t-PAI·C检测试剂盒制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及t-pai·c检测试剂盒制备方法及其应用。

背景技术：

1、组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogenactivator，t-pa)与纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，pai-1)以1：1的比例形成组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物(tissue-type plasminogenactivator-plasminogen activator inhibitor-1 complex，t-pai·c)，是调节机体凝血与纤溶的重要因子。

2、组织型纤溶酶原激活物是主要由血管内皮细胞合成的一种糖蛋白，可以激活纤溶酶原，使其转变为纤溶酶，降解纤维蛋白。

3、纤溶酶原激活物抑制剂包括纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-1)和纤溶酶原激活物抑制剂-2(pai-2)。pai-1是主要由血管内皮细胞合成的一种糖蛋白，在灭活组织型纤溶酶原激活物，抑制纤溶的发生方面起主要作用。

4、t-pa与pai-1的作用部位是在其轻链的赖氨酸296～天冬氨酸304之间。正常情况下，血液循环中的大多数t-pa与pai-1以1：1的比例形成复合物，少量处于游离状态。血小板α颗粒中贮存着大量pai-1，当血管内皮细胞受到损伤时，血小板被凝血酶激活，pai-1释放至血小板α颗粒表面，t-pa表达量随之变化，造成t-pai·c浓度的异常。冠心病的许多危险因子诸如吸烟、高血压、糖尿病、肥胖等所伴有的血胰岛素增高、血中甘油三酯升高、高密度脂蛋白下降、高血糖等都可直接刺激血管内皮细胞pai-1的转录和分泌，此外，肿瘤病人中也常伴随pai-1的升高，这均可造成t-pai·c浓度的异常。

5、组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物可作为心血管疾病、肿瘤等疾病的早期检测及愈后分析的参考指标，与tat、tm等联合检测能提升静脉血栓栓塞、弥漫性血管内凝血等的预警效能。

6、目前，市场上组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物检测使用的多为酶标板，适用于全自动检测分析仪(化学发光法)的检测组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物的试剂种类较少，操作步骤较多，耗时长。随着该诊断项目越来越受到重视，市场需求也在急剧增加。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了t-pai·c检测试剂盒制备方法及其应用。本发明提供的检测试剂中，当样本中含有组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物时，包被磁微粒的抗体、标记有酶的抗体与组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物发生免疫反应，形成连接包被磁微粒的抗体-组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物-标记有酶的抗体“三明治”夹心免疫复合物；以磁微粒为载体，通过磁场吸附该免疫复合物，用清洗液清洗掉未反应的物质，得到包被磁微粒的抗体-组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物-标记有酶的抗体“三明治”夹心免疫复合物；通过加入化学发光底物液，“三明治”夹心免疫复合物上的酶作用于发光底物进而发光，通过检测发光信号，计算样本中组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物浓度。本发明试剂各组分较为稳定，重复性好，采用一步法，操作简单。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了检测试剂，包括：抗体包被的磁微粒和酶标记的抗体；

4、所述抗体包括：组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物抗体。

5、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述磁微粒包括：氨基磁微粒或羧基磁微粒。

6、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述磁微粒为羧基磁微粒。

7、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述酶包括：辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

8、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述酶为碱性磷酸酶。

9、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述抗体包被的磁微粒的终浓度为5～10mg/ml；所述酶标记的抗体的终浓度为0.5～1μg/ml。

10、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述抗体包被的磁微粒的终浓度为5mg/ml和/或10mg/ml。

11、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述酶标记的抗体的终浓度为0.5μg/ml和/或1μg/ml。

12、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂，还包括：0.01～200mm金属离子和0.05％～15％(w/v)稳定剂。

13、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，还包括：0.5～150mm金属离子和0.5％～2％(w/v)稳定剂。

14、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述金属离子包括：镁离子、锌离子、铝离子、锰离子、钠离子、钾离子和/或铜离子中的一种或多种；

15、所述稳定剂包括：牛血清白蛋白、氨基酸、多羟基化合物和/或聚合物中的一种或多种。

16、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述聚合物包括：聚乙烯吡咯烷酮-10、聚乙烯吡咯烷酮k30、聚乙烯吡咯烷酮p5288、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙二醇单甲醚、tritonx-100、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇12000、聚丙二醇2000中的一种或多种。

17、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述金属离子包括：铝离子、钠离子和/或铜离子中的一种或多种；

