一种基于NDR1-Myc互作抗结直肠癌活性分子筛选方法和应用

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及一种基于ndr1-myc互作抗结直肠癌活性分子筛选方法和应用。

背景技术：

1、结直肠癌(colorectal cancer，crc)是全球发病率位居第三的恶性肿瘤(10.2％)，在癌症相关的死亡率中位居第二(9.2％)。随着人们生活方式的改变，结直肠癌发病率和死亡率逐年上升。在中国每年新发病例37.6万，超过一半的患者在诊断时已至中晚期。目前，根治性切除术是结直肠癌首选的治疗方式，但术后复发率高，大多数晚期患者化疗、联合/或靶向治疗的疗效有限，易耐药。因此，亟待寻找新作用机制的靶向药物，以改善结直肠癌患者的总体生存和生活质量。

2、myc也称为c-myc(由myc基因编码)，是原癌基因家族中第一个被发现的成员，同家族还有n-myc和l-myc，它们对肿瘤的形成及预后具有不同作用。myc在大于70％-80％的结直肠癌患者中过表达，myc高表达和肿瘤远端转移是结直肠癌进展中的晚期事件，代表更恶性和侵略性的临床表型，提示病人预后较差。与结直肠癌发病密切相关的信号通wnt/apc/β-catenin和rtk/ras/mek/erk等异常激活均会增加myc的表达和蛋白质稳定性。myc还可正调控整合素，如itga6(integrin alpha-6)、itgb1(integrin beta-1)和itgb4(integrinbeta 4)等，加快结直肠癌的进展。最近的研究报道：myc表达异常可引起结直肠癌的代谢重编程，改变121个代谢基因、39个转运蛋白基因的表达，并诱导至少215个代谢反应。而在结直肠癌细胞中敲除myc，则改变癌细胞的代谢途径，抑制癌细胞生长。通过抑制翻译起始因子eif4a、mir-487b、敲除hoxb8、bet抑制剂以及wnt或mapk抑制剂和bet抑制剂jq1的联合用药等方式降低myc的表达，均可抑制结直肠癌。因此，靶向myc的药物开发一直是抗结直肠癌研究的热点领域。

3、然而，myc作为超级转录因子在正常生理状态下也发挥重要功能。在正常细胞中，myc调控整个基因组约15％的基因转录，涉及编码或非编码蛋白的基因，它们参与不同的细胞功能，包括dna修复、转录、翻译、细胞粘附和骨架、细胞周期、信号转导、代谢、蛋白质生物合成与血管生成等。因此，直接抑制myc表达也会对myc正常生理功能产生不良影响。

4、事实上，myc为天然无序蛋白，缺乏明显的小分子结合位点，目前尚无直接靶向myc的药物，因此寻找直接作用于myc蛋白的小分子抑制剂长期以来都是国际上药物开发的重大难题。研究者已尝试通过调控myc的转录、翻译、激活和稳定性等多种方法，抑制myc的过表达。如brd4(溴结构域蛋白4)、cdk7(细胞周期蛋白依赖性激酶7)和cdk9(细胞周期蛋白依赖性激酶9)的抑制剂可在转录水平抑制myc的表达；抑制pi3k/akt/mtor途径可阻断myc的翻译；而usp7(泛素特异性蛋白酶7)、aurka(aurora激酶a)和plk1(polo样激酶1)抑制剂可在翻译后水平降低myc蛋白的稳定性；10058-f4和omomyc可以阻断myc/max二聚体复合物。目前以brd4等为靶点的药物，在各种肿瘤模型中都显示出良好的生物学活性，已经进入临床试验研究阶段。但文献和专利等公开报道的抑制剂结构类型仍相对有限、小分子化合物成药性亟待提高。因此，探索基于抑制myc表达及活性的新机制，对于结直肠癌等myc高表达肿瘤的治疗具有重要意义。

5、ndr1(nuclear dbf2-related kinase 1，核dbf2相关蛋白激酶1，也叫serine/threonine-protein kinase 38，stk38)是环腺苷酸(camp)和环鸟苷酸(cgmp)依赖性蛋白激酶和蛋白激酶c(pkc)相关蛋白激酶亚家族的一员，其它三个成员为：ndr2(stk38l)、lats1和lats2。它们的序列从酵母到人类都是高度保守的。ndr1的n末端为mob1(mobkinase activator 1b)共激活因子结合结构域(mbd)，中间为蛋白激酶结构域，c末端为疏水基序(hm)。在正常细胞中，ndr/lats激酶活性受到严格调控。当辅助蛋白mob1结合到mbd上，引起激酶内部的自磷酸化(ndr1/2中的ser281/282或lats1/2中的ser909/872)，然后其上游蛋白激酶mst1，mst2和/或mst3磷酸化hm区的位点(ndr1/2中的thr444/442或lats1/2中的thr1079/1041)，激酶活性增加，调控有丝分裂，细胞形态，细胞增殖和凋亡等多种重要的生理功能。ndr1在先天免疫反应中起重要作用，可正调控抗病毒天然免疫应答，在宿主感染期间抑制炎性细胞因子的产生，保护宿主免于炎症损伤。

6、对于ndr1与结直肠癌的关系，zhang等揭示：ndr1和ndr2作为哺乳动物中两个高度相似的亚型，存在功能上的补偿效应。敲除c57bl/6小鼠小肠上皮细胞内的ndr1/2，小鼠易患结直肠癌。进一步机制研究证实ndr1/2在人结直肠癌中作为yap1上游关键的肿瘤抑制因子起作用。虽然目前对ndr1在体内功能的认识有限，但已有的研究表明ndr1对于维持人体正常的生理功能必不可少，也是结直肠癌关键的抑制因子。

