四氧化三钴纳米笼作为双重模拟酶在生物传感器中的应用的制作方法

本发明涉及模拟酶的，特别是指一种四氧化三钴纳米笼作为双重模拟酶在生物传感器中的应用。

背景技术：

1、纳米酶作为一种具有类酶活性的纳米材料，与天然酶相比，具有合成简单、成本可控、储存稳定、催化性能强、比表面积大、易于修饰以及与生物制剂集成等优点。迄今为止，越来越多具有不同类酶活性的纳米材料被发现，并且已被证明可以模拟过氧化物酶、氧化酶和超氧化物歧化酶等天然酶。这些纳米酶能够将多个反应步骤整合到一起，使检测过程变得更加方便和高效，具有巨大的优势与广阔的应用前景。

2、现有技术中也出现了一些纳米材料模拟酶，例如：cao等人通过煅烧前驱体ce-mofs获得了氧化铈纳米材料，这种氧化铈纳米材料表现出了良好的类氧化酶活性(cao etal.,chem.mater.30(2018)7831-7839)；另外，li等人通过热解二甲基咪唑钴(zif-67)合成了钴氮共掺杂分级多孔碳(co,n-hpc)纳米颗粒，该纳米颗粒具有多层结构和较大的比表面积，并拥有较高的类氧化酶活性(li etal.,sens.actuators b chem.264(2018)312-319)。但是，这些纳米材料模拟酶仅仅具有单酶活性，使其应用受到限制，而且，这种纳米材料模拟酶活性较低，稳定性差，灵敏度低。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种四氧化三钴纳米笼作为双重模拟酶在生物传感器中的应用，旨在解决现有技术中用作纳米材料模拟酶的氧化铈纳米材料和钴氮共掺杂分级多孔碳纳米颗粒仅具有单一酶活性使其应用受到限制而且存在活性较低、稳定性差和灵敏度低的问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明的一种四氧化三钴纳米笼作为双重模拟酶在生物传感器中的应用，所述四氧化三钴纳米笼既是过氧化物模拟酶又是氧化物模拟酶，所述四氧化三钴纳米笼既具有过氧化物酶的活性又具有氧化物酶的活性，所述四氧化三钴纳米笼用于测定过氧化氢、抗坏血酸和酸性磷酸酶的浓度。

4、本发明的四氧化三钴纳米笼是一种过氧化物模拟酶和氧化物模拟酶的双重模拟酶，用在生物传感器中，不仅实现了对过氧化氢浓度的快速检测，而且实现了对抗坏血酸浓度的快速检测，还实现了对酸性磷酸酶浓度的间接检测，检测效率高，灵敏度高，具有良好的稳定性和重复利用性，应用广泛；这种四氧化三钴纳米笼为中空笼状结构，具有较大的内部空间和较高的比表面积，有效增大了其与底物的接触反应面积。

5、作为一种优选的实施方案，所述四氧化三钴纳米笼测定过氧化氢的浓度的检测限为0.0046μm，所述四氧化三钴纳米笼测定抗坏血酸的浓度的检测限为0.15μm，所述四氧化三钴纳米笼测定酸性磷酸酶的浓度的检测限为0.0068mu/ml。本发明中，四氧化三钴(co3o4)纳米笼作为对底物进行催化氧化还原反应的过氧化物酶，实现了对过氧化氢(h2o2)浓度的快速检测，四氧化三钴(co3o4)纳米笼还作为对底物进行催化氧化还原反应的氧化物酶，实现了对抗坏血酸(aa)浓度的快速检测，并实现了对酸性磷酸酶(acp)浓度的间接检测，应用广泛；这种过氧化氢浓度、抗坏血酸浓度以及酸性磷酸酶浓度的检测限低，灵敏度高，检测范围广。

6、作为一种优选的实施方案，所述四氧化三钴纳米笼测定过氧化氢、抗坏血酸和酸性磷酸酶的浓度时，过氧化氢、抗坏血酸和酸性磷酸酶为待测物，四氧化三钴纳米笼与待测物的摩尔比为0.3-0.5:1。本发明中，四氧化三钴纳米笼作为过氧化物模拟酶和氧化物模拟酶的双重模拟酶，在测定过氧化氢、抗坏血酸和酸性磷酸酶的浓度时，其用量少，成本低，利用价值高。

