r值)进行定性或定量分析。一方面，以表面修饰了适配体的镧系mof(apt-lnmof)作为病原菌可视化检测策略的信号标签，利用镧系mof优异的荧光发光特性，提高了检测方法的灵敏度和响应速度。另一方面，以apt-lnmof在纸基界面的扩散距离和红色荧光强度(r值)两种信号相结合的方式作为可视化信号输出模式，既可以通过裸眼直接观察距离信号进行定性分析，又可以通过智能手机对r值进行定量分析，还可以利用r值与距离信号相耦合，提高检测结果的准确度。本发明以自制的纸针器件为双信号输出载体，结果易于读取，将一步式反应与自吸式纸针相结合，简化了操作步骤，有利于非专业人员的操作。