机械敏感的纳米机器及其制法和应用

本发明属于生物检测，特别是涉及一种基于核酸纳米结构的仿生机械敏感的纳米机器及其用于荧光检测膜张力的方法。

背景技术：

1、膜张力在众多细胞过程中扮演了重要的角色。在细胞层面，膜张力可以调节细胞迁移，细胞吞噬和细胞分裂等过程。一个典型的例子是，细胞膜张力的增加会影响子细胞间的稳定性从而延迟其分离的过程。在亚细胞的层面，膜张力同样起到了重要的作用。例如，增加膜张力可以抑制网格蛋白的聚合，激活膜融合过程从而抑制细胞内吞。此外，膜张力也可以调控机械敏感离子通道的打开和关闭，从而影响细胞的代谢过程。因此，膜张力检测技术在细胞迁移，细胞识别等领域具有广泛应用。

2、现有的膜张力检测手段可分为物理检测方法(如：微吸管技术，原子力显微镜，和光镊)和荧光检测方法两类。物理检测方法可以通过拉伸细胞膜直接测量膜张力的大小，具备较高的灵敏度。但该方法空间分辨率低下，实验操作复杂，并且难以实时对膜张力的变化进行检测。荧光检测方法则利用机械敏感的荧光探针，通过分子的荧光寿命反应膜张力的变化。该方法可以实现膜张力的原位检测，并且具备较高的高空间分辨率。但受限于荧光寿命成像较长的数据采集时间(通常需要几十秒生成一张图片)以及分子自身的受力截面限制，这一方法的时间分辨率较低，并且探针的灵敏度有待进一步提升。

3、因此，本领域尚缺乏一种高灵敏，且兼具高时空分辨率的膜张力检测装置和方法，这对于生物力学的发展具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种机械敏感的纳米机器及通过其测试膜张力的方法。本发明的纳米机器具有灵敏度高，时间分辨率高，生物相容性好等优点，在膜张力荧光检测方面具有显著优势，为细胞力学研究的发展开辟了新的道路。

2、在本发明的第一方面，提供了一种机械敏感的纳米机器，所述纳米机器包括：感应模块，所述感应模块为核酸纳米孔结构；以及膜张力响应模块，所述膜张力响应模块连接于所述感应模块；其中，当所述纳米机器嵌入膜后，所述纳米孔结构在膜张力变化时发生形变，并导致所述膜张力响应模块响应所述形变而发出对应于所述膜张力的荧光。

3、在另一优选例中，所述核酸纳米孔结构为围合结构，所述围合结构的中央为纳米孔。

4、在另一优选例中，所述纳米孔的直径为3-15nm；优选地，4-10nm；更佳地，5-8nm；最佳地，约6nm。

5、在另一优选例中，所述感应模块至少在径向上是可缩扩的。

6、在另一优选例中，响应于膜张力变化，所述膜张力响应模块从非极性状态转化为极性状态，从而发出响应于所述膜张力的荧光(或响应于所述膜张力的荧光强度)。

7、在另一优选例中，所述感应模块为由多个核酸棱柱复合形成的中空的多棱体。

8、在另一优选例中，所述多棱体为n棱体，其中n为3-20的整数；优选地，4-10；更佳地，5-8。

9、在另一优选例中，所述多棱体为三棱柱、四棱柱、五棱柱、六棱柱、七棱柱、八棱柱等。

10、在另一优选例中，所述感应模块由多条核酸棱柱拼接而成。

11、在另一优选例中，每一条核酸棱柱各自独立的连接有膜张力响应模块、锚定模块、参比模块、或其组合。

12、在另一优选例中，所述多棱体中有一条或多条核酸棱柱不连接上述模块。

13、在另一优选例中，所述膜张力响应模块包括膜张力响应型荧光报告分子。

14、在另一优选例中，所述膜张力响应型荧光报告分子包括但不限于是螺吡喃分子、flipper、tpe、laurdan、asp-pe等。

15、在另一优选例中，所述纳米机器为膜张力传感器。

16、在另一优选例中，所述纳米机器还包括锚定模块，所述锚定模块的一端与所述感应模块相连接，所述锚定模块的另一端用于与测试膜相连，用于将所述感应模块与所述测试膜锚定。

