一种重组蛋白生物制品中有害残留物的检测方法与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种重组蛋白生物制品中有害残留物的高效检测方法。

背景技术：

1、二硫苏糖醇(dtt，dl-dithiothreitol)化学式为c4h10o2s2，为常用小分子有机还原剂，有抗氧化作用，是一种很强的还原剂。dtt通常用于防止二硫键的氧化，可以作为生物学实验中的抗氧化剂，也应用于重组蛋白的提取纯化。dtt的危险品代码标志是xn(有害)，有刺鼻的臭味，可因吸入、咽下、皮肤接触而危害健康。dtt属于巯基化合物，是强还原化合物，在体内可能会破坏蛋白质的结构，引起酶失活。同时dtt还可强化含砷和汞的化合物毒性，为确保生物制品的安全性，dtt残留是一种关键的质量控制指标。然而dtt极易被氧化，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构，即氧化型二硫苏糖醇(dttox，反式-1,2-二噻烷-4,5-二醇，trans-1,2-dithiane-4,5-diol)，dttox会使肌酸激酶结构发生变化，达到一定浓度时甚至会使肌酸激酶完全失活。因此必须测定dtt和dttox的残留量，现有技术的处理方式包括分别对两种物质进行检测以及对样品进行预处理，先采用氧化剂将dtt全部氧化成dttox之后再进行检测。从生产过程的角度，这些方法存在检测效率低、原料浪费的问题。此外，出于生产工艺优化和保证生物制品安全性的需要，有必要对dtt和dttox的含量进行定量区分。罗宁等在“高效液相色谱法测定药品中的二硫苏糖醇和氧化型二硫苏糖醇”中报道了采用waters x-bridge c18柱，能同时检出dtt和dttox，但流动相为体积比为30:70的甲醇－水(含0.02％三氟乙酸)，检测波长为210nm，不添加三氟乙酸时，会出现拖尾现象，拖尾会降低色谱峰的峰高，使得色谱峰斜率降低，终点不明显，导致积分出的峰面积不准确，使检测限和定量限偏高。对于重组蛋白制品来说，三氟乙酸会造成柱效损伤和样品结构改变，影响后续试验。

2、异丙基硫代半乳糖苷(iptg，isopropylβ-d-thiogalactoside)化学式为c9h18o5s，是异乳糖模拟物，能够引起乳糖操纵子的转录过程，因此能够诱导乳糖操纵子下游基因对应蛋白的表达。因其不被细菌代谢而十分稳定，普遍应用于原核表达系统，增加重组蛋白表达量提高生物制品稳定性。iptg的危险品代码标志是xn(有害)，长期暴露能够引起人体皮肤干裂。在罕见的情况下，它可以引起肿瘤发生。王荔等报道了重组人生长激素中的iptg的高效液相色谱-脉冲电化学检测方法，但存在脉冲电化学检测器普及程度低，容易被复杂基质干扰等问题(王荔,林碧蓉.反相高效液相色谱-脉冲电化学检测法测定重组人生长激素中异丙基-β-d-硫代半乳糖苷[j].色谱,2017,35(3):308-313.)。iptg作为一种半乳糖结构类似物，有类似单糖的化学结构。由于iptg的极性较强，现有的高效液相色谱法检测iptg的流动相主要采用极性较强的甲醇溶液，检测波长为230nm。金磊等报道了高效液相色谱-串联质谱法测定重组胰岛素中的iptg，同时发现使用高效液相色谱分离iptg时，常用的乙腈作为流动相色谱峰有明显的拖尾，将乙腈替换为极性稍大的甲醇后，色谱峰形对称性好。杨斌在“异丙基-0-d-硫代毗喃半乳糖甘溶液的稳定性研究”中报道了色谱柱选用c18，流动相为10％甲醇溶液时，定量限为mg/ml级别，若更换流动相为乙腈溶液，定量限还要升高(金磊,王鹏,胡骏杰,刘飞,曹婧.高效液相色谱-串联质谱法测定重组胰岛素中的异丙基硫代半乳糖苷[j/ol].分析试验)。

3、综上，iptg和dtt在大肠杆菌生产重组蛋白生物制品经常一起使用，iptg用于提高重组蛋白的表达量，dtt用于从包涵体中提取出重组蛋白生物制品后的溶解和复性，所以同时检测iptg，dtt，dttox在生物制品中的含量是非常有必要的。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种具备通用性及高性价比，且高效的用于重组蛋白生物制品的有害残留物的检测方法，该检测方法是通过反向高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：

2、色谱柱：单官能团硅烷键合相硅胶填料；

3、检测波长：201nm～215nm；

4、流动相：体积比5％～10％的乙腈水溶液，等度洗脱。采用乙腈作为流动相，相对于极性更高的甲醇检测波长更小，紫外吸收更强，检测限定量限更低，可以节约样品用量。柱压低，仪器损伤低。而甲醇作为流动相需要用较高的柱压。甲醇流动相适用较高的波长，否则，检测限较高，本方法中有机相比例低对重组蛋白结构影响小。