18、所述稳定剂包括：牛血清蛋白和/或聚合物；

19、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述聚合物包括：聚乙烯吡咯烷酮k30、聚乙烯醇、tritonx-100、聚乙二醇8000中的一种或多种。

20、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述金属离子包括：120mm钠离子、0.5mm铝离子和1mm镁离子；或

21、136mm钠离子、2mm铝离子和0.8mm铜离子；或

22、150mm钠离子、5mm锌离子和2mm铝离子。

23、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述稳定剂包括：3％牛血清白蛋白、2％聚乙烯吡咯烷酮p5288和0.5％tritonx-100；或

24、2％牛血清白蛋白、1％聚乙烯吡咯烷酮k30和2％聚乙二醇8000；或

25、1％牛血清白蛋白、2％聚乙烯醇。

26、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂，还包括：磁微粒缓冲体系和/或酶标记物缓冲体系。

27、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述磁微粒缓冲体系包括：mops缓冲体系、tris-hcl缓冲体系、pbs缓冲体系、hepes缓冲体系和/或甘氨酸缓冲体系中的一种或多种；

28、所述酶标记物缓冲体系包括：mes缓冲体系、tris-hcl缓冲体系、pbs缓冲体系、hepes缓冲体系、甘氨酸缓冲体系和/或硼酸缓冲体系中的一种或多种。

29、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，还包括0.02％(v/v)防腐剂。

30、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述防腐剂包括：proclin300和/或proclin600中的一种或多种。

31、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述防腐剂为：proclin300。

32、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述磁微粒缓冲体系为：pbs缓冲体系；

33、所述酶标记物缓冲体系为：tris-hcl缓冲体系；

34、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述磁微粒缓冲体系和所述酶标记物缓冲体系的ph值为7.1～7.3。

35、本发明还提供了上述检测试剂的制备方法，包括以下步骤：

36、s1：取所述磁微粒缓冲体系与磁微粒混合，清洗后，活化所述磁微粒，获得磁微粒溶液；

37、s2：取所述磁微粒溶液与所述抗体混合，孵育后，获得所述抗体包被的磁微粒；

38、s3：取活化后的所述抗体与活化后的酶混合，纯化后，与所述金属离子、所述稳定剂和所述酶标记物缓冲体系混合，获得所述酶标记的抗体。

39、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述磁微粒溶液与所述抗体的质量比为(80～100):1；所述活化后的所述抗体与所述活化后的酶的摩尔比为1:(1～2)。

40、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，s1中所述磁微粒缓冲体系与所述磁微粒的体积比为3:1。

41、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，s3中所述抗体的活化采用10～20mg/ml 2-imino thiolanehydrochloride，时间为5～10min。

42、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，s3中所述酶的活化采用5～10mg/ml smcc，时间为5～10min。

43、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述取活化后的所述抗体与活化后的酶混合的时间为18～24h。

44、本发明还提供了上述检测试剂和/或上述制备方法获得的检测试剂在制备检测组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物的试剂盒中的应用。

45、本发明提供了试剂盒，包括，上述检测试剂和/或上述制备方法获得的检测试剂以及可接受的助剂或载体。

46、本发明还提供了试剂盒的使用方法，取待测样品与所述试剂盒中的所述检测试剂混合，检测。

47、本发明提供了检测试剂，包括：抗体包被的磁微粒和酶标记的抗体；

48、所述抗体包括：组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物抗体。

49、本发明的有益效果包括：

50、(1)本发明提供的检测试剂中，当样本中含有组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物时，包被磁微粒的抗体、标记有酶的抗体与组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物发生免疫反应，形成连接包被磁微粒的抗体-组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物-标记有酶的抗体“三明治”夹心免疫复合物；以磁微粒为载体，通过磁场吸附该免疫复合物，用清洗液清洗掉未反应的物质，得到包被磁微粒的抗体-组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物-标记有酶的抗体“三明治”夹心免疫复合物；通过加入化学发光底物液，“三明治”夹心免疫复合物上的酶作用于发光底物进而发光，通过检测发光信号，计算样本中组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物浓度。

51、(2)本发明试剂各组分较为稳定，重复性好，采用一步法，操作简单。

52、(3)本发明提供的检测试剂中增加聚合物及金属离子，可使酶标记物分散均匀，防止聚集，维持其活性。