7、蛋白-蛋白互作(ppi)一直是肿瘤和其他疾病治疗药物研究的热点。2017年，fda批准了首个真正意义上的bcl-2/bax ppi抑制剂venetoclax，用于治疗复发、难治性的17p缺失的慢性淋巴细胞白血病(cll)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)。由于直接靶向myc的药物研发存在挑战，所以研究者也纷纷探索靶向myc ppi的药物研究策略。但这些研究大多处于ppi抑制剂发现阶段，仍需进一步探究这些ppi在肿瘤发生中的重要作用以及阻断这些ppi界面是否能起到抗肿瘤的作用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于ndr1-myc互作抗结直肠癌活性分子筛选方法和应用。用于发现通过靶向ndr1/myc互作治疗结直肠癌的活性分子，本发明有望为临床治疗结直肠癌提供新思路。

2、为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种肿瘤治疗药物的筛选方法，以ndr1与myc相互作用为筛药靶点。

4、所述以ndr1与myc相互作用为筛药靶点是指：考察药物对于ndr1与myc间相互作用有影响的药物，从而获得治疗肿瘤的药物。

5、进一步地，所述筛选方法，选择能够阻断ndr1与myc特异结合的抑制剂作为肿瘤治疗药物的活性成分。

6、所述备选药物可以是单一的化合物，多肽，也可以是药物组合物。

7、更具体地，本发明的肿瘤治疗药物的筛选方法，包括如下步骤：

8、(1)建立ndr1与myc蛋白互作系统；

9、(2)利用所建立的蛋白互作系统，检测候选物质抑制ndr1与myc特异结合的能力。

10、进一步地，步骤(2)中，可在细胞水平标准进行候选物质抑制ndr1与myc特异结合的能力的检测。

11、进一步地，所述筛选方法，还包括抗肿瘤作用的验证试验。

12、进一步地，所述筛选方法，将筛选得到的物质以肿瘤细胞为试验对象，进行抗肿瘤的验证试验。

13、进一步地，所述的抗肿瘤的验证试验是指细胞增殖实验或者靶向性实验的验证。

14、进一步地，所述肿瘤选自结直肠癌。对应地，所述肿瘤细胞选自结直肠癌细胞。所述肿瘤细胞选自hct116、ht-29或dld-1细胞。

15、本发明的药物筛选方法所得到的活性物质可以用于制备抗肿瘤药物。如果活性物质是化合物，一般具有明确的结构式。

16、本发明的第二方面，提供ndr1与myc相互作用为筛药靶点用于筛选肿瘤治疗药物中的新用途。

17、进一步地，选择能够阻断ndr1与myc特异结合的抑制剂作为肿瘤治疗药物的活性成分。

18、进一步地，所述肿瘤选自结直肠癌。

19、本发明的第三方面，提供ndr1与myc相互作用抑制剂在制备肿瘤治疗药物中的新用途。

20、进一步地，所述ndr1与myc相互作用抑制剂是指能够阻断ndr1与myc特异结合的抑制剂。

21、进一步地，所述肿瘤选自结直肠癌。

22、进一步地，所述ndr1与myc相互作用抑制剂可以是单一的化合物，多肽，也可以是药物组合物。

23、进一步地，所述ndr1与myc相互作用抑制剂选自manidipine，benidipinehydrochloride或mn3。

24、进一步地，所述ndr1与myc相互作用抑制剂是肿瘤治疗药物的活性成分。

25、亦即，所述肿瘤治疗药物必然包括ndr1与myc相互作用抑制剂，ndr1与myc相互作用抑制剂作为肿瘤治疗药物的有效成分。

26、所述肿瘤治疗药物中，发挥治疗功用的有效成分可仅为所述ndr1与myc相互作用抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

27、亦即，ndr1与myc相互作用抑制剂为所述肿瘤治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

28、所述肿瘤治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

29、所述肿瘤治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

30、所述肿瘤治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

31、本发明的第四方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，为向对象施用ndr1与myc相互作用抑制剂。

32、所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人等。所述细胞可以为离体细胞。

33、所述对象可以是罹患疾病的患者或者期待治疗的个体。

34、所述ndr1与myc相互作用抑制剂可以在接受治疗前、中、后向对象施用。

35、进一步地，所述肿瘤选自结直肠癌。

36、进一步地，所述ndr1与myc相互作用抑制剂可以是单一的化合物，多肽，也可以是药物组合物。

37、进一步地，所述ndr1与myc相互作用抑制剂选自manidipine，benidipinehydrochloride或mn3。

38、本发明的第五方面，提供一种肿瘤治疗药物，包括有效剂量的ndr1与myc相互作用抑制剂。

39、进一步地，所述肿瘤治疗药物，包括有效剂量的ndr1与myc相互作用抑制剂及药用载体。

40、所述肿瘤治疗药物必然包括ndr1与myc相互作用抑制剂，ndr1与myc相互作用抑制剂作为肿瘤治疗药物的有效成分。

41、所述肿瘤治疗药物中，发挥治疗功用的有效成分可仅为所述ndr1与myc相互作用抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

42、亦即，ndr1与myc相互作用抑制剂为所述肿瘤治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

43、所述肿瘤治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

44、所述肿瘤治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

45、以ndr1与myc相互作用抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。“药学上可接受的载体或辅料”和ndr1与myc相互作用抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

46、所述肿瘤治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

47、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

48、本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，以ndr1与myc相互作用为筛药靶点，可以筛选肿瘤治疗药物。在此基础上，开发了一种特异性的肿瘤药物筛选方法。通过靶向ndr1/myc互作治疗结直肠癌的活性分子，本发明有望为临床治疗结直肠癌提供新思路。