5、优选地，所述重组蛋白为病原微生物抗原性蛋白；更优选地，所述重组蛋白为病原微生物抗原性重组蛋白中间品和/或重组蛋白成品。

6、作为一种较佳的实施方式，所述病原微生物包括但不限于：人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、流感病毒、带状疱疹病毒、肺炎链球菌、脑膜炎球菌。

7、优选地，所述有害残留物选自二硫苏糖醇、氧化型二硫苏糖醇、异丙基硫代半乳糖苷中的一种或以上的组合。进一步优选为二硫苏糖醇和氧化型二硫苏糖醇的组合，更进一步优选为二硫苏糖醇、氧化型二硫苏糖醇和异丙基硫代半乳糖苷的组合。

8、优选地，所述流动相流速为0.1～1ml/min。

9、优选地，所述色谱柱的单官能团硅烷键合相硅胶填料带有空间位阻侧链基团；更优选地，所述色谱柱的单官能团硅烷键合相硅胶填料的单官能团硅烷键合相侧链上带有二异丁基侧链基团或者二异丙基侧链基团。此时，固定相由于引入了较大的侧链基团，立体阻碍了溶质基团进攻硅醇基，阻碍固定相中残留硅醇基与溶质之间的相互作用，进一步降低了固定相的极性。

10、作为一种较佳的实施方式，所述色谱柱任选自agilent zorbax sb-c18、agilentzorbax sb-c8、agilent zorbax sb-c3、agilent zorbax sb-phenyl、agilent zorbax sb-cn、agilent zorbax sb-aq或sunniest c18色谱柱。

11、优选的，检测波长为205nm～210nm，较佳为205nm。

12、本发明的目的之二是提供一种用于重组蛋白生物制品的有害残留物的定量检测方法，包括如下步骤：

13、s1、分别配制不同浓度的有害残留物的标准品溶液，采用上述任一的检测方法，获得各有害残留标准品溶液中的峰面积，并与标准品溶液浓度进行曲线拟合，得到所述线性回归方程y(x)；

14、s2、取待测重组蛋白生物制品，配液；

15、s3、取s2所得溶液，采用上述任一检测方法，获得待测液中各有害残留物的的峰面积x；

16、s4、按s01所得线性回归方程分别单独计算各有害残留物的的浓度y；

17、其中有害残留物为异丙基硫代半乳糖苷、二硫苏糖醇和/或氧化型二硫苏糖醇。

18、优先地，所述有害残留物的的线性回归方程分别为：

19、异丙基硫代半乳糖苷：y1＝2.992×10-6x1-0.2783

20、二硫苏糖醇：y2＝8.294×10-7x2+0.6864

21、氧化型二硫苏糖醇：y3＝8.462×10-7x3+0.1577。

22、本发明的目的之三是提供上述定量检测方法的应用，该定量检测方法用于用于同时重组蛋白生物制品的多种有害残留的定量检测。

23、优选的，上述检测方法的色谱条件为：

24、色谱柱：agilent zorbax sb-c18；

25、检测波长：205nm；

26、柱温：20-40℃；

27、流动相：体积比5％～10％的乙腈水溶液，等度洗脱；

28、流动相流速为0.1～1ml/min。

29、优选地，所述有害残留物的线性回归方程线性范围均为：浓度为2μg/ml～30μg/ml。

30、术语解释

31、反相色谱法(reversedphasechromatography)：流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法，简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性固定相，最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶，还有辛烷基硅烷键合硅胶等。流动相常用水与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中极大的组分因k值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。

32、拖尾：即色谱峰的右半边峰宽大于左半边峰宽的现象。

33、噪声：又称作基线噪声，基线的波峰到波谷的高度即所述噪声。

34、信号：待测物质的色谱峰的峰高。

35、信噪比：信号和噪声之间的比值。

36、检出限：流动相中样品组分在检测器上产生三倍基线噪声信号时相当的浓度或质量流量定为hplc法的检出限，也就是信噪比为3:1的时候的样品浓度。

37、定量限：流动相中样品组分在检测器上产生十倍基线噪声信号时相当的浓度或质量流量定为hplc法的定量限，也就是信噪比为10:1的时候的样品浓度。

38、本发明的有益效果：

39、1.本发明的方法可以同时检测重组蛋白成品及中间品中的多种有害残留，样品不需要经过复杂的预处理，流动相采用低浓度的乙腈溶液，对仪器和重组蛋白样品的影响更小，并且可以在更小的检测波长条件下达到检测目的，降低检测限和定量限，进样量只有10μl，节约样品用量，对于生物制品前期工艺优化阶段，样品比较少时的残留检测有比较高的友好度。

40、2.简单快速，对于仪器设备、试剂等无特殊要求，所有高效液相色谱仪都可以使用。

41、3.本发明的方法的检出限可达0.125μg/ml，远低于生物制品中其余杂质残留的限度要求(中国药典生物制品中其余杂质残留限度要求一般为1μg/ml～10μg/ml以下)，可以充分满足生物制品杂质残留检定的要求。

42、4.本发明成功建立了一种反相高效液相色谱法测定重组蛋白成品及中间品中iptg，dtt，dttox三种残留的方法，其专属性，检出限与定量限，线性范围，准确度，精密度、灵敏度都满足要求。