7、作为一种优选的实施方案，所述四氧化三钴纳米笼测定过氧化氢、抗坏血酸和酸性磷酸酶的浓度时，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺为显色剂，显色剂与待测物的摩尔比为0.7-0.9:1。本发明中，四氧化三钴纳米笼作为过氧化物模拟酶和氧化物模拟酶的双重模拟酶，在测定过氧化氢、抗坏血酸和酸性磷酸酶的浓度时，被测物质(过氧化氢、抗坏血酸和酸性磷酸酶)和显色剂称为底物，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺为显色剂，反应体系由无色变为蓝色，颜色变化明显，方便观察。

8、作为一种优选的实施方案，所述四氧化三钴纳米笼测定过氧化氢、抗坏血酸和酸性磷酸酶的浓度时，以磷酸盐缓冲液为缓冲溶液，缓冲溶液的ph值为4.0，缓冲溶液与待测物的摩尔比为28-32:1。本发明中，采用磷酸盐缓冲液为缓冲溶液，磷酸盐缓冲液的摩尔浓度通常为50mmol/l，这种磷酸盐缓冲液容易配制，溶解速度快，溶解度高，使用效果好。

9、作为一种优选的实施方案，所述四氧化三钴纳米笼的粒径大小为800-900nm。本发明中，四氧化三钴纳米笼为黑色粉末状固体，粒径小，是一种纳米颗粒，为中空笼状结构，具有较大的内部空间和较高的比表面积，有效增大了其与底物的接触反应面积。

10、作为一种优选的实施方案，所述四氧化三钴纳米笼的制备方法是：1)取硝酸钴，加入到甲醇中，搅拌均匀，得硝酸钴甲醇溶液，硝酸钴甲醇溶液的质量浓度为19-20mg/ml；2)取2-甲基咪唑，加入到甲醇中，搅拌均匀，得2-甲基咪唑甲醇溶液，2-甲基咪唑甲醇溶液的质量浓度为98-99mg/ml；3)将步骤1)所得的硝酸钴甲醇溶液和步骤2)所得的2-甲基咪唑甲醇溶液混合，硝酸钴与2-甲基咪唑的质量比为3-5:2，在室温下，密封混合20-30h，得前驱体；4)将步骤3)所得的前驱体离心，洗涤，干燥，在惰性气体作用下，于350-450℃下，煅烧20-40min，于空气气氛下，保温20-40min，得四氧化三钴纳米笼。

11、本发明的四氧化三钴纳米笼是通过共沉淀和煅烧的方法而得到的，在四氧化三钴纳米笼的结构中，钴(co)元素与氧(o)元素的摩尔比为3:4；这种四氧化三钴纳米笼的制备工艺简单，易于控制，反应温度低，能耗小，反应时间短，生产效率高，成本低，在生物分析和药物研究方面具有广泛的应用。

12、作为一种优选的实施方案，所述步骤4)中，洗涤是采用甲醇洗涤，洗涤次数为3-5次。本发明中，前驱体为紫色沉淀物，这种紫色沉淀物采用甲醇洗涤，每次洗涤之后离心分离，洗涤3-5次，使其洗涤彻底。

13、作为一种优选的实施方案，所述步骤4)中，离心时的转速为5000-6000r/min，离心时间为4-6min。本发明的前驱体是离心而分离出来沉淀物的，控制离心时的转速和离心时间，实现了有效分离，操作方便。

14、作为一种优选的实施方案，所述步骤4)中，干燥为烘箱干燥，干燥温度为50-70℃，干燥时间为10-14h。本发明的前驱体在洗涤之后是在烘箱内干燥的，经过低温干燥，除去了其内含有的甲醇等溶剂；这种干燥方式，干燥方便，易于控制。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的四氧化三钴纳米笼是一种过氧化物模拟酶和氧化物模拟酶的双重模拟酶，用在生物传感器中，不仅实现了对过氧化氢浓度的快速检测，而且实现了对抗坏血酸浓度的快速检测，还实现了对酸性磷酸酶浓度的间接检测，检测效率高，灵敏度高，具有良好的稳定性和重复利用性，应用广泛；这种四氧化三钴纳米笼为中空笼状结构，具有较大的内部空间和较高的比表面积，有效增大了其与底物的接触反应面积，而且，其制备工艺简单，易于控制，反应温度低，能耗小，反应时间短，生产效率高，成本低，在生物分析和药物研究方面具有广泛的应用。