靶点Nesfatin-1在预防或治疗血管钙化中的应用

本发明涉及靶点nesfatin-1在预防或治疗血管钙化中的应用，属于分子生物医疗。

背景技术：

1、血管钙化是动脉粥样硬化过程中的一个重要特征，指的是在动脉壁中沉积过多的钙盐。大量的研究表明，血管钙化与心血管事件(如心脏病发作和中风)之间存在密切关联。动脉壁中的钙盐沉积加剧了血管狭窄和血液不正常流动，使血管更容易发生血栓形成和血管阻塞，从而导致心血管事件的发生。针对血管钙化的有效预防和治疗方法一直是医学领域的一个重要挑战，目前研究主要关注于血管钙化的发生机制和影响因素，例如炎症、氧化应激、细胞凋亡等。

2、nesfatin-1是一种由脑和胃部分泌的多肽激素，最初于2006年由日本研究人员在大鼠体内发现。nesfatin-1的前体蛋白(nesfatin precursor protein)经酶切生成nesfatin-1，nesfatin-1被认为在多个生理过程中发挥重要作用，包括食欲调节、能量代谢、自主神经调节和体重控制等。已有研究发现，血清nesfatin-1水平与冠状动脉疾病的发病率和严重程度负相关，但是不清楚具体机制。虽然动脉粥样硬化是冠状动脉疾病的主要病理基础，血管钙化又与动脉粥样硬化密切相关，但没有明确的证据表明nesfatin-1与血管钙化之间存在直接的因果关系。

3、目前临床关于血管钙化的治疗存在诸多局限性，其中主要的治疗方法包括药物治疗、改变生活方式(如饮食和运动)以及手术干预(如血管成形术和搭桥手术)。然而这些方法并不适用于所有患者，并存在安全风险、疗效不确切、复发率高、副作用大等问题。因此，寻找有效的血管钙化治疗方法与药物具有积极意义，为血管钙化治疗与药物研发提供新思路。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明首次将nesfatin-1作为一个可用于预防或治疗血管钙化的制药靶点，并基于nesfatin-1设计具有预防或治疗血管钙化功能的靶向shrna，并筛选了天然产物乙酸柏木酯(cedryl acetate)等用于预防或治疗血管钙化。本发明具有突破性意义，为寻找有效的血管钙化治疗方法及药物制备提供了新思路。

2、本发明的第一个目的是提供靶点nesfatin-1在制备预防或治疗血管钙化药物中的应用。

3、本发明的第二个目的是提供一种研究与血管钙化相关的基因的功能、或者筛选用于预防或治疗血管钙化的药物、或者构建血管钙化疾病模型、或者分析基因治疗血管钙化药物的方法，所述方法包括利用含有特异性敲降血管平滑肌nesfatin-1基因的腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)shrna干扰载体来降低nesfatin-1的表达。

4、在一种实施方式中，所述应用能够在体外细胞中，或者在体内动物模型中，或者在筛选药物中，预防或治疗血管平滑肌血管钙化。

5、在一种实施方式中，所述干扰载体的构建和筛选方法包括如下步骤：

6、(1)通过基因测序技术确定nesfatin-1基因的序列；

7、(2)设计候选aav-shrna序列，shrna是双链rna分子，由两个互补的单链rna序列组成，所设计的aav-shrna序列与nesfatin-1基因的特定区域具有互补性；

8、(3)最终选择对nesfatin-1基因表达水平或钙化具有最显著抑制效果的aav-shrna作为最佳候选。

9、在一种实施方式中，所述aav-shrna的核苷酸序列是seq id no.1-6所示的序列，其中aav-shrna1的核苷酸序列为seq id no.1-2；aav-shrna2的核苷酸序列seq id no.3-4；aav-shrna3的核苷酸序列seq id no.5-6。

10、本发明的第三个目的是提供一种能够预防或治疗血管钙化的药物，所述药物能够抑制nesfatin-1基因或蛋白的表达。

11、在一种实施方式中，所述药物是一种基因疗法的载体，包括基因编辑、基因表达调控或基因传递的载体；或者所述药物是细胞疗法的载体，包括干细胞、免疫细胞或修复细胞。

12、在一种实施方式中，所述药物通过调节nesfatin-1信号通路或下游效应分子来预防或治疗血管钙化。

13、在一种实施方式中，所述药物包括如下一种或多种：香柏乙酸酯(cedrylacetate)、酮异樟酮(ketoisophorone)、尼古丁(cotinine)、松油乙酸酯(bornylacetate)、丁香酚(eugenol)、青蒿素(artesunate)、雌激素苯乙酸酯(estropipate)、黄酮酮(flavanone)、雌炔诺酮(ethisterone)。优先地，所述药物中含有香柏乙酸酯(cedrylacetate)。

14、在一种实施方式中，所述药物的剂型包括口服液、注射剂、片剂、丸剂、分散剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、悬浮剂、乳剂。

15、本发明的第四个目的是提供天然产物在制备预防或治疗血管钙化的药物中的应用，所述天然产物包括如下一种或多种：香柏乙酸酯(cedryl acetate)、酮异樟酮(ketoisophorone)、尼古丁(cotinine)、松油乙酸酯(bornyl acetate)、丁香酚(eugenol)、青蒿素(artesunate)、雌激素苯乙酸酯(estropipate)、黄酮酮(flavanone)、雌炔诺酮(ethisterone)。优先地，所述药物中含有香柏乙酸酯(cedryl acetate)。

16、本发明的第五个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物是用于预防和治疗血管钙化的药物组合物或抑制nesfatin-1表达的药物，所述药物组合物包括药学可接受的辅料和如下的一种或多种：香柏乙酸酯(cedryl acetate)、酮异樟酮(ketoisophorone)、尼古丁(cotinine)、松油乙酸酯(bornyl acetate)、丁香酚(eugenol)、青蒿素(artesunate)、雌激素苯乙酸酯(estropipate)、黄酮酮(flavanone)、雌炔诺酮(ethisterone)。

17、本发明构建了血管平滑肌细胞特异性的短发夹核糖核酸(short hairpin rna，shrna)，筛选得到了能够有效地降低血管平滑肌细胞中nesfatin-1基因的表达水平的shrna，并验证了其在血管钙化中的作用。此外，本发明进行大规模的化合物筛选，寻找到了能够靶向抑制nesfatin-1的天然产物，并验证了其对血管钙化的预防及治疗效果。

18、本发明的优点和效果：

19、(1)本发明发现nesfatin-1表达水平在高磷处理的血管平滑肌细胞和钙化的血管中均中显著增高，且血管平滑肌细胞的钙化程度越重，nesfatin-1表达水平越高。

20、(2)本发明成功构建并筛选血管平滑肌特异性敲降nesfatin-1基因的aav-shrna干扰载体，并证实其在预防和治疗血管钙化中的作用。

21、(3)本发明筛选出可以靶向抑制nesfatin-1基因的天然产物，其中cedrylacetate对血管钙化的抑制最好，达到53.6％；其次为ethisterone、eugenol、cotinine、flavanone、ketoisophorone、artesunate、bornyl acetate和ethisterone，对血管钙化的抑制分别达到45.5％、43.8％、41.5％、41％、39.5％、34.9％、32.3％、30.8％。为预防和治疗血管钙化药物的制备提供扎实的研究基础。