组织切片中原位单细胞荧光成像与拉曼光谱双模态检测装置及方法

本发明涉及一种组织切片中原位单细胞荧光成像与拉曼光谱双模态检测装置及方法，可实现微米级厚度组织切片中原位单细胞的荧光成像定位，并进而实现组织中原位单细胞的拉曼散射测量，获得原位细胞的形态学与多种生物分子信息。本发明可用于组织切片中靶向原位单细胞的分析和自动分类，在肿瘤学等领域具有重要应用。

背景技术：

1、临床肿瘤组织几乎保留了全部的原位信息，具有近乎完整的肿瘤微环境。目前对于组织切片以及组织中原位单细胞的大部分研究是通过he染色、免疫组化等方式来分析各种因子的变化，而免疫组化的研究技术在研究过程中需要多种特异抗体，且一种抗体对应一种靶向因子，使其研究成本较高，研究过程复杂。

2、荧光成像技术可实现组织切片中靶向原位单细胞的定位和形态学分析，但对于组织切片中细胞内多种脂质、糖类等物质的荧光标记存在很大的挑战，实现细胞内多种生物大分子的同时分析需要解决光路设计、多种荧光同时标记的困难和研究成本较高的问题。本发明利用自发拉曼散射技术获得通常需要多色染色才能获取的光谱信息，解决了需要多色荧光染色的问题。

3、越来越多的研究者通过拉曼散射技术对生物样本中多种分子的变化进行研究，从全分子角度分析疾病与物质变化的关系。拉曼散射技术可以快速、无标记、无损地测量样品的化学指纹，并显示出可用于癌症筛查、诊断以及其他物质状态分析的潜力。自发拉曼光谱具有较高的可重复性能和较多生物信息，适合用于癌症诊断及物质分子研究。如果仅通过拉曼散射技术从组织切片中获取靶向单细胞的生物分子信息，需要对整片组织进行全面扫描，进而对拉曼扫描成像结果进行分析。该实现方法存在很大局限性，一方面通过拉曼散射技术对整片组织进行扫描成像耗时长；另一方面组织中存在几十种不同的细胞，这对于目标单细胞的确定和研究存在很大的挑战。传统的自发拉曼散射检测获得了组织切片的全局信息，缺乏定位后单细胞的直接信息获取手段，本发明通过双色荧光成像定位到了靶向原位单细胞，解决了该问题，与此同时也可获得单细胞的特定细胞器的形态和生化信息。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种组织切片中原位单细胞荧光成像与拉曼光谱双模态检测装置；

2、本发明还提供了一种组织切片中原位单细胞荧光成像与拉曼光谱双模态检测方法；

3、为了从组织切片中实现特定原位单细胞拉曼光谱的捕获，本发明采用透射式荧光成像技术作为组织切片中靶向原位单细胞的定位系统，通过拉曼散射技术获得靶向原位单细胞的分子指纹谱。荧光显微技术可以快速检测到靶向单细胞，并且可以获得单细胞特定细胞器的形态和生化信息，而拉曼散射技术可以同时检测到多种分子物质，以上两种技术的结合靶向性高且会节省更多的时间和成本。本发明可应用于癌组织切片中原位单细胞的形态学和分子物质的双模态检测，并且结合机器学习，实现了多种物质分析和自动分类。

4、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

5、一种组织切片中原位单细胞荧光成像与拉曼光谱双模态检测装置，包括：

6、激光发射单元，用于：将两束不同波长的激光光束耦合在同一激发点上，同时激发待测样本；

7、样本控制单元，用于：带动待测样本实现三维空间移动；

8、透射式荧光成像采集单元，用于：采集待测样本组织切片中靶向原位单细胞的双色荧光图像，实现组织切片中靶向原位单细胞的荧光定位和特定细胞器形态、生化信息的获取；

9、背向式拉曼光谱采集单元，用于：采集待测样本组织切片中荧光定位的原位单细胞的拉曼光谱；

10、光谱分析单元，用于：在光谱预处理的基础上实现光谱的分析和自动分类。

11、根据本发明优选的，所述激光发射单元包括两个不同波长的激光光源、第一滤光片、第一显微物镜、第一二向色镜、反射镜、第二二向色镜、第二显微物镜；

12、激光光源发出的激光光束依次经过第一滤光片、第一显微物镜后，与另一个激光光源发出的激光光束以相互垂直的角度分别从第一二向色镜的两面穿入后共束，再同时经反射镜和第二二向色镜控制传播方向后，经第二显微物镜聚焦到待测样本的同一中心点上。