17、在另一优选例中，所述锚定模块包括疏水的锚定基团。

18、在另一优选例中，所述锚定基团包括但不限于是胆固醇基团、烷基链基团、维生素e基团、卟啉基团。

19、在另一优选例中，所述锚定模块包括一个或多个锚定基团。

20、在另一优选例中，所述锚定基团的数量为大于等于2的整数；优选地，为2-20；更佳地，为3-10。

21、在另一优选例中，多个所述锚定模块周向间隔地分布在所述感应模块的外周。

22、在另一优选例中，所述间隔是均匀的或基本均匀的。

23、在另一优选例中，所述纳米机器还包括参比模块，所述参比模块被配置为提供参比信号。

24、在另一优选例中，所述参比信号为荧光信号。

25、在另一优选例中，所述参比信号不响应或基本不响应膜张力变化。

26、在另一优选例中，所述参比模块连接于所述膜张力响应模块。

27、在另一优选例中，所述参比信号与所述膜张力响应模块的荧光光谱是互不干扰或可区分的。

28、在另一优选例中，所述参比模块包括但不限于是alexa fluor 488荧光团、alexafluor 647、atto 488、cy2、cy5等。

29、在另一优选例中，所述参比模块提供参照的可检测信号，该可检测信号不响应或基本上不响应膜张力变化。

30、在另一优选例中，所述的膜包括细胞膜或类似的脂质双层膜。

31、在另一优选例中，所述的膜具有脂质双层结构，如磷脂双层结构。

32、在另一优选例中，所述的膜还包括位于脂质双层结构(如磷脂双层)之间的胆固醇类化合物。

33、在本发明的第二方面，提供了一种制备如上所述的纳米机器的方法，所述方法包括步骤：

34、(a)提供多个核酸棱柱，其中至少一个所述核酸棱柱偶联所述膜张力响应模块；

35、(b)将所述多个核酸棱柱进行混合，从而组装形成本发明第一方面所述的纳米机器。

36、在另一优选例中，所述膜张力响应模块、所述锚定模块和所述参比模块分别设置在所述感应模块的相同或不同棱柱面上。

37、在另一优选例中，每一条核酸棱柱各自独立的连接有膜张力响应模块、锚定模块、参比模块、或其组合；或不连接上述任一模块。

38、在本发明的第三方面，提供了一种用于测定膜张力的方法，所述方法包括：

39、s1、提供本发明第一方面所述的纳米机器和测试膜；

40、s2、将所述纳米机器与所述测试膜混合，且使所述纳米机器嵌入所述测试膜；

41、s3、在预定的膜张力测试条件下测定所述膜张力响应模块发出的响应于所述膜张力的荧光；以及

42、s4、基于响应于所述膜张力的荧光，获得所述测试膜的膜张力的测定结果。

43、在另一优选例中，基于荧光强度获得所述测试膜的膜张力的测定结果。

44、需要说明的是，所述方法是非诊断非治疗的方法。

45、在另一优选例中，所述纳米机器包括参比模块。

46、在另一优选例中，在s3中还包括测定所述参比模块的参比信号。

47、在另一优选例中，所述参比模块提供参照的可检测信号，该可检测信号不响应或基本上不响应膜张力变化。

48、在另一优选例中，所述参比信号为荧光信号。

49、在另一优选例中，所述参比信号不响应或基本不响应膜张力变化。

50、在另一优选例中，所述参比信号与所述膜张力响应模块的荧光光谱是互不干扰或可区分的。

51、在另一优选例中，在s4中通过比较所述膜张力响应模块的荧光信号和所述参比模块的参比信号获得所述膜张力的测定结果。

52、在另一优选例中，所述膜张力响应模块发出第一荧光，所述第一荧光在第一波长下测定，所述第一波长为488±2nm。

53、在另一优选例中，所述参比模块发出第二荧光，所述第二荧光在第二波长下测定，所述第二波长为561±2nm。

54、在另一优选例中，通过所述膜张力响应模块的第一荧光和所述参比模块的第二荧光得到r/g值，所述r/g值与渗透压呈线性负相关的关系。

55、在本发明的第四方面，提供了一种膜张力测定装置，所述装置包括：复合膜形成模块，所述复合膜形成模块是由本发明第一方面所述的纳米机器和测试膜形成的复合结构；测定模块，所述测定模块用于测定第一荧光信号；处理模块，所述处理模块用于处理第一荧光信号，得出膜张力结果；以及任选的输出模块，所述输出模块用于输出所述膜张力结果。

56、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。