13、进一步优选的，两个不同波长的激光光源包括二极管半导体固体激光器和二极管泵浦晶体激光器。

14、根据本发明优选的，所述样本控制单元包括用于固定待测样本组织切片的固定器和带动待测样本沿x轴、y轴以及z轴移动的三轴位移台。

15、根据本发明优选的，所述透射式荧光成像采集单元包括依次沿光路设置的第三显微物镜、第二滤光片、第三二向色镜、镜筒透镜、第三滤光片、cmos探测器；

16、第三显微物镜聚焦精确定位后的待测样本的荧光信号，荧光信号经第二滤光片和第三二向色镜滤除激发光后，再经镜筒透镜和第三滤光片后将双色荧光图像聚焦到cmos探测器平面，cmos探测器记录双色荧光图像。

17、根据本发明优选的，所述背向式拉曼光谱采集单元包括依次沿光路设置的第二显微物镜、第二二向色镜、第四滤光片、第一胶合透镜、小孔、第二胶合透镜、拉曼光谱仪；

18、待测样本的拉曼散射信号经与激发端的第二显微物镜聚焦，经过第二二向色镜和第四滤光片滤除激发光和部分荧光，再通过第一胶合透镜、小孔、第二胶合透镜实现非聚焦位置处盖玻片和基底片拉曼光谱的去除，最后由拉曼光谱仪获取聚焦位置处待测样本的拉曼光谱。

19、根据本发明优选的，所述光谱分析单元，包括光谱预处理模块和支持向量机自动分类模块；

20、所述光谱预处理模块，用于：去宇宙射线、平滑、去荧光基底、去基底片背景、归一化处理；

21、所述支持向量机自动分类模块，用于：将预处理后的拉曼光谱分为训练集和测试集，并结合十折交叉验证，实现待测样本的自动分类。

22、一种组织切片中原位单细胞荧光成像与拉曼光谱双模态检测方法，通过上述拉曼光谱检测装置实现，包括步骤如下：

23、(1)启动激光发射单元，校准光路，确定双色激光光束在同一中心线上，且经第二显微物镜中心并聚焦，记录双色激光光束的聚焦光斑位于同一中心点；

24、(2)控制三轴位移台移动待测样本，使固定在三轴位移台上的待测样本位于第二显微物镜和第三显微物镜焦平面上，校准光路，触发拉曼光谱仪记录到测试样本最高强度的拉曼信号；

25、(3)将待测样本即待测荧光染色组织切片样本固定在三轴位移台上；

26、(4)控制三轴位移台移动待测样本，使待测样本位于第二显微物镜和第三显微物镜焦的焦平面上，触发cmos探测器记录组织切片中原位细胞的双色荧光图像；

27、(5)单激光束激发由荧光成像定位到的靶向原位单细胞的拉曼信号，触发拉曼光谱仪记录所测点的拉曼光谱；

28、(6)将由拉曼光谱仪获取的拉曼光谱输入至光谱预处理模块和支持向量机自动分类模块，进行样本的光谱预处理分析和分类。

29、本发明的有益效果为：

30、1、本发明采用拉曼散射技术实现细胞等生物样本分子层次的物质分析，该技术可同时获取单点样本多种生物分子之间的含量关系；

31、2、本发明采集装置具备两个工作模式，可以同时捕获样本的荧光图像和拉曼光谱信号，荧光成像技术可快速定位到原位靶向单细胞且获得单细胞特定细胞器的形态和生化信息，拉曼散射技术可同时检测待测样本的多种生物分子信息；

32、3、本发明适应于微米级临床组织切片样本中靶向原位单细胞的分析，可从单细胞角度去分析生物分子等物质变化，且保留了细胞的原位信息；

33、4、本发明采用双波长激光束耦合，同时激发样本特定区域，实现靶向单细胞的双重验证；

34、5、本发明能够实现对癌与癌旁组织切片中单细胞的快速自动分类，摆脱了人工阅片的繁琐过程；

35、6、本发明适用于其他生物细胞的识别与分类，具备普遍